(暨實驗方劑學改革探討)

1、蛋白質(zhì)組學-方證研究的新思路（暨實驗方劑學改革探討）沈蕓上海中醫(yī)藥大學（上海 201203）關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學 方證 一蛋白質(zhì)組學的發(fā)展和應用 分子生物學在最近20 年中經(jīng)歷了革命性的發(fā)展,目前已有50 多種生物的基因組序列被測定完畢,生命科學的研已有50 多種生物的基因組序列被測定完畢,生命科學的研列還不能了解基因的全部內(nèi)含,只有直接研究蛋白質(zhì)在特定條件下的表達情況,才能更深入地了解蛋白質(zhì)的表達、分布、加工修飾及相互作用等信息,也才能更深入地了解各種生命現(xiàn)象的機制。同時，基因組的研究已經(jīng)極大的促進了疾病機制的研究及藥物的研究與開發(fā), 基因治療及基因工程藥物在近幾年內(nèi)得到了飛速發(fā)展,但疾病的發(fā)

2、生及治療主要發(fā)生在蛋白質(zhì)水平,僅僅依據(jù)基因的信息在很多時候還不能有效的開發(fā)新型藥物和完全解釋藥物在生物體內(nèi)的作用機制,研究細胞中蛋白質(zhì)的表達不僅有助于藥物的開發(fā)及疾病的治療，。 1994 年澳大利亞的Wilkins 和Williams 首先提出了蛋白質(zhì)組(proteome) 的概念:即基因組表達的全部蛋白質(zhì),或指細胞、組織或機體在特定時間和空間所表達的所有蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)表達隨機體生理狀態(tài)的改變而改變,細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組應該是動態(tài)的。比較患病細胞與正常細胞中蛋白質(zhì)的表達變化,或者比較患病細胞與藥物處理后的細胞中蛋白，的表達變化,有可能發(fā)現(xiàn)一些新的藥物靶點及藥物。在隨后的幾年中,蛋白質(zhì)組學在疾病

3、機制的研究及藥物開發(fā)中將占有越來越重要的作用。在新藥研究中，蛋白質(zhì)組學可以提供細胞或組織中蛋白質(zhì)的表達豐度,通過比較病態(tài)與正常態(tài)時細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達的差異,有可能找到有效的藥物或者是藥物靶點。同時，通過比較正常細胞、病態(tài)細胞及藥物處理后的病態(tài)細胞的蛋白表達豐度的變化,也可以分析藥物候選者的潛在作用。例如,應用二維凝膠電泳技術(shù)分析調(diào)血脂藥物洛伐他汀作用后的蛋白質(zhì)表達結(jié)果,表明洛伐他汀影響了與膽固醇代謝相關(guān)的一些蛋白質(zhì)的表達，從而更加明確其藥理作用。蛋白質(zhì)組學的另一應用就是研究藥物的毒理作用。比較正常細胞與藥物處理后細胞的蛋白質(zhì)表達豐度變化可以提示藥物的毒性作用機制。Steiner 等利用二維凝膠電

4、泳研究了環(huán)孢素A(cyclosporin A CsA) 對小鼠腎臟的毒性。比較正常狀態(tài)與CsA 作用后的腎臟蛋白的二維凝膠圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在CsA 作用后的腎臟蛋白二維凝膠圖譜中發(fā)現(xiàn)了一個特異蛋白質(zhì),經(jīng)鑒定為鈣結(jié)合蛋白(calbindin) ,這種蛋白質(zhì)存在于腎小管中,參與鈣離子的結(jié)合及轉(zhuǎn)運?，F(xiàn)在已經(jīng)證明CsA 的毒性在于與小管內(nèi)鈣化有關(guān),而導致鈣結(jié)合蛋白不能降解。 蛋白質(zhì)組的研究流程大體可分為分離、鑒定、分析三步。即先從組織或細胞中提取蛋白質(zhì),進行雙向電泳以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離;然后進行蛋白質(zhì)樣品顯色,切下待分析的蛋白質(zhì)斑點,用胰蛋白酶膠內(nèi)消化;接著,對消化后得到的多肽片段進行生物質(zhì)譜分析測定,

5、得到肽質(zhì)量指紋圖譜;最后,數(shù)據(jù)庫檢索對蛋白質(zhì)進行鑒定及功能分析。涉及到雙向凝膠電脈、質(zhì)譜和生物信息學的應用。二將蛋白質(zhì)組學運用于方證研究和實驗方劑學目前，中醫(yī)藥的客觀化/現(xiàn)代化是中醫(yī)藥能否走向國際，能否作到國際化的瓶頸問題之一。運用的現(xiàn)代科學的研究手段驗證和闡明方劑的配伍原則和作用原理，探討方證的關(guān)系亦是十分重要的課題。中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進程已經(jīng)走了進20年，其中有經(jīng)驗也有教訓，但客觀的說，作為一門學科，它越來越成熟了。不僅能更快更好地運用最新的科技手段和方法，同時重要的是，能理性地，客觀地使用這些研究方法，將中醫(yī)辨證論治的思維精髓用于研究的指導思想中，真正作到科學運用?！白C”是中醫(yī)辨證的基礎，也

6、是中醫(yī)的精華所在，而方劑則是臨床辨證論治的產(chǎn)物，任何一首方劑的產(chǎn)生都是以辨證為依據(jù)的，是針對具體病證作出的針對性治療用藥方案。中醫(yī)的證候是疾病過程中某一階段機體對內(nèi)外致病因素的綜合反應,在宏觀上表現(xiàn)為特定的癥狀、體征及舌脈的組合;證候具有整體性,包括了體質(zhì)特征、臟腑經(jīng)絡氣血、陰陽等的失衡及相互間的關(guān)系,它反映了疾病的病因、病機及正邪斗爭的概括和趨勢;證候具有時相性,即動態(tài)變化的特點。中醫(yī)學非常重視人體的統(tǒng)一性和完整性及其與自然界的相互關(guān)系。構(gòu)成人體的各個組成部分之間,在結(jié)構(gòu)上是不可分割的,在功能上是相互協(xié)調(diào)、相互為用的,在病理上是相影響的。中醫(yī)的證候是宏觀、綜合性的全身評價,同時又是復雜的。證

7、候的這個特點大大增加了研究的難度與復雜性。目前的部分研究結(jié)果認為，中醫(yī)證本質(zhì)的含義是指引起證發(fā)生發(fā)展的物質(zhì)基礎，這些物質(zhì)決定著證的發(fā)生發(fā)展的動態(tài)變化過程，是在證的發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生的特殊物質(zhì)（群）。這其實是一個相當含糊的解釋，難免給研究者帶來困惑。利用方證相應/方證結(jié)合的方法不僅為尋找證的物質(zhì)基礎帶來新的研究途徑，也為多層面闡釋方劑作用原理提供了客觀介質(zhì)。但由于中藥方劑一般由多味中藥組成，其組成成分復雜，藥理作用又是多靶點，多環(huán)節(jié)，多層次的整體性調(diào)節(jié)方式，對機體各個組織器官都有著廣泛的調(diào)節(jié)作用。雖然知道方劑進入體內(nèi)發(fā)揮其藥理作用過程所糾正的物質(zhì)應是存在于機體個組織器官的蛋白質(zhì)，但由于其中存在藥

8、物分子與生物體內(nèi)蛋白質(zhì)復雜的直接或間接的相互作用，以往的蛋白質(zhì)研究技術(shù)確實很難加以研究，而蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)的出現(xiàn)為方證客觀化研究提供了一個可操作的平臺。有學者提出“證候基因組學(zhenghou genomics) ”、“證候蛋白質(zhì)組學( zhenghou pro teomics) ”,試圖在分子水平描繪中醫(yī)證候本質(zhì)的全貌。利用蛋白質(zhì)組的雙向凝膠電泳，能有效分離蛋白質(zhì)，其第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離, 第二向則按分子量的不同用SDS PAGE 分離,把復雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開?，F(xiàn)在, 雙向凝膠電泳的一塊膠板(16cm ×20cm) 可分出3 , 000

9、4 ,000 個、甚至10 ,000 個可檢測的蛋白斑點。換句話說，它可以同時分辨生物體的某一組織或細胞中的上萬種蛋白。同時利用的質(zhì)譜技術(shù)快速而準確地鑒定出這些蛋白質(zhì)。 根據(jù)以上技術(shù)，有人方證研究提出這樣的研究路線，根據(jù)方證相應的原理，首先制造出某一證候的動物模型，給該證候的模型相應的經(jīng)典方劑治療后，利用蛋白質(zhì)組學的方法觀察相關(guān)組織的表達差異蛋白。將不同狀態(tài)下不同動物的雙向電泳圖譜相互比較，得到的表達差異蛋白的信息可以提示：1.證本質(zhì)蛋白質(zhì)，即機體在出現(xiàn)該證時異常表達的蛋白；2. 中藥和造摸方法造成的異常表達蛋白；3.中藥方劑作用后表達的蛋白；這樣的的話，不僅能同時觀察機體在出現(xiàn)某證時復雜的蛋

10、白變化，還能排除實驗操作時由于造模藥物和中藥不良反應引起的表達差異蛋白質(zhì)，從而是結(jié)果更客觀，更可靠。實時多層面，多角度的觀察機體蛋白質(zhì)變化，對于方劑復雜的作用靶點來說，顯得更實效。以往的方劑作用機制實驗利用Weston技術(shù)，每塊膠一次觀察少數(shù)幾個蛋白的變化，為了全面闡釋復方作用機理，往往需要多次重復不同的實驗以得到所需數(shù)據(jù)。將蛋白質(zhì)組的多系統(tǒng)研究方法運用于實驗方劑學的意義和優(yōu)勢也在于此，作為一項新技術(shù)，它能帶給學生更多的知識和信息，同時激發(fā)學生更濃厚的研究興趣，充分培養(yǎng)其動手能力。一個完整的方證研究/蛋白質(zhì)組學實驗對于準確揭示方劑對機體產(chǎn)生的作用和作用機理是幾個類似的簡單的方劑學實驗都不能達到的。三存在的問題和解決辦法由于蛋白質(zhì)組學研究對實驗室和研究人員的要求較高，同時其實驗試劑和相應的質(zhì)譜技術(shù)較為昂貴，需要大量的資金支持才能開展和保證正常運轉(zhuǎn)。所以蛋白質(zhì)組學在方證研究中的應用難以在各個高等院校普遍開展。同時由于該技術(shù)開展的時間并不長，勢必在研究過程中存在重復性和穩(wěn)定性的問題，而對于方證體系這樣一個多系統(tǒng)，多器官并處于動態(tài)變化過程中的體系，怎樣運用蛋白質(zhì)組學深入闡釋，確實任重道遠。但中醫(yī)藥研究需要發(fā)展，需要運用一些可能現(xiàn)代科技手段，以揭示其奧妙的內(nèi)在機理，