菌株分離鑒定藥敏實(shí)驗(yàn)及PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)過程

1、目錄2.1菌株的分離純化1菌株的分離1菌株的純化12.2菌株的鑒定2革蘭氏染色鏡檢2菌株的生化鑒定22.3藥敏試驗(yàn)3藥物的配制3質(zhì)控4（最小抑菌濃度）實(shí)驗(yàn)42.4 CTX- M型基因的PCR擴(kuò)增模板的提取72.5 CTX- M型基因的PCR擴(kuò)增72.5.1 PCR 擴(kuò)增引物及條件7電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 2.1菌株的分離純化2.1.1菌株的分離2.1.1.1實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備1.分離管的準(zhǔn)備：本實(shí)驗(yàn)需要100個(gè)50ml離心管（1）用過的離心管，將蓋子擰開，加入清潔劑，沸水浴10min，毛刷清潔；（2）沒入加入清潔劑的水中，灌滿水，不要留有大氣泡；（3）放入超聲清潔機(jī)中超聲清潔45min，25,100

2、Hz；（4）倒出管中水，灌滿去離子水，再超聲20min，25，100 Hz；（5）倒出管中水，重復(fù)（4）一次；（6）倒出管中水，放入60烘箱中烘干；（7）待烘干后裝入保鮮袋中，扎孔通氣，再用報(bào)紙或牛皮紙包好，放入高壓鍋中高壓滅菌，121，20min；（8）高壓后取出放入烘箱中，烘干后待用。2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所選試劑的規(guī)格進(jìn)行配制，再送入高壓鍋中高壓滅菌，高壓后放入烘箱中烘干待用。注意瓶裝液體高壓前一定要蓋子擰松。3.試管的準(zhǔn)備：本實(shí)驗(yàn)需要100根試管（1）塞子拔出，與試管一起放入清潔劑水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清潔；（2）10個(gè)一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，報(bào)紙或牛皮紙包

3、好，高壓；（3）取出后烘干待用。4.LB肉湯培養(yǎng)液的準(zhǔn)備：本實(shí)驗(yàn)需要100根LB管根據(jù)所選購(gòu)商品說明配制，將配制好的LB培養(yǎng)液，分裝到100根干凈試管，每根3ml，包好后于121高壓15min，烘干待用。5.麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：按所選商品說明配制，121高壓15min，溫度稍涼后于超凈臺(tái)中倒板，待吹干后收板待用。2.1.1.2實(shí)驗(yàn)過程（1）每個(gè)分離管裝入20mlBPW；（2）三點(diǎn)取樣剪取100份待檢肉樣分裝到100個(gè)分離管中，按肉樣的標(biāo)號(hào)在分離管上標(biāo)號(hào)，放入37±1溫箱搖床上培養(yǎng)6h，200r；（3）取分離管中的菌液50L加入LB管中，標(biāo)號(hào)，37±1溫箱搖床上培養(yǎng)10-

4、12h，200r；（4）用接種環(huán)取一環(huán)菌液畫到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，標(biāo)號(hào)，37±1溫箱過夜培養(yǎng)。菌株的純化2.1.2.1實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備1.伊紅美蘭（EMB）瓊脂培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：按所選商品的規(guī)格配制，121高壓15min，溫度稍涼后于超凈臺(tái)中倒板，待吹干后收板待用。2. LB肉湯培養(yǎng)液的準(zhǔn)備：同.1.1中LB肉湯培養(yǎng)液的準(zhǔn)備。2.1.2.2實(shí)驗(yàn)過程（1）接菌：用2.5L或10L移液槍的槍頭挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落，將槍頭打到LB管中，標(biāo)號(hào)，37±1溫箱搖床上培養(yǎng)10-12h，200r；（2）劃板：用接種環(huán)取一環(huán)菌液畫到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，標(biāo)號(hào)，37±1溫箱過夜培養(yǎng)；（

5、3）用接種環(huán)挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落劃到EMB板上，標(biāo)號(hào)，37±1溫箱培養(yǎng)18-20h；2.2菌株的鑒定 革蘭氏染色鏡檢在麥康凱瓊脂上長(zhǎng)出紅色的菌落，在伊紅美蘭瓊脂上長(zhǎng)出黑色、帶金屬光澤的菌落。挑取典型菌接種于MH肉湯培養(yǎng)基，37± 1 培養(yǎng)12-24 h，取出1接種環(huán)菌液進(jìn)行固定、革蘭氏染色和鏡檢，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)和染色特點(diǎn)，將革蘭氏染色為陰性、兩端鈍圓、無(wú)芽胞、中等大小的桿菌初步判定為大腸桿菌。2.2.2菌株的生化鑒定 1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 生理鹽水、液體石蠟高壓進(jìn)行滅菌，待用。提前復(fù)活菌株，吸取30-50L甘油保存菌液于LB肉湯，搖床培養(yǎng)3-5h（時(shí)間因菌株活性不同做適當(dāng)調(diào)

6、整，此步主要是保證菌株全部復(fù)活）。純化菌株：將LB肉湯復(fù)活的菌株接種到麥康凱板，37過夜培養(yǎng)，18-24h。要求所有受試菌株必須是單一的菌落形態(tài)而且有單個(gè)菌落存在。2.實(shí)驗(yàn)過程（1）接種前準(zhǔn)備安瓿瓶：從包裝盒中取出安瓿瓶，朝易折點(diǎn)(瓶頸上藍(lán)點(diǎn))反方向用力折開安瓿瓶，或用砂輪劃一圈安瓿瓶瓶頸處，然后用力掰開安瓿瓶，插入安瓿瓶架或雙面板中。試管：從包裝盒中取出試管，插入試管架中。注：如果染菌或變色，則不能使用，重新拿一支。折開安瓿瓶時(shí)最好包裹紗布，以免劃傷手指。 （2）接種方法直接接種：用接種針從平板上挑取已純化分離的菌落接種于需要試驗(yàn)的安瓿瓶（試管）中。 菌懸液法：取一內(nèi)盛有2ml無(wú)菌水試管，用

7、接種針從平板上挑取已純化單個(gè)菌落至無(wú)菌水中仔細(xì)研磨制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木患?xì)菌懸液，滴入需要試驗(yàn)的試管（安瓿瓶）中，每管3滴。 注：如內(nèi)容物為半固體或半固體生化管，采取直接穿刺接種。 （3）接種完后用封口膜封口放于37±1培養(yǎng)箱中培養(yǎng)或根據(jù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的培養(yǎng)溫度進(jìn)行培養(yǎng)。注意，腸桿菌科葡萄糖鑒定管接菌后封口，倒放置進(jìn)行培養(yǎng)；氨基酸類的要先用石蠟封口。(4) 讀生化鑒定的結(jié)果，根據(jù)腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)查找到菌株的菌名以及陽(yáng)性機(jī)率。生化反應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1，其中蛋白胨水需加靛基質(zhì)溶液，苯丙氨酸需加三氯化鐵溶液，之后觀察顏色變化。葡萄糖產(chǎn)酸為陽(yáng)性變成黃色標(biāo)記A，不產(chǎn)酸則為陰性顏色不

8、變，產(chǎn)氣則標(biāo)記G，即產(chǎn)酸產(chǎn)氣標(biāo)記為AG，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣標(biāo)記為A，產(chǎn)氣不產(chǎn)酸標(biāo)記為G。表1 腸桿菌科細(xì)菌生化反應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果葡萄糖賴氨酸鳥氨酸硫化氫蛋白胨水乳糖衛(wèi)茅醇苯丙氨酸尿素枸櫞酸鹽陰性紫色黃色黃色無(wú)色無(wú)色紫色紫色無(wú)色黃色綠色陽(yáng)性黃色紫紅紫紅灰褐紅色黃色黃色綠色環(huán)紅色藍(lán)色經(jīng)生化反應(yīng)鑒定為大腸桿菌者，用大接種環(huán)在接有分離純化菌株的LB瓊脂平板上輕輕刮取菌落，接到含1 mL 30%甘油肉湯的EP管中；放于-20 冰箱中保存，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。如要長(zhǎng)久保存，可用磁珠式菌種保藏管于-80 冰箱中保存菌株。2.3藥敏試驗(yàn)2.3.1藥物的配制2.3.1.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.儲(chǔ)藥管的準(zhǔn)備：用50ml離心管做為儲(chǔ)藥管，

9、其準(zhǔn)備過程同.1.1中分離管的準(zhǔn)備。2.慮管的準(zhǔn)備：慮管用保鮮膜包好后放于燒杯中，報(bào)紙或牛皮紙封口，于121高壓20min，烘干待用。2.3.1.2實(shí)驗(yàn)過程本實(shí)驗(yàn)所用藥品需要配制成濃度為5120g /mL，體積40 mL。（1）稱藥：根據(jù)所購(gòu)藥品的包裝上的濃度計(jì)算所要稱量的藥品量。如果包裝上沒有注明藥品濃度可根據(jù) 瓶裝藥品按5120×40/90% = 0.2276 g 稱??； 袋裝藥品按5120×40/95% = 0.2156 g 稱取。（2）溶解藥品：根據(jù)每種藥品的溶解方法來溶解以及定容稱量好的藥品；如氨芐西林（AMP）用超純水溶解即可，然后定容到40ml；氯霉素（CHL

10、）用95%的乙醇溶解后，定容到40ml；環(huán)丙沙星（CIP）用10%的醋酸溶解后，定容到40ml。表2 抗菌藥物的質(zhì)控范圍及稀釋濃度梯度抗菌藥物溶劑質(zhì)控范圍稀釋濃度梯度氨芐西林AMP超純水2-80.5-512頭孢噻呋CTFPBS+PBC0.25-10.125-512頭孢噻肟CTX超純水0.008-512頭孢他啶CTZ超純水0.03-512頭孢曲松CTR超純水0.008-512頭孢西丁CXT超純水2-80.25-512慶大霉素GEN超純水0.25-10.25-512卡那霉素KAN超純水1-40.5-512四環(huán)素TET超純水0.5-20.25-512環(huán)丙沙星CIP10%醋酸+超純水0.004-512

11、恩諾沙星ENR超純水0.004-512萘啶酸NAL1mol NaOH +超純水1-40.25-512鏈霉素STR超純水2-80.5-1024阿米卡星AMI二甲基甲酰胺（DMF）+PBS0.5-40.25-512氟苯尼考FLF95%乙醇0.5-512氯霉素CHL95%乙醇+超純水2-160.125-512喹乙醇OQX超純水0.25-512（3）濾藥：在無(wú)菌的條件下進(jìn)行，將高壓過的離心管、濾管，注射器，平皿，標(biāo)簽紙，鑷子等在無(wú)菌超凈臺(tái)中紫外照射15min； 將配好的藥液倒入平皿中，注射器抽取，用鑷子在火焰上滅菌后夾取濾管的粗管處，安裝到注射器上； 注入到高壓過的儲(chǔ)藥管中； 用鑷子將濾管取下，再抽取

12、藥液重復(fù)，直至藥液完全濾完；過濾另一種藥液時(shí)，要將平皿、注射器、濾管全部換新，不可重復(fù)用； 貼標(biāo)簽：要注明藥品名稱、濃度、配制時(shí)間；如 AMP 5120 g /mL 2013.4.2。放于20 冰箱中，可保存半年之久。2.3.2質(zhì)控2.3.2.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備MH肉湯培養(yǎng)液按其商品說明進(jìn)行配制，配制好后于121高壓20min，放于超凈臺(tái)中待用。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922, 購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。2.3.2.2實(shí)驗(yàn)過程（1）復(fù)活大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌（ATCC25922）：取大腸桿菌ATCC25922接入LB肉湯試管中37 ± 1 溫箱搖床中培養(yǎng)3-4h；（2）計(jì)算初始濃度：根據(jù)藥品的質(zhì)控

13、計(jì)算出第一孔所要稀釋的濃度；（3）第一孔中加入180LMH肉湯，其余用排槍每孔加100LMH肉湯，；（4）藥液的稀釋：用去離子水或MH肉湯稀釋，初始濃度 = 512/（n + 2）以2L藥液為初量進(jìn)行稀釋，n為稀釋藥液所加MH肉湯的量；n:2即為藥品稀釋的倍數(shù)。（5）加藥液：取出稀釋的藥液20L加入第一孔；每種藥物做兩行，96孔板的最后一行不加藥液也不加菌液，作為陰性對(duì)照。（6）倍比稀釋：取第一孔100L液體移加到第二孔，從第二孔開始倍比稀釋，最后一孔吸取100L棄去。（7）加菌液：用排槍除最后一排外每孔加100L菌液；（8）蓋好96孔板，放于37±1溫箱搖床中培養(yǎng)10-12h；（9

14、）讀取結(jié)果。2.3.3MIC（最小抑菌濃度）實(shí)驗(yàn)參照2012版CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute，臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所 ）指導(dǎo)原則和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，用瓊脂二倍稀釋法，測(cè)定63株大腸桿菌對(duì)17種常用抗菌藥物的敏感性。用二倍稀釋法把各種藥物稀釋到所需的各個(gè)濃度梯度，分別定量加入高壓滅菌過的MH 瓊脂在平皿中輕輕搖晃使之混合均勻，冷卻凝固，制成含所需藥物濃度的瓊脂平板。把稀釋至含菌量約為1. 0 × 106 CFU/mL 的菌液用微量多點(diǎn)接種儀接種到MH 瓊脂平板上，于37 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 18 h 后觀察結(jié)果。以完全不見細(xì)菌生

15、長(zhǎng)的最低藥物濃度為該藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度( Minimal inhibitory concentration，MIC) 。2.3.3.1實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備MH瓊脂、MH肉湯培養(yǎng)液分別按其商品說明進(jìn)行配制，121高壓20min；20ml移液管兩支包好于121高壓20min,烘干后待用；去離子水裝入瓶中于121高壓20min，待用；章用牛皮紙或報(bào)紙包好后于121高壓20min，烘干待用。2.3.3.2實(shí)驗(yàn)過程第一天1.復(fù)活菌株：吸取30-50L甘油保存菌液于到LB肉湯，搖床培養(yǎng)3-5h（時(shí)間因菌株活性不同做適當(dāng)調(diào)整，此步主要是保證菌株全部復(fù)活）。復(fù)活的菌株包括47種受試離菌株和1株質(zhì)控菌株。不同的菌種

16、的質(zhì)控菌株是不一樣的，參照CLSI上選取合適的質(zhì)控菌株。2.純化菌株：將LB肉湯復(fù)活的菌株接種到麥康凱板，37過夜培養(yǎng)， 18-24h。（所有受試菌株必須是單一的菌落形態(tài)而且有單個(gè)菌落存在）3.準(zhǔn)備無(wú)菌室中過夜紫外照的物品：（1）高壓滅菌過的移液管（20或25ml，至少兩支）；（2）過夜泡酸并清洗過的96孔板（至少兩塊），烘干后，過夜照；（3）稀釋藥用的去離子水（已高壓），MH肉湯（已高壓，稀釋菌液用）；（4）1ml槍頭，1ml槍，高壓過的章（接種儀）；（5）酒精燈，酒精棉，口罩，實(shí)驗(yàn)服，記號(hào)筆，打火機(jī)，帶有濃度稀釋梯度的紙；（6）一次性平皿（藥物及濃度均標(biāo)記好）。4. 根據(jù)CLSI上每種藥物

17、的質(zhì)控范圍和耐藥臨界值來確定的藥物的濃度梯度，大到應(yīng)該設(shè)置到耐藥臨界值上的1-2個(gè)梯度，小到應(yīng)該設(shè)置到包括質(zhì)控范圍內(nèi)的1-2個(gè)濃度或設(shè)置到質(zhì)控范圍的最小值下一個(gè)梯度，計(jì)算每種藥物所需的一次性平皿個(gè)數(shù)，計(jì)算時(shí)要各加一個(gè)空白板。5.準(zhǔn)備足量的的MH瓊脂（20ml/平皿），壓好后置于60烘箱。不要過早進(jìn)行高壓，要保證瓊脂的新鮮度。第二天1.將無(wú)菌室調(diào)至抽濕模式至少30min，一人在超凈臺(tái)接菌，挑單個(gè)菌落至MH肉湯中，搖床培養(yǎng)3-5h；一人在無(wú)菌室寫板，稀釋藥液。2.寫板時(shí)，在平皿底部一端寫出每種藥的稀釋度。若同時(shí)做兩個(gè)組份時(shí)，則應(yīng)用不同顏色標(biāo)記區(qū)分開；板上必須寫清藥名、濃度梯度。3.除512、256

18、外，余下的濃度中各加入1ml水；需注意鏈霉素（STR）中，除1024外均加入1ml水。此時(shí)，要檢查有無(wú)漏寫的濃度；注意整個(gè)過程需在酒精燈附近操作。4.濃度編號(hào)為 512、256、128，均加1ml原藥，從128開始倍比稀釋，最后一板棄去1ml。注意，此處根據(jù)自己設(shè)定的濃度，應(yīng)有所變化，一般是依照自己所要設(shè)定的板上濃度、原藥濃度、最后加入瓊脂的體積來計(jì)算；且整個(gè)過程需在酒精燈附近操作。5.加瓊脂：512的藥板加9ml，其余加19ml，邊加邊搖晃，藥物均勻散在瓊脂板中，自然吹干；鏈霉素（STR）中均加19ml瓊脂。注意，瓊脂應(yīng)當(dāng)是冷卻到50-60即不燙手背時(shí)再加入，以免溫度過高會(huì)破壞藥物的活性；混

19、勻時(shí)，動(dòng)作要輕而快，要充分混合均勻，保證藥物均勻分布到瓊脂中。6.收板：待平皿蓋上無(wú)水汽或有較少水汽時(shí)，從大濃度到小濃度收板即收好后每種藥物的小濃度板置于最上面，正放。7.稀釋菌液：超凈臺(tái)中酒精燈附近進(jìn)行操作（6行8排），菌液濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷釙r(shí)，按1：100的比例將各菌液濃度稀釋到1×106CFUmL-1 ；并記錄96孔板上各菌株的順序。注意，所用96孔板，必須是打開蓋子過夜照過紫外或是新的已經(jīng)滅過菌的；若菌液濃度不同，應(yīng)當(dāng)有所調(diào)整；吸取不同的菌液時(shí)，要換槍頭。8.接種細(xì)菌（又稱蓋章）：酒精燈旁，把接種儀放入96孔板中，先上下抽取混勻后，由低濃度至高濃度開始蓋，每次蓋三塊板，最高

20、濃度后換下一種藥物時(shí)，加蓋空白板，從而緩沖前面藥物的高濃度對(duì)下一個(gè)藥物的低濃度的影響。9.蓋好后，約半個(gè)小時(shí)，等菌液全部吸收好后，將其倒置于37±1培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18 h。10.處理實(shí)驗(yàn)用過的物品（煮章、煮菌液、移液管），洗凈后，包好，高壓，待下次用。第三天1.讀板將平板置于暗色、無(wú)反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，空白對(duì)照板上菌株應(yīng)該是生長(zhǎng)良好且無(wú)污染時(shí)，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。以三個(gè)或三個(gè)以下小型單菌落或出現(xiàn)了云霧狀的薄層菌落，為判斷為抑制生長(zhǎng)。如果出現(xiàn)有3個(gè)以上菌落生長(zhǎng)于含藥濃度高于終點(diǎn)水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長(zhǎng)而高濃度藥物瓊脂平板上生長(zhǎng)現(xiàn)象，則應(yīng)

21、檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗(yàn)。2.在Excel表中輸入實(shí)驗(yàn)結(jié)果；煮板。注：1.進(jìn)無(wú)菌室首先帶上口罩，酒精棉擦手滅菌。 2.盡量少說話，避免雜菌污染。 3.加瓊脂時(shí)，要在酒精燈附近操作，注意看好移液管量程，以防加錯(cuò)。另外要防止加瓊脂時(shí)瓶中瓊脂溫度過低，使得平板中瓊脂有凝塊而造成藥液不能均勻分布。所以，有凝塊的瓊脂不要使用。 4.建議在做一批菌株時(shí)，先做一個(gè)平行，只要這個(gè)結(jié)果中的質(zhì)控菌株對(duì)藥物的敏感性在質(zhì)控范圍內(nèi)，那么這次結(jié)果即有效，不用再做第二個(gè)平行；如不能滿足上述條件，那么將不滿足條件的藥物再重新做。5.實(shí)驗(yàn)中所用的菌液必須是新鮮的，不能使用已經(jīng)放置過很久的菌株。6.實(shí)驗(yàn)中，要時(shí)刻記住無(wú)菌操作，避

22、免污染。2.3.3.3細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照2010版CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute，臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所 ）指導(dǎo)原則和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，用瓊脂二倍稀釋法，測(cè)定63株大腸埃希菌對(duì)18 種常用抗菌藥物的敏感性。以敏感、中介、耐藥3種形式對(duì)MIC大小作出解釋, 判定標(biāo)準(zhǔn)如表3所示。表3 大腸桿菌耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物Antibacterial agentsMIC解釋標(biāo)準(zhǔn)（g/mL）S（Susceptive）I（Intermediate）R（Drug resistant）氨芐西林AMP 81632頭孢噻呋CTF*81632頭孢噻肟CTX1

23、24頭孢他啶CTZ4816頭孢曲松CTR124頭孢西丁CXT81632慶大霉素GEN4816卡那霉素KAN163264四環(huán)素TET4816環(huán)丙沙星CIP0.061恩諾沙星ENR*-2萘啶酸NAL16-32鏈霉素STR*-64阿米卡星AMI163264氟苯尼考FLF*-32氯霉素CHL81632喹乙醇OQX*-64注：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，頭孢噻呋(CTF)的耐藥轉(zhuǎn)折點(diǎn)為8 g/mL；氟苯尼考(FLF) 的耐藥轉(zhuǎn)折點(diǎn)32 g/mL ；恩諾沙星(ENR)的耐藥轉(zhuǎn)折點(diǎn)為2 g/mL；鏈霉素(STR)的耐藥轉(zhuǎn)折點(diǎn)為64 g/mL 10。喹乙醇(OQX) 的耐藥轉(zhuǎn)折點(diǎn)為64 g/mL 20。CLSI根據(jù)細(xì)菌學(xué)、

24、藥動(dòng)學(xué)和臨床資料設(shè)定并定期修訂抗生素對(duì)不同細(xì)菌敏感折點(diǎn)，通過折點(diǎn)將細(xì)菌分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。敏感（S）指被測(cè)菌株能被使用推薦劑量在感染部位通?？蛇_(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制。中介（I）指抗菌藥物最低抑菌濃度MIC接近血液和組織中通?？七_(dá)到的濃度，療效低于敏感菌。還表示藥物在生理濃集的部位具有臨床效力（如尿液中的喹諾酮類和-內(nèi)酰胺類）。另外，中介還作為緩沖區(qū)，以防止微笑的技術(shù)因素失控導(dǎo)致較大的錯(cuò)誤結(jié)果，特別是對(duì)那些藥物毒性范圍窄的藥物。耐藥（R）指被測(cè)菌株不能被常用劑量抗菌藥物所抑制，和/或抑菌環(huán)直徑落在某些特定的微生物耐藥機(jī)制范圍（如-內(nèi)酰胺酶），臨床療效不可靠。2.4 CTX- M型基因的PCR擴(kuò)增模板的提取（1）將LB管中的菌液倒入1.5mlEP管中，標(biāo)號(hào)，離心，13000r，5min；（2）倒掉上清液，再將LB管剩