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10、Progress ofM icrob i o log ica lDetecti o n for Antibiotic Residue i n Ani m al o ri g i n Food 徐品X U P in關(guān)鍵詞 動物源性; 食品; 抗生素; 殘留; 微生物學; 檢測方法中國圖書資料分類號:R 446. 5 文獻標識碼:A 文章編號:1004-1257(2010 09-1057-04 為防治生畜和魚蝦、貝類等水生生物的各種疾病, 人們大量地使用抗生素。雖然抗生素的使用確實在很大程度上提高了生畜和水產(chǎn)品的產(chǎn)量, 但是獸藥中使用抗生素導致動物源性食品中抗生素殘留, 給攝入這些食品的人們的健康

11、產(chǎn)生了很大影響, 帶來了潛在威脅1。世界各國相繼出臺了法律法規(guī)來規(guī)范抗生素的使用。2009年6月1日, ! 中華人民共和國食品安全法正式實施, 對食品中抗生素殘留問題賦予了法律上的責任和意義。造成抗生素殘留超標的原因主要有以下幾個方面:首先, 使用抗生素對各種動物進行防病治病, 對動物在屠宰前的停藥期的規(guī)定不能夠遵守; 其次, 在動物飼料中添加抗生素類添加劑; 再有, 經(jīng)銷商為了保鮮, 防止肉類、奶類產(chǎn)品的腐敗變質(zhì), 人為地綜述將抗生素添加到畜產(chǎn)品中。這些因素均造成了抗生素不同程度的殘留。因此, 建立快速、有效的檢測技術(shù)對保證消費者的健康, 營造一個安全、放心的飲食環(huán)境是十分必要的, 同時也是

12、各國政府非常關(guān)注的問題。1 概況目前, 從方法學上控制性對策主要建立有3個步驟:篩選、二級篩選、最后鑒定。一個好的篩選方法應檢測到所有等于或低于最大殘留量(m ax i m u m residue li m its , M RL 水平, 且應具有快速、簡單、廣泛、費用低等優(yōu)點, 傳統(tǒng)微生物抑制檢測法前處理簡單, 操作方便, 雖然存在著檢出限過高等問題, 但仍可作為篩選方法對大批量樣品同時進行檢測2。篩選步驟通常依據(jù)細菌抑制試驗來實現(xiàn)多種物質(zhì)殘留的微生物法檢測, 主要包括2種篩選方法加以區(qū)別:試管實驗和作者簡介:徐品, 女, 副主任技師, 主要從事微生物檢驗工作。作者單位:天津經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)衛(wèi)生

13、防病站, 3004571058職業(yè)與健康 2010年5月第26卷第9期 O ccup and H ealt h Vo. l 26No . 9M ay 2010(多 平板實驗系統(tǒng)。試管實驗包含一種瓊脂培養(yǎng)基, 針對某一種敏感的細菌, 補充以p H 值和氧化還原指示劑, 由顏色變化來判定抗生素的有無, 主要的菌株為Bacill us stearo t her m oph il us , 之所以選擇此菌是因為該菌在高溫下有快速生長的特性使得結(jié)果可在幾小時內(nèi)獲得。用芽胞代替干燥細菌可便于保存, 并且方便于商業(yè)化分配, 此類實驗最初由檢測牛奶發(fā)展而來(D elvotest 等 , 但是目前也可用于肉、腎

14、臟、魚、蛋等樣品的檢測(P rem i T est 和K IS T est 等 3; 但是單一細菌抑制試驗對篩選抗生素殘留通常是不適合的4。在(多 碟實驗中, 樣品被加入至已接種的瓊脂層的頂部或小孔內(nèi), 來自于一片組織或浸滿組織液的紙片中含有動物組織的抑制性物質(zhì), 此物質(zhì)可擴散至瓊脂層抑制接種于平板的敏感菌株的生長, 通過隔夜培養(yǎng), 以樣品周圍出現(xiàn)抑菌環(huán)來判定抗生素的存在, 用單一平板或不同平板、不同組合的p H 值、培養(yǎng)基和不同的菌種以提高不同藥物的檢測水平5。二級篩選也可通過微生物法來實現(xiàn)。一般針對多碟實驗, 目前, 可用不同的物質(zhì)作為假定性鑒定的抑菌劑針對不同類型的抗生素, 但目前沒有單

15、一的物質(zhì)可針對所有類型的抗生素殘留。篩選試驗的目的是為了選擇一些樣品, 這些樣品可經(jīng)過更高級的方法進一步進行鑒定, 包括:酶免法、Char m II 受體分析法和色譜法。一旦經(jīng)常規(guī)抑制試驗為陽性的樣品需進行化學鑒定和定量測定。理化檢測方法因前處理較復雜, 所需儀器較昂貴, 不適用于屠宰廠的現(xiàn)場檢測, 但因其具有高效、靈敏、準確等優(yōu)點, 又因為化學法的極其專一性, 因此, 作為鑒定試驗已為大家廣泛應用6。進一步說, 微生物法因需要大量的平板而使得實驗變得繁瑣, 但是這并沒有影響此法的廣泛性, 該法因其價廉、簡易、廣譜等特點在檢測抗生素殘留過程中發(fā)揮巨大作用, 以下針對不同類型的微生物法及其發(fā)展過

16、程作為闡述。2 歐盟各國的檢測方法2. 1 單碟法 比利時用于檢測屠宰場動物的腎組織抗生素殘留的常用方法。用Bac ill us subtili s B GA 作為工作菌, 加入三甲氧芐氨嘧啶能較好地測定磺胺類抗生素, 加入 葡萄糖苷酸酶7可較好地測定氯霉素類抗生素殘留。此法被認為對檢測肉類意義不大, 因為大多數(shù)抗生素會很快從肌肉組織中釋放出來, K oenen D i er i ck 等8另研究發(fā)現(xiàn)單碟法在檢測磺胺類藥物方面在p H 值為7. 2時與四碟法檢出限相似, 可替代歐盟四碟法。2. 2 N ew Dutch K i dney(NKT 法 1988年發(fā)展于荷蘭, 是荷蘭用于屠宰場動物

17、新鮮腎的檢測方法, 實際上是一種單碟實驗。由standard II 營養(yǎng)瓊脂組成, 加上1%N aC 、l 1%葡萄糖、0. 2%KH 2PO 4和0. 28N a 2HPO 4#12H 2O 。將此瓊脂倒入平板, 厚2 2mm, p H 值調(diào)至7. 000. 05。同樣Bac ill us subtilis BGA 作為工作菌。在屠宰場測定抗生素殘留時, 先將4張紙片放在腎盂中至少30m i n , 將其中2張被腎盂浸濕的紙片于-20%冷凍保存?zhèn)溆? 另2張呈對角置于實驗平板上。將25m l 三甲氧芐氨嘧啶溶液(含2mg /m lTM P 在10%N aC l 溶液 滴加在2張紙片上, 將平

18、板置于37%培養(yǎng)38h 9。新的荷蘭腎實驗(N ew N etherlands K idney T est , NNKT 對于磺胺類藥物有較高的靈敏度, 特別是對于屠宰場豬肉樣品中磺胺類、氯霉素、四環(huán)素、氨基苷類和青霉素類較歐盟四碟法靈10敏度高。Broex 等認為NNKT 與NKT 比較, 前者可測出5 , 。2. 3 德國三碟法 也是利用B . subtilis 作為工作菌, 3塊板的p H 值分別為6. 0, 8. 0和7. 2, 在最后一塊平板中加入三甲氧芐氨嘧啶能較好地測定磺胺類抗生素, 30%培養(yǎng)1824h 。肌肉和腎均可作為樣品用冷凍肉和鮮的或冷凍腎樣, 制成直徑為9mm 、2m

19、m 厚的薄片, 置于平板上培養(yǎng)11。如果在2塊組織薄片的邊緣開始出現(xiàn)2mm 的抑菌環(huán)即可判定為陽性。陽性的肌肉試驗不適用于整個動物標本, 而陽性的腎實驗僅能排除器官。在放置豬和馬的腎臟薄片之前, 預先放置半通透的膜在瓊脂表面, 以避免由于組織細胞破裂釋放出的溶菌酶而導致的假陽性結(jié)果出現(xiàn)。此法對四環(huán)素類、 內(nèi)酰胺類、喹啉類、氨基苷類、磺胺類藥物殘留均可檢出, 但是有些抗生素不符合歐盟規(guī)定的耐受水平, 如土霉素、氨芐青霉素、阿莫西林、磺胺類藥物等, 大環(huán)內(nèi)酯類、多黏菌素等藥物檢測不夠靈敏。該實驗較N e w Dutch K i dney 法更加繁瑣、費用高。2. 4 歐盟四碟法 此法也是微生物抑制

20、法, 其中3塊平板利用B acill us subtilis 在不同的p H 值(6、7. 2、8 制成的培養(yǎng)基, 第4塊平板利用M icro coccus l uteus 作為檢測用菌。將肌肉樣品或腎樣品保持在冷凍狀態(tài)下, 切成8片, 為直徑8mm 、厚2mm 的圓柱, 每塊平板放置2片, 呈對稱放置在平板邊緣, 每塊平板可放置6塊肉片。前3塊平板置30%培養(yǎng)2024h , 當2塊肉片周圍的抑菌環(huán)大于或等于2mm 時, 結(jié)果可判定為陽性。4795份調(diào)查結(jié)果顯示, M. l uteus 在p H 值為8的條件下得出的陽性結(jié)果檢測mac ro lides 和 內(nèi)酰胺類抗生素是不可靠的12; Ba

21、c ill us subtili s 作為工作菌的平板較M. l uteus 作為工作菌的平板結(jié)果可靠。四碟法對fl uoroqui no l ones 和磺胺類抗生素不夠靈敏。原則上說, 只有深度冷凍的樣品才適用于此法, 如果采用透析膜和后期的鑒定技術(shù), 那么也可利用腎臟作為樣品。該法檢測大環(huán)內(nèi)酯類殘留較德國三碟法檢測值低, 該法較前2種方法更加繁瑣和昂貴?？傊? N e w Du tch K i dney 法、德國三碟法、歐盟四碟法在歐盟各國用于抗生素殘留的篩選。N ew Dutch K i dney 法在檢測磺胺類藥物中較德國三碟法和歐盟四碟法靈敏。3 美國及加拿大地區(qū)的檢測方法S TO

22、 P (S w ab T est On P re m i ses 法和CA ST (Ca lf Antibiotic and Su lfa T est 法用于加拿大和美國的屠宰場, 后來, 美國又發(fā)展了FAST (F ast A nti m i crobiol Screen T est 法, STO P 用B . s ubtili s 作為實驗菌, 接種在抗生素5號培養(yǎng)基上, 2729%培養(yǎng)1624h , 用沾取腎液的棉拭周圍出現(xiàn)抑菌來判定抗生素的存在。CA ST 法用B . m egater i u m 作為實驗菌13, 接種于M H 培養(yǎng)基中, 4445%培養(yǎng)1624h , 在棉拭周圍出現(xiàn)

23、抑制環(huán)表明樣品中存在抑菌物質(zhì)。FA ST 法的實驗菌和試驗溫度與CA S T 法相同, 但是CA S T 法培養(yǎng)基中加入葡萄糖和溴甲酚紫。FA ST 法檢測細菌有較快的生長率, 因而使得培養(yǎng)時間由16減少為6h 。當STO P 法的培養(yǎng)基換成Saskatoon 抗生素培養(yǎng)基時(p H 值由8. 0到6. 7, 并加入相應的中和劑 在標準溶液中用此法進行22種抗生素的測液, 其中有15種靈敏度增加。這3種方法對氯霉素和磺胺類藥物靈敏度較低。自1967年開始, 美國FSIS 對大量的肉類和家禽樣品進行常規(guī)檢驗以避免農(nóng)藥殘留對人類造成傷害。1979年, 美國開始實行第1個快速篩選試驗, 即STOP

24、(Swab T est On P rem ises 法, Be l 室, 監(jiān)控品職業(yè)與健康 2010年5月第26卷第9期 O ccup and H ealt h Vo. l 26No . 9M ay 20101059中抗生素殘留的檢測, 并可在24h 內(nèi)檢測出殘留的抗生素, 而在這之前, 需要五六天才能得出實驗室結(jié)果。至20世紀80年代, 小牛中殘留的磺胺類藥物和抗生素殘留的增加引起了美國FSIS 的注意, 為了對這種類型的動物進行篩選, 1984年Be lsv ille 實驗室又研究出了CA ST 法, 1985年將此法引入屠宰場作為檢測殘留的篩選方法。至1987年, 小牛中的磺胺和抗生素殘

25、留水平明顯減少。1994年, FA ST 出現(xiàn), 研究表明FA S T 法與前2種方法比較, 樣品陽性檢出率高14, 而且該法更適用于針對磺胺類殘留樣品的檢測, 更加使得此法有優(yōu)勢的是, FAST 法使用的培養(yǎng)基是紫色的, 在培養(yǎng)基內(nèi)加入糖, 細菌培養(yǎng)后產(chǎn)酸使得培養(yǎng)基顏色變黃, 如果棉拭周圍有抗生素那么會阻礙細菌的生長而使得顏色保持在紫色, 說明有抗生素殘留。4 日本針對抗生素殘留的檢測在日本的日常監(jiān)測中, 廣泛采用平成6年日本原生省所制訂的! 實用牲畜、水產(chǎn)品中抗生素物質(zhì)殘留的簡易檢測法(修訂 作為準則。該法使用檸檬酸和丙酮緩沖液20m l 再加入5g 樣品均質(zhì)后, 取上清液作為樣液進行檢測

26、。崛江正一等對此法作了改進, 將5g 樣品放入聚丙烯制離心管內(nèi), 加入5m l 甲醇, 攪拌1m i n , 在10%的條件下, 用3000r /min 離心10m i n 取上清液作為檢測樣液進行檢測, 利用此法減少了樣品中抗生素的稀釋倍率, 使檢測靈敏度大大提高, 并檢出各類抗生素125種15。5 我國近年來的發(fā)展狀況中華人民共和國出入境檢驗檢疫局行業(yè)標準! 動物源性食品中抗生素藥物殘留檢測方法微生物抑制法規(guī)定了動物源性食品中 內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素、氨基苷類藥物殘留檢測的試樣制備、保存和檢測方法, 10g 試樣加入至20m l 緩沖液內(nèi)用渦旋振蕩器振蕩3m in , 于7075%水

27、浴20m i n 后, 2000r /mi n 離心15m i n , 取上清液作為樣液, 將濾紙置于檢定平板上, 每塊平板最多不超過6個, 滴加100 l 樣液在濾紙上, 冷藏30m i n 后, 30%培養(yǎng)18h 后觀察結(jié)果, 根據(jù)抑菌圈的大小判定結(jié)果。王志強等16采用了微生物抑制法快速檢測了15種抗生素殘留, 與上面不同的是該法在樣液制備時采用了磷酸鹽-乙腈混合液作為緩沖液。目前, 我國食品衛(wèi)生標準中G B /T4789. -2003制定了牛乳中抗生素殘留的檢測方法。即氯化三苯基四氮唑法(TTC 法 17, 嗜熱鏈球菌生長繁殖產(chǎn)生的氫可使無色TTC 還原成紅色化合物。如果牛奶的顏色不變,

28、 證明有抗生素存在導致菌種不繁殖, 即為陽性, 反之變成紅色則為陰性。此法的最低檢出量為青霉素0. 004U /mL,鏈霉素為0. 5U /mL, 慶大霉素0. 4U /mL, 卡那霉素5U /mL。6 國際上近年來發(fā)展的方法6. 1 S TAR 法 隨著技術(shù)的不斷改進, G aud i n 等182004年研究出一種五碟法(Screeni ng T est fo r A nti b i otic R esi dues , S TAR 法 來篩選乳品中抗生素殘留。5塊平板分別針對不同類型的抗生素而設定, 即B . cerues 針對四環(huán)素, E . co li 針對喹啉類, B . subti

29、li s 針對氨基糖苷類, K ocuria var i ans 針對大環(huán)內(nèi)酯類, B aci l us stearo t her m oph il us 針對磺胺類和 內(nèi)酰胺類。該五碟法對不同類型的抗生素進行聯(lián)合檢測, 最多可檢測66種抗生素, 且2, 盟實驗室參考標準, 已用于牛奶中抗生素測定, 實際上此法也可用于肌肉的測定。6. 2 六碟法 由6塊平板組成。M y ll yn i e m i 19等用微生物六碟法對腎臟和肌肉樣品進行檢測, 并用液相色譜對陽性樣品進行鑒定, 得出此法與化學法有較好的一致性。方法是B . s ubtili s 接種在其中3塊平板, p H 值分別為6. 0、

30、7. 2和8. 0, B . cerues 接種在p H 值為5. 9的培養(yǎng)基中, M. l uteus 接種在p H 值為8的培養(yǎng)基中, E . co li 接種在p H 值為7. 2的培養(yǎng)基中。F eri n i 20等將證實性溶液(Pase , Paba , M gS O 4 作為二次篩選試驗的必要條件引入試驗, 同時將分析薄膜插入樣品和瓊脂表面之間放置溶菌酶的反應以減少假陽性的結(jié)果。具體操作如下:將解凍的樣品用小刀切成直徑8mm &2mm 厚的薄片, 在所有的平皿(除去第3塊板 中置2片樣品, 其中1片樣品滴加20 l 相應的中和溶液, 在第3塊板置4片樣品, 在其中的3片樣品

31、上分別滴加Pase , Paba , M gS O 4, 將一片方形纖維分析膜(20mm &20mm 插入組織薄片和瓊脂表面之間。14平板在30%, 平板5和6在37%培養(yǎng), 這個實驗整個過程僅需18h 。6. 3 D e l vo test 法(SP 法 原理是利用嗜熱芽孢菌64%培養(yǎng)后產(chǎn)酸引起指示劑BCP (即溴甲酚紫 變黃, 如果抑制劑不變色, 說明抗生素抑制嗜熱芽孢菌生長, 存在抗生素殘留, 反之變黃色。A lthaus 等21于2003年用D e l vo test 光度法對牛乳中的抗生素的限值檢測研究表明, 內(nèi)酰胺類、磺胺類等抗生素的檢出限與M RL 水平相當, 而針對牛乳

32、中氨基苷類、四環(huán)素類、鏈霉素、氯霉素和三甲氨芐嘧啶殘留的檢測靈敏度有待提高, 建議用不同類型的微生物建立聯(lián)合殘留物檢測系統(tǒng)以檢出不同類型的抗生素。6. 4 BY 法 也稱藍黃檢測法, 通過顏色的對比判斷陽性、陰性, 從而檢測乳制品中抗生素的殘留。L i nage 等22通過這種方法對 內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等25種抗生素進行了檢測, 其檢測限與歐盟規(guī)定的檢測限很接近。此法操作簡單, 耗時短, 檢測種類多; 但是誤差大, 容易漏檢。6. 5 P rem i T est 此法可用安瓿制成商業(yè)化培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將絞碎的新鮮肉20g 用25000r /min 離心10m i n 制成肉浸液,

33、將100 l 上清液加入瓊脂表面, 在室溫下20m i n 預培養(yǎng)后, 加至安瓿中64%培養(yǎng)至陰性對照出現(xiàn)黃色為止, 大約需要3h 23。近年來的研究表明, P rem i T est 針對四環(huán)素、磺胺類藥物、喹啉類、鏈霉素缺乏靈敏度, 用此法可檢出較低水平的青霉素, 對氯霉素不夠敏感24。較FA S T 相比, Pre m i T est 的假陽性率較高, 新霉素用FAST 檢測有較好的靈敏度, 且對于腎液樣品均不能檢測小于5ng /ml 的濃度25。6. 6 NAT (N ou w s anti b i o ti c test 法 用5塊平板進行篩選, 將腎盂液接種在紙片上進行檢測, 同時

34、用肉浸液和腎臟浸液作為陽性對照, 5塊平板分別為:B . cerues ATCC1178針對四環(huán)素, K ocur ia rhizoph ila AT CC9341針對 內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類, Y ersi n i a rucker iN CI M 13282特異性針對喹啉類, Bacill us pu m ilus CN 607針對磺胺類和二氨基嘧啶, Bac ill us subtilis BGA 針對氨基苷類。方法是將腎從腎的背部邊際向腎盂切割, 然后將紙片插入并快速涂抹切割面, 在0. 5h 的吸收后, 置于事先準備好的5塊平板上, 隔夜培養(yǎng), 大于15mm 判定為陽性。陽性的樣品再用

35、肉浸液和腎臟浸液進行陽性篩選。與P re m i T est 比較26, S TAR 和NAT 法更適用于實驗室, 并需要多一些的培養(yǎng)時間和不止一種的指示菌, 但是可檢測4種M RL, 而P rem i T est 不能夠縮小, 入1060職業(yè)與健康 2010年5月第26卷第9期 O ccup and H ealt h Vo. l 26No . 9M ay 2010Practi ca l eval ucati on. T ij d schr d i egeneeskd , 1988, 113:254-259. 11Korsrud GO, Boison J O. Bact eri al I nh

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47、d egg . Food Add i t C onta m, 2007, 24:842-850.(收稿:2009-12-15(本文編輯:方弘J D ai ry Sc, i J Dairy Sc, iInt J Anti m icrob Agents ,J陽性篩選使得NAT 法的結(jié)果更加確定。6. 7 檢測喹啉類藥物殘留的快速檢測法 用單一的革蘭陰性大腸埃希菌作為敏感菌, 為一種快速的抗生素殘留檢測方法, 可檢測家禽肉和蛋類的喹啉類藥物殘留, 可制成安瓿進行檢測, 與P rem i T est 和D e l vo test 法具有可比性; H e len A sh w i n 等27對此法進行了

48、改進, 在營養(yǎng)瓊脂中加入p H 酸性指示劑, 改進后的假陽性率和假陰性率均小于5%; P ikk m aat 等28認為此法可用于半定量, 同時針對多種抗生素殘留的樣品可用于其他方法(如P rem i T est 的補充, 用其針對喹啉類藥物殘留進行檢測。7 展望隨著科學技術(shù)的飛速發(fā)展, 當今許多成就致力于發(fā)展液相色譜和氣-質(zhì)聯(lián)用等證實性方法。但是, 我們應該認識到快速監(jiān)測屠宰場動物的篩選方法還是依靠微生物法檢測抗生素殘留來實現(xiàn), 傳統(tǒng)的檢測方法在食源性食品的抗生素檢測的過程中仍然起著很大作用。綜上所述, 食品中抗生素殘留問題因涉及人們健康的公共衛(wèi)生問題而越來越引起各國重視, 建立健全適合本國

49、的檢驗檢測方法, 尋求能夠簡便、快速、準確地檢出微量的殘留的方法, 盡可能地減少其對人類的危害, 是我們檢驗工作的重中之重。目前, 各類方法的發(fā)展已日趨成熟, 關(guān)鍵是如何在實際工作中充分發(fā)揮作用, 提高各環(huán)節(jié)人員的意識水平, 給食品一個安全、放心的環(huán)境。8 參考文獻1Van dan Bogoard AE, Stoobbri ng EE. E pide m iol ogy of resistance t o an tibiotics . L i nk bet w een an i m al s and hum an s . 2000, 14:327-335.2Ok er m an L , C roubels S ,