第六章毛狀根培養(yǎng)

1、毛狀根培養(yǎng)技術毛狀根培養(yǎng)技術毛狀根培養(yǎng)技術毛狀根培養(yǎng)技術 教學內(nèi)容教學內(nèi)容毛狀根培養(yǎng)技術毛狀根培養(yǎng)技術簡介簡介 毛狀毛狀根誘導培養(yǎng)體系的建立根誘導培養(yǎng)體系的建立 毛狀根培養(yǎng)毛狀根培養(yǎng)技術與中藥生產(chǎn)技術與中藥生產(chǎn) 展望展望 512343毛狀根培養(yǎng)、篩選和鑒定毛狀根培養(yǎng)、篩選和鑒定 毛狀根（毛狀根（hairy root）概念）概念1. 毛狀根培養(yǎng)技術簡介毛狀根培養(yǎng)技術簡介 毛狀根：毛狀根：植物受傷后，被發(fā)根農(nóng)桿菌感染，在傷口處就會形成不定根，并產(chǎn)生多個分枝，呈毛發(fā)狀；這些不定根又被稱為毛狀根。 發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes1. 毛狀根培養(yǎng)技術簡介毛狀根培養(yǎng)技

2、術簡介 發(fā)根農(nóng)桿菌一種侵染性非常廣泛的土壤細菌，革蘭氏陰性。發(fā)根農(nóng)桿菌能侵染多種植物,誘發(fā)被感染植物的受傷部位長出毛狀根，其特征是迅速增生、高度分化出大量不定根。發(fā)根農(nóng)桿菌的生物學特性發(fā)根農(nóng)桿菌的生物學特性 1. 毛狀根培養(yǎng)技術簡介毛狀根培養(yǎng)技術簡介 （1）發(fā)根農(nóng)桿菌能侵染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物 （2）Ri質粒(root inducing plasmid) TDNA區(qū)（轉移區(qū)）、Vir區(qū)（致病區(qū)）兩個功能區(qū)LBRBviroriABGCDEopinecatabolismHairy root genesand opine synthaseT-DNARi質粒發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質粒質粒

3、1. 毛狀根培養(yǎng)技術簡介毛狀根培養(yǎng)技術簡介 ？什么是毛狀根培養(yǎng)技術什么是毛狀根培養(yǎng)技術毛狀根培養(yǎng)技術是20世紀80年代發(fā)展起來的基因工程和細胞工程相結合的一項新技術。利用發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質粒中含有的T-DNA整合到植物細胞上,使植物細胞誘導產(chǎn)生毛狀根。2.毛毛狀狀根培養(yǎng)體系根培養(yǎng)體系除菌除菌發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的篩選及活化農(nóng)桿堿型（農(nóng)桿堿型（agropine type）胭脂堿型章堿型發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的類型：發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的類型：農(nóng)桿菌菌株的篩選及活化將菌株在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)（含乙酰丁香酮），激活vir區(qū)的基因，為Ri質粒的轉移提供先決條件。受體材料的選擇及處理外植體：植物幼嫩的葉片、莖尖、分生組織等；

4、或愈傷組織；或原生質體外植體處理：在培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染的方法：發(fā)根農(nóng)桿菌感染的方法：向植物體直接注射與原生質體共培養(yǎng)對植物外植體進行接種感染對植物外植體進行接種感染毛狀根的除菌方法毛狀根的除菌方法 抗生素除菌法抗生素除菌法 抗生素除菌法是將毛狀根轉移至含有抗生素的培養(yǎng)基上，經(jīng)數(shù)代轉移直到完全無菌為止，常用的抗菌素有青霉素、頭孢霉素等； 溫度除菌法溫度除菌法 溫度除菌法是將毛狀根轉移至不含有抗生素的培養(yǎng)基上，經(jīng)過3940溫度條件處理，再轉移到新培養(yǎng)基上無菌苗無菌苗誘導出的毛狀根誘導出的毛狀根進行液體培養(yǎng)進行液體培養(yǎng)毛狀根的誘導過程毛狀根的誘導過程無菌植株生長到一定時候,將植株的莖尖

5、、葉片切去,剩下莖稈和根部,在莖稈上劃出傷口,將帶Ri質粒的土壤桿菌接種在傷口處和莖的頂部切口處,接種后繼續(xù)培養(yǎng)被感染的植株,經(jīng)過一段時間（2一4周）的培養(yǎng)后,在接種部位產(chǎn)生出毛狀根。誘導過程中可通過優(yōu)化誘導條件，使毛狀根生物量增殖或有效成分含量增多。要建立起正常的毛狀根必須經(jīng)過除菌以便獲得無菌的毛狀根。通常用抗生素除菌即是：將毛狀根從母體上切下后移植到含抗生素的培養(yǎng)基上經(jīng)數(shù)代轉移直到完全無菌為止。毛狀根誘導的分子機理毛狀根誘導的分子機理4T-DNA基因進人寄主細基因進人寄主細胞的胞的細胞核細胞核，并并整合整合到核到核基因組中基因組中, ,然后然后在寄主細在寄主細胞中胞中表達表達, ,從從植物

6、的感染植物的感染點誘導毛狀根點誘導毛狀根.1發(fā)根土壤桿菌發(fā)根土壤桿菌識別識別受傷植受傷植物釋放的物釋放的誘導物（乙酰丁誘導物（乙酰丁香香酮等酚性物質酮等酚性物質）3發(fā)根土壤桿菌發(fā)根土壤桿菌Ri質粒上的質粒上的vir區(qū)（致病區(qū)）基因被區(qū)（致病區(qū)）基因被乙酰丁香乙酰丁香酮等物質酮等物質活化活化,使使Ri質粒上的質粒上的T-DNA片段片段被切割下來并被切割下來并轉入轉入植物細植物細胞胞,但但vir區(qū)本身不轉入?yún)^(qū)本身不轉入。2發(fā)根土壤桿菌發(fā)根土壤桿菌識別識別信號信號分子后分子后,向向受傷細胞作受傷細胞作運動運動,并并與宿主細胞與宿主細胞發(fā)生發(fā)生粘接粘接。毛狀根的培養(yǎng)方法毛狀根的培養(yǎng)方法具體培養(yǎng)方法固體

7、培養(yǎng)液體培養(yǎng)法兩相培養(yǎng)法成批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)毛狀根的篩選與鑒定篩選：選擇生長速度較快、分枝較多的毛狀根株系進行擴大培養(yǎng)鑒定：形態(tài)學水平：激素自養(yǎng)，根叢生，多分枝 ，多根毛，無向地性 細胞水平：冠癭堿的測定 （硝酸銀染色）毛狀根培養(yǎng)反應器毛狀根培養(yǎng)反應器毛狀根培養(yǎng)反應器毛狀根培養(yǎng)反應器1.生長速度快生長速度快2.激素自養(yǎng)性激素自養(yǎng)性3.遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定性4.可塑造性可塑造性毛狀根有大量的分枝和根毛,生長快,可用于大量培養(yǎng)。毛狀根是細胞分化而來的根組織，屬于單克隆,具有遺傳穩(wěn)定性。毛狀根中的T-DNA片段上有生長素合成酶基因。發(fā)根農(nóng)桿菌中的Ri質粒是一個很好的轉基因載體,可把目的基因導

8、入植物細胞中毛狀根培養(yǎng)技術的優(yōu)點毛狀根培養(yǎng)技術的優(yōu)點5.毛狀根與中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)毛狀根與中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)次生代謝次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)物的規(guī)?；a(chǎn)的規(guī)模化生產(chǎn)生產(chǎn)藥用植生產(chǎn)藥用植物的活性成物的活性成分分藥用藥用植物植物人參、紫草、長春花、甜人參、紫草、長春花、甜菜菜胡蘿卜胡蘿卜(Daucuscarota)等等植物的植物的毛狀根能夠通過生物反應器毛狀根能夠通過生物反應器培養(yǎng)培養(yǎng)來來進行其次生物質的規(guī)?；M行其次生物質的規(guī)?；a(chǎn)。生產(chǎn)。成功應成功應用于工用于工業(yè)生產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的例子的例子展望展望優(yōu)：毛狀根培養(yǎng)體系是一種非常有潛力的生產(chǎn)次生代謝物的生物技術，其次級代謝物質的生產(chǎn)能力遺傳及生化穩(wěn)定性增加生物量的可操作性等特點都引起了人們相當大的興趣 。 缺：目前的生物反應器還難以滿足毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)的要求,主要限制因素為物質的轉移,毛狀根生長時易成團,限制了營養(yǎng)和氧氣的進入。缺：由于目前對農(nóng)桿菌不同