銅尾礦復(fù)墾后土壤微生物活性及其群落功能多樣性研究

1、劉愛(ài)民等：銅尾礦復(fù)墾后土壤微生物活性及其群落功能多樣性研究 879銅尾礦復(fù)墾后土壤微生物活性及其群落功能多樣性研究劉愛(ài)民1, 2，黃為一1*1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)系/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2. 安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000摘要：對(duì)安徽銅陵五公里尾礦區(qū)三葉草復(fù)墾后的土壤微生物活性和群落的功能多樣性研究表明，復(fù)墾后每克土壤微生物細(xì)菌數(shù)已達(dá)2.3×107個(gè)，并存在一定量耐Cu2+、Cd2+、Zn2+、Cr6+、Pb2+、Ni2+的菌株，但種類少，主要為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和短桿菌屬。BIOLOG測(cè)試結(jié)果顯示

2、，銅鎘重金屬離子的復(fù)合污染使土壤微生物群落豐富度降低；外源耐銅鎘微生物菌劑的添加使尾礦區(qū)土壤微生物群落代謝剖面（AWCD）變化明顯，提高微生物對(duì)單一碳源底物的利用能力，增加利用不同碳底物的微生物數(shù)量，減輕了重金屬污染引起的土壤微生物群落功能多樣性的下降，為尾礦區(qū)生境加速恢復(fù)提供一條有效途徑。關(guān)鍵詞：銅尾礦；銅鎘污染；耐銅鎘菌劑；土壤微生物群落功能多樣性中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-2175（2005）06-0876-04尾礦（tailings），又稱尾沙，屬于固體廢棄物的一種，它是礦石經(jīng)粉碎、浮選精礦后余下的微粒狀固體粉末。在礦產(chǎn)開(kāi)發(fā)過(guò)程中，尾礦通常被排放到低洼的地

3、方或借助山體，筑壩堆存，形成非經(jīng)治理而無(wú)法使用的礦業(yè)廢棄地。日益增多的尾礦不僅占用大量土地，覆蓋原有的植被，排放的尾礦廢渣和產(chǎn)生的酸性礦山廢水嚴(yán)重破壞了生態(tài)系統(tǒng)1。土壤微生物是維持土壤生物活性的重要組分，對(duì)物質(zhì)循環(huán)起重要作用，微生物的活性和群落結(jié)構(gòu)的變化能敏感地反映土壤質(zhì)量2,3。BIOLOG作為對(duì)功能微生物群落變化的敏感指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)土壤微生物群落的功能多樣性4。研究表明，用BIOLOG方法測(cè)得的代謝多樣性類型與微生物群落組成相關(guān)5。安徽銅陵銅尾礦廢棄地，是一種以重金屬Cu毒害為主要特征的極端裸地，且土壤中鎘的含量較高。有關(guān)該銅尾礦區(qū)復(fù)墾后土壤微生物群落多樣性研究鮮有報(bào)道。本文主要探討

4、銅尾礦區(qū)復(fù)墾后土壤微生物對(duì)多種重金屬離子的耐受性，接種外源微生物菌劑對(duì)銅鎘污染的土壤微生物群落多樣性的影響，為加快尾礦區(qū)生境恢復(fù)提供依據(jù)。1 礦區(qū)自然狀況和研究方法1.1 礦區(qū)自然概況 安徽省銅陵地處北緯30°56¢42，東經(jīng)117°43¢28，屬亞熱帶濕潤(rùn)氣候，季節(jié)交替明顯，氣候溫和，雨量充沛，年均溫16.2 ，無(wú)霜期約為230天。銅陵市是我國(guó)重要的銅礦開(kāi)采和冶煉基地，目前存有規(guī)模較大的尾礦庫(kù)(場(chǎng))5個(gè)，占地面積達(dá)280 hm2。五公里尾礦場(chǎng)位于銅陵市區(qū)，停止排放時(shí)間約8 a，面積約105 hm2。1993年10月開(kāi)始進(jìn)行復(fù)墾試驗(yàn)，現(xiàn)部分已復(fù)墾地段的植

5、被蓋度已達(dá)90%以上，但未復(fù)墾處仍裸露，風(fēng)蝕、水蝕現(xiàn)象嚴(yán)重。主要復(fù)墾植物為狗牙根Cynodondactylon、白茅(Imperatacylindrica、三葉草Trifoliumpratense等，以邊緣區(qū)自然定居的植物為多。1.2 取樣及樣品處理土樣于2004年11月取自安徽銅陵五公里尾礦區(qū)三葉草復(fù)墾土，將一部分新鮮土研磨過(guò)篩，置于4 冰箱保存以供土壤微生物學(xué)指標(biāo)分析；稱取其中部分土200 g接種微生物J5菌劑(實(shí)驗(yàn)室分離保存的耐銅和耐鎘離子的微生物菌液)；另外稱取部分土200 g分別以20 mg/kg添加硫酸鎘和以300 mg/kg添加硫酸銅，充分混勻，平衡5 d后測(cè)定微生物的存活率（以

6、土壤細(xì)菌數(shù)計(jì)）和群落多樣性。另一部分土壤于室內(nèi)自然風(fēng)干、研磨、過(guò)篩，供土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定?；瘜W(xué)試劑：3CdSO4·8H2O，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，ZnSO4·7H2O，NiSO4·7H2O，Pb(CH3COO)2·3H2O，K2CrO4·H2O，分析純，中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。配制成金屬離子濃度為0.2 mol/L的貯備液備用。1.3 土壤微生物群落功能多樣性測(cè)試BIOLOG研究微生物的載體是96微孔板(MicroPlate)，將微生物接種到分別含有95種單一碳源和四唑染料（四氮疊茂）微孔板

7、上的孔中，當(dāng)孔中一旦有微生物利用碳源，發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，四唑染料就變?yōu)樽仙? 另外一個(gè)未加碳源的孔中加水作為對(duì)照6。根據(jù)反應(yīng)孔中顏色變化的吸光值來(lái)指示微生物對(duì)95種不同碳源的利用模式差別，從而反映微生物群落的功能代謝能力差異。稱取5.00 g土，放置45 mL生理鹽水（NaCl的質(zhì)量濃度為8.5 g/L）中，振蕩30 min后，靜置5 min，吸取5 mL上清液放入45 mL生理鹽水中，搖勻后加入GN板中，每個(gè)孔中加樣125 µL。25 恒溫中培養(yǎng)168 h。測(cè)定時(shí)間間隔為0、24、48、72、96、120、144、168 h。用Emax E11383 BIOLOG自動(dòng)讀數(shù)裝置在590

8、nm下測(cè)定其吸光值。1.4 土壤微生物活性指標(biāo)分析土壤細(xì)菌計(jì)數(shù)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基稀釋平板法7。1.5 土壤重金屬含量及理化性質(zhì)分析土壤理化性質(zhì)按常規(guī)方法測(cè)定8。pH的測(cè)定方法：尾礦水=12.5，用PHS-3C精密pH計(jì)測(cè)定。1.6 數(shù)據(jù)分析表1 供試尾礦土的基本理化性質(zhì)pH值w(有機(jī)質(zhì))/(g·kg-1)w(全N)/(g·kg-1)w(全P)/(g·kg-1)w(全K)/(g·kg-1)w(全銅)/(mg·kg-1)w(有效態(tài)銅)/(mg·kg-1)w(全鎘)/(mg·kg-1)w(有效態(tài)鎘)/(mg·kg-1

9、)6.185.520.34.312.62362.70130.7615.41.87土壤微生物群落BIOLOG GN微平板中多底物反應(yīng)采用每孔的平均吸光值（Average well color development, AWCD）來(lái)描述9。計(jì)算表達(dá)式為：AWCD=（C-R）/95 （1）（1）式中C是所測(cè)的95個(gè)反應(yīng)孔的吸光值，R是對(duì)照孔的吸光值。土壤微生物群落功能多樣性測(cè)定方法見(jiàn)文獻(xiàn)10，代謝剖面反應(yīng)孔的數(shù)目代表微生物群落的豐富度（S）。本研究運(yùn)用AWCD值接近0.6時(shí)的數(shù)據(jù)來(lái)比較BIOLOG板中的微生物代謝多樣性類別，這樣可以比較顏色變化率相同的情況下BIOLOG板的碳源利用情況，而不考慮接種

10、密度帶來(lái)的差異11，比較時(shí)采用168 h的數(shù)據(jù)。2 結(jié)果與分析2.1 銅陵尾礦區(qū)土壤的基本理化性質(zhì)從表1供試尾礦土的基本理化性質(zhì)分析結(jié)果來(lái)看，銅礦區(qū)典型污染土壤中金屬污染以銅為主，鎘次之。隨著尾礦棄置堆放時(shí)間的延長(zhǎng)，pH逐漸降低，由于酸化程度的不斷加深，從而形成銅鎘污染及酸性廢水污染，造成極端板結(jié)、貧瘠和過(guò)高的含鹽量，N、P、K含量不足。2.2 銅尾礦區(qū)土壤微生物細(xì)菌數(shù)量分析表2 每克供試土壤細(xì)菌數(shù)量分析1) Table 2 Bacteria number of per gram soil samples tested /105細(xì)菌平板中的各種重金屬離子的濃度/(mmoL·L-1)尾

11、礦尾礦+硫酸鎘尾礦+J5菌液尾礦+硫酸鎘+J5菌液Zn2+：4158±20138±16172±42145±27Ni2+：22.5±0.52.37±0.21.09±0.23.50±0.5Cr6+：42.50±0.11.45±0.21.65±0.051.75±0.2Cu2+：2135±38109±18155±31139±23Cd2+：21.38±0.11.50±0.380±1356±21Cu2+Cd2

12、+：各20000Pb2+：4112±37125±28155±18143±23Co2+：20000不含重金屬離子的對(duì)照細(xì)菌平板230±87190±52258±17214±161）硫酸鎘的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg·kg-1按前面方法處理后的各類尾礦土，取10 g土放入90 mL生理鹽水中，30 ，150 r/min下振蕩30 min，稀釋涂布法分離獲得土壤微生物，培養(yǎng)48 h后，計(jì)算細(xì)菌數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，供試尾礦土在含和不含重金屬細(xì)菌平板上的細(xì)菌數(shù)量分析結(jié)果顯示，尾礦土中本身有豐富的耐4 mmol/L

13、 Zn2+、Cr6+、Pb2+和2 mmol/L Cu2+、Cd2+、Ni2+的菌株，細(xì)菌數(shù)量較多；但從耐性平板上可見(jiàn)，分離出來(lái)的耐重金屬細(xì)菌種類較少，菌種單一，經(jīng)形態(tài)和生理生化初步鑒定主要為芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas和短桿菌屬Brevibacterium。分離出的菌株對(duì)Ni2+和Cr6+的抗性較弱，菌落單薄。由于所添加的J5菌液具有在Zn2+和Cd2+平板上呈亮黃綠色的特點(diǎn)，當(dāng)尾礦中添加有J5菌液時(shí)，發(fā)現(xiàn)這時(shí)的尾礦中的微生物在Zn2+和Cd2+平板上主要以J5菌株為主；而在沒(méi)有添加J5的尾礦土中篩選出的抗性菌株多數(shù)呈無(wú)色，表明J5在尾礦土中可定居下來(lái)并能很好

14、檢測(cè)出來(lái)，且在抗性菌中占一定的優(yōu)勢(shì)。在Cu2+平板上的抗性菌株種類相對(duì)略多，可能與長(zhǎng)期生存的高銅環(huán)境有關(guān)。尾礦土中微生物具有較強(qiáng)的抗Zn2+、Cu2+、Pb2+能力，基本不耐Co2+；Cu2+和Cd2+兩者在一起對(duì)土壤微生物的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)離子的毒性，在此平板上幾乎不能篩選出任何土壤微生物。經(jīng)抗性平板篩選出的細(xì)菌數(shù)明顯低于不含重金屬平板上篩選出的細(xì)菌數(shù)，表明重金屬離子對(duì)土壤微生物具有一定的抑制作用。尾礦中添加J5菌劑的土中分離出的抗Zn2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+細(xì)菌數(shù)高于對(duì)照尾礦土。2.3 尾礦區(qū)土壤微生物群落功能多樣性分析2.3.1 尾礦區(qū)土壤微生物群落代謝功能多樣性BIOLOG測(cè)

15、試系統(tǒng)已廣泛用于不同生境土壤微生物多樣性研究12，它可以從微生物功能代謝水平上來(lái)揭示微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性及其變化，BIOLOG盤(pán)中每孔的平均吸光值（AWCD）是反映土壤微生物群落生理功能多樣性的重要指標(biāo)。圖1是采用BIOLOG測(cè)試系統(tǒng)研究6種處理的尾礦土中微生物群落代謝功能多樣性的變化。圖1 不同處理供試土壤平均吸光值Fig. 1 Average well colour development (AWCD) in tailings soil samples tested after different treatment1:尾礦土；2:尾礦土+J5；3:尾礦土+硫酸鎘；4:尾礦土+硫酸鎘+J

16、5；5:尾礦土+硫酸銅+硫酸鎘；6:尾礦土+硫酸銅+硫酸鎘+J5表3 供試土壤微生物群落豐富度分析Table 3 Analysis of soil microbial community richness土壤編號(hào)微生物群落豐富度/S 尾礦土66 尾礦土+J5菌劑68 尾礦土+硫酸鎘58 尾礦土+硫酸鎘+J5菌劑71 尾礦土+硫酸銅+硫酸鎘60 尾礦土+硫酸銅+硫酸鎘+J5菌劑80從圖1可以看出，1號(hào)至6號(hào)各供試土壤微生物群落的AWCD值在48 h之前未表現(xiàn)出變化，培育至72 h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)變化，96 h時(shí)出現(xiàn)明顯變化，其數(shù)值越來(lái)越高。24 h后光密度值上升的速率隨土壤受污染時(shí)間而增加，即表明了土

17、壤微生物對(duì)碳源的消耗速度不斷加快。在尾礦土中加有2種重金屬（硫酸銅和硫酸鎘）后再添加J5菌劑對(duì)微生物群落影響較大，能有效提高微生物對(duì)單一碳底物的利用能力，增加利用不同碳底物的微生物數(shù)量，提高土壤微生物群落的功能多樣性。在尾礦土中同時(shí)加入一定濃度的硫酸銅和硫酸鎘時(shí)，可能因尾礦土的一定吸附作用，減弱了重金屬離子對(duì)微生物的毒害作用，所以礦土中的微生物群落生理功能多樣性變化不大；而J5菌劑能夠耐一定濃度的硫酸銅和硫酸鎘，J5菌劑本身代謝產(chǎn)生堿性物質(zhì)，添加到尾礦土中后，中和土壤酸性，改善礦土環(huán)境，增強(qiáng)礦土中微生物活性，即提高土壤微生物利用單一碳底物的能力。同時(shí)J5菌體具有一定吸附重金屬能力，降低菌體周?chē)?/p>

18、環(huán)境中重金屬離子濃度，促進(jìn)礦土中微生物的活性。2.3.2 尾礦區(qū)土壤微生物群落豐富度由于BIOLOG GN盤(pán)中制備有95種不同性質(zhì)的碳源，在培養(yǎng)過(guò)程中土壤的不同微生物對(duì)各自的優(yōu)先利用碳源基質(zhì)具有選擇性，進(jìn)而使BIOLOG GN盤(pán)中反應(yīng)孔的顏色變化出現(xiàn)不同程度的差異，因而，BIOLOG GN盤(pán)中反應(yīng)孔的顏色變化數(shù)目在一定程度上間接反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成上的差異，顏色變化孔數(shù)越多則表明土壤微生物群落種類相對(duì)就越豐富，通常把顏色變化孔數(shù)作為土壤微生物群落功能多樣性的豐富度（S）。從表3可知，添加J5菌劑能夠提高尾礦區(qū)土壤微生物群落的豐富度，而外加重金屬則明顯降低尾礦區(qū)土壤微生物群落的豐富度，表明

19、在重金屬離子脅迫下，土壤微生物對(duì)碳源的優(yōu)勢(shì)利用種類和利用程度存在差異，揭示出在污染環(huán)境中土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性發(fā)生了一定程度的變化，從而對(duì)能源碳的利用選擇發(fā)生了轉(zhuǎn)移。其中6號(hào)土添加硫酸銅和硫酸鎘后再加J5菌液，則顯色孔數(shù)最多（達(dá)80目），即微生物群落豐富度最大。說(shuō)明J5菌劑具有防止外加重金屬后導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性降低的作用，有活化土壤微生物活性和提高微生物群落豐富度的功效。細(xì)菌數(shù)量反映的是微生物群落大小，AWCD和微生物群落豐富度則是反映微生物活性及其功能多樣性，利用兩者可有效分析尾礦區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和受外源因子影響的程度。要恢復(fù)一個(gè)受擾受損的土壤生態(tài)系統(tǒng)，建立一個(gè)高質(zhì)量的健

20、康土壤生態(tài)應(yīng)該具有良好的生物活性狀況和穩(wěn)定性的微生物種群組成，不僅要恢復(fù)地上部植被，還應(yīng)考慮恢復(fù)地下部土壤微生物群落多樣性，可考慮適當(dāng)添加外源微生物菌劑加速?gòu)?fù)合重金屬污染的尾礦區(qū)生境的恢復(fù)。3 結(jié)論銅陵尾礦區(qū)三葉草復(fù)墾后的每克土壤的微生物細(xì)菌數(shù)量已達(dá)一定數(shù)目（2.3×107個(gè)），并存在耐Cu2+、Cd2+、Zn2+、Cr6+、Pb2+、Ni2+的菌株，但這些耐重金屬細(xì)菌的種類不多，主要為芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas和短桿菌屬Brevibacterium。添加的外源耐銅鎘微生物J5菌劑可以在尾礦土中定殖，并在抗性菌中占一定的優(yōu)勢(shì)。高濃度的硫酸鎘和硫酸銅降

21、低了土壤微生物群落的豐富度，而J5菌劑的添加有效提高土壤微生物對(duì)單一碳底物的利用能力，增加利用不同碳底物的微生物數(shù)量，土壤微生物群落的AWCD值變化明顯，土壤微生物活性和群落豐富度增幅顯著，有利于加速?gòu)?fù)合重金屬污染的尾礦區(qū)生境的恢復(fù)。參考文獻(xiàn)：1 田勝尼, 劉登義, 王崢?lè)? 等. 銅尾礦對(duì)5種豆科植物根系生長(zhǎng)的影響J. 生態(tài)環(huán)境, 2005, 14(2): 199203. TIAN S N, LIU D Y, WANG Z F, et al. Effects of copper tailings on the growth of roots of five legume species J.

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