原位雜交操作流程

1、原位雜交操作流程原位雜交操作流程冰凍切片的（冰凍切片的（DIG-labeled RNA probe）原位雜交操作程序）原位雜交操作程序一、一、 切片制備切片制備用新鮮組織制作用新鮮組織制作6m厚冰凍切片，厚冰凍切片，37干燥干燥14小時(shí)，進(jìn)行下一步操作。小時(shí)，進(jìn)行下一步操作。二、二、 預(yù)雜交前處理預(yù)雜交前處理預(yù)固定預(yù)固定：4%PFA（in DEPC-PBS Ph7.4）RT 3060min 4%PFA：多聚甲醛多聚甲醛 20g 1PBS 450ml 加熱（加熱（60、20min）溶解）溶解 冷卻后調(diào)冷卻后調(diào)pH至至7.4 1PBS 500mlPBS RT 5 min2 10PBS：500ml

2、NaCl 40g KCl 1g KH2PO4 1g Na2HPO4 7.7g DEPC水水 450ml 調(diào)調(diào)Ph至至7.5 DEPC水加至水加至500mlPBS(含含0.3%v/vTritonX-100) RT 15 min 臨用前配制臨用前配制 10%TritonX-100 15ml 1PBS 500ml PBS RT 5min 2消化消化： 2g/mlProteinase K in TE buffer 37 10 min TE： pH8.0 Tris-HCl 1M 5ml pH8.0 EDTA 0.5M 1ml DEPC水水 500ml 0.2%Glycin in PBS RT 5 min

3、2 (50 xDenharts; Ficoll 400 聚蔗糖聚蔗糖 1g 后固定后固定：4%PFA in PBS RT 15 min PVP 聚乙烯基吡咯烷酮聚乙烯基吡咯烷酮 1g BSA 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 1g DEPC 水水 100ml） PBS RT 3 min2 0.1 M 三乙醇胺（三乙醇胺（TEA）/0.25%乙酸酐乙酸酐 RT 5 min2 0.1M 三乙醇胺三乙醇胺：三乙醇胺：三乙醇胺 2.64ml DEPC水水 200ml 用前加入乙酸酐用前加入乙酸酐 500lPBS RT 5 min2三、三、 預(yù)雜交預(yù)雜交 預(yù)雜交預(yù)雜交 50 2h 預(yù)雜交液：預(yù)雜交液： 50%去

4、離子甲酰胺去離子甲酰胺 5SSC 5Denhardts 0.02%SDS 0.1mg/mltRNA四、四、 雜交雜交雜交雜交 50 12h以上以上 五、五、 雜交后處理雜交后處理2SSC脫去蓋膜（片）脫去蓋膜（片） 502SSC清洗清洗 37 10 min2 20g/mlRNaseA in Rnsae buffer 37 30 min Rnsae buffer;2M Tris 5ml 0.25MEDTA 4ml 3MnaCl 167ml pH8.0 D W 1000ml Rnase buffer 37 30 min 2SSC 50 15 min2 1SSC（含（含0.02%SDS）37 15

5、min2 5%SDS 2ml 1SSC 500ml 0.1SSC 37 15 min2 Buffer 37 10 min2 Buffer: 2M Tris-HCl Ph7.6 25ml 3M NaCl 25ml D.W. 500ml封閉；封閉；0.5%抗體阻斷液抗體阻斷液 in Buffer（含（含0.2%Tween20） 37 20 min 抗體阻斷液抗體阻斷液 : (1:500抗地高辛抗體抗地高辛抗體 in 阻斷液阻斷液 37 2 h) 阻斷劑阻斷劑 1g Tween-20 0.4ml Buffer 37 10 min2 Buffer 200ml Buffer 37 10 min2 顯色；

6、顯色； Buffer: 2M Tris 10ml（1:50NBT/BCIP Stock Solution in Buffer 224h） 3M NaCl 6.67ml MgCl2 2.033g（濕合、避光）（濕合、避光） D.W. 180ml 濃濃HCl調(diào)調(diào)pH至至9.5 D.W. 200ml終止反應(yīng)：終止反應(yīng)： Buffer RT 5min2 流水沖洗流水沖洗 5-10min 1%甲基綠復(fù)染甲基綠復(fù)染3-10min， 水洗，晾干，封固水洗，晾干，封固DNA探針檢測(cè)石蠟切片中DNA組織標(biāo)本 肝穿刺組織，常規(guī)石蠟包埋，4m連續(xù)石蠟切片，貼在涂有切片粘合劑的干凈載玻片上，58烤18h。試劑試劑1

7、12020SSCSSC2 2HBV cDNA-DigHBV cDNA-Dig探針探針 5 5 g g3 34 4多聚甲醛多聚甲醛4 40.1mol/L PBS0.1mol/L PBS，pH7.4pH7.45 50.2mmol/L HCl 0.2mmol/L HCl 和和0.1mol/L0.1mol/L甘氨酸甘氨酸 PBS pH7.4PBS pH7.46 60.4 0.4 Tritor X-100 PBS pH7.4Tritor X-100 PBS pH7.47 7蛋白酶蛋白酶 20 20 g/mlg/ml8 80.250.25乙酸酐，用乙酸酐，用0.1mol/L0.1mol/L三乙醇胺配制三乙

8、醇胺配制9 9預(yù)雜交緩沖液和雜交緩沖液預(yù)雜交緩沖液和雜交緩沖液10. AKP10. AKP標(biāo)記抗標(biāo)記抗Dig FabDig Fab段二抗，可段二抗，可1:5001:500稀釋稀釋11. TSM11. TSM、TSM2TSM2（配制參閱附錄（配制參閱附錄4 4）12. NBT12. NBT和和BCIPBCIP顯色液或用顯色液或用AKPAKP顯色顯色KitKit 操作流程 雜交前處理 預(yù)雜交 雜交 雜交后漂洗 雜交后檢測(cè) 結(jié)果判斷雜交前處理1. 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水2. 0.02M pH7.4 PBS洗33min3. 0.2M HCI 20min 室溫 （除去蛋白）4. 2SSC（內(nèi)含5M EDT

9、A） 50 洗 30min5. 蛋白酶 2g/ml 37 20min6. 0.1M甘氨酸PBS洗 10min 室溫，中止酶反應(yīng)7. 4多聚甲醛，20min 室溫8. PBS洗 33min9. 75，85，95和無水乙醇各2min預(yù)雜交和雜交 加預(yù)雜交液 20l/每片，42 2h。 加雜交液1020ul/每片（內(nèi)含HBV-cDNA Dig標(biāo)記探針4g/ml），加蓋硅化玻片，將切片置于95 10min，使探針和靶病毒DNA雙鏈打開（變性），然后迅速置于冰上5min，再將切片置于盛有2SSC濕合內(nèi)，42雜交過夜(1216h)。雜交后漂洗雜交后漂洗1. 將切片置于2SSC液內(nèi)振動(dòng)移去蓋片2. 2SSC

10、洗 210min， 553. 0.5SSC 25min， 504. PBS洗33min5. 10醋酸 20min 室溫，阻斷內(nèi)源性堿性磷酸酶6. PBS洗33min信號(hào)放大和顯示信號(hào)放大和顯示1. 1:500稀釋AKP標(biāo)記抗Dig二抗，37 4h，或4過夜2. PBS洗 33min3. TSM1洗 25min4. TSM2洗 25min5.顯色液 在1mlTSM2中加入4.5lNBT，3.5l， BCIP 混合后，顯色30min12h，中間不斷觀察6. TSM2洗，PBS洗33min，核固紅或甲基綠襯染7. 蒸鎦水洗，系列乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片結(jié)果判斷結(jié)果判斷ISHISH流程流程 探針

11、合成探針合成 組織細(xì)胞標(biāo)本的準(zhǔn)備組織細(xì)胞標(biāo)本的準(zhǔn)備 ISHISH試劑的配制試劑的配制 操作流程操作流程探探 針針 1、根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道合成PCR引物一對(duì)。 2、PCR擴(kuò)增：用高保真DNA聚合酶 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 3、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆入pGEM2Z質(zhì)粒（EcoRI和ACC I酶切位點(diǎn)），在大腸桿菌中擴(kuò)增，純化。原理：PGEM3質(zhì)粒購(gòu)于promega公司，含有位于pUc19 MCS側(cè)面的SP6和T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，在將所需序列插入MCS后，一個(gè)簡(jiǎn)單的基于lac Z -肽滅活的顏色選擇方案將促進(jìn)重組體的篩選。在體外，將SP6或T7 RNA聚合酶加入到含有標(biāo)記物的三磷酸核苷前體的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，可

12、允許從任何一方向產(chǎn)生多拷貝DNA插入序列的標(biāo)記RNA探針。 4、 利用Roche生產(chǎn)的體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNA kit（Cat.No 999644）操作流程參閱原位檢測(cè)技術(shù)p132-133。 組織細(xì)胞標(biāo)本的準(zhǔn)備組織細(xì)胞標(biāo)本的準(zhǔn)備 ISHISH試劑的配制（所有試劑和用具試劑的配制（所有試劑和用具均用均用DEPCDEPC水處理）水處理）操作流程操作流程1 1、活細(xì)胞經(jīng)4多聚甲醛固定20min，室溫，PBS洗，系列乙醇脫水。2、組織標(biāo)本：標(biāo)準(zhǔn)取材后，4多聚甲醛固定6h，用25遮糖或液氮速凍，切片貼在涂有APES膠的干凈載玻片上。3、PBS洗33min，冰凍切用4%檸檬酸鹽90保溫20min，石蠟切片98

13、10min，細(xì)胞片不用。4、2g/ml蛋白酶K 37 20min，PBS洗33min。5、0.1mol/L甘氨酸PBS洗10min.6、0.25%乙酸酐的0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)洗10min，PBS洗10min。7 7、預(yù)雜交、預(yù)雜交 0.20.2SSCSSC5050甲酰胺甲酰胺 30min 3730min 37。8 8、雜交：滴加雜交液（、雜交：滴加雜交液（2g/ml2g/ml） 加一層復(fù)蓋膜，加一層復(fù)蓋膜，4848雜交雜交8-12h8-12h。9 9、雜交后洗：、雜交后洗： 2 2SSCSSC洗洗 2 25min 455min 45 1 1SSCSSC洗洗 2 25min 5min 室溫室溫 0.50.5SSCSSC洗洗 2 25min 5min