微生物復(fù)習(xí)總結(jié)

1、 題型名詞解釋：裂解量 填空： 選擇題 判斷題 論述題 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題 第一節(jié)：微生物學(xué)的研究對(duì)象與任務(wù)微生物的五大特征 微生物對(duì)生命科學(xué)基礎(chǔ)理論研究的重大貢獻(xiàn) （3）微生物群體的多樣性 一、“微生物”的含義（什么是微生物） 是形體微小、單細(xì)胞或個(gè)體結(jié)構(gòu)簡單的多細(xì)胞、甚或無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物的通稱。 二、微生物特點(diǎn) 生命基本特征： 生命通過它的耐久性、適應(yīng)性、它的生長及修復(fù)的能力和它的繁殖而延續(xù)下去，這是生命的基本的和普遍的特征。新陳代謝，包括外部的和內(nèi)部的，是一切生命的另一基本特征?？刂婆c調(diào)節(jié)，是生命的又一基本特征。 1、體積小、比表面積大 大小以 um計(jì)，但比表面積（表面積/體積）大，必然有一

2、個(gè)巨大的營養(yǎng)吸收，代謝廢物排泄和環(huán)境信息接受面。 這一特點(diǎn)也是微生物與一切大型生物相區(qū)別的關(guān)鍵所在。 2、吸收多、轉(zhuǎn)化快 這一特性為高速生長繁殖和產(chǎn)生大量代謝物提供了充分的物質(zhì)基礎(chǔ)。 3、生長旺、繁殖快 極高生長繁殖速度，菌數(shù)增加，營養(yǎng)消耗，代謝積累，限制生長速度。 這一特性可在短時(shí)間內(nèi)把大量基質(zhì)轉(zhuǎn)化為有用產(chǎn)品，縮短科研周期。 也有不利一面，如疾病、糧食霉變。 4、適應(yīng)強(qiáng)、易變異 5、分布廣、種類多 分布區(qū)域廣，分布環(huán)境廣。生理代謝類型多，代謝產(chǎn)物種類多，種數(shù)多。微生物群體多樣性的表現(xiàn)物種的多樣性；生理代謝類型的多樣性；代謝產(chǎn)物的多樣性；遺傳基因的多樣性；生態(tài)類型的多樣性。： 五、微生物作用

3、1、在自然界物質(zhì)循環(huán)中作用 2、空氣與水凈化，污水處理 3、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)：菌體，代謝產(chǎn)物，代謝活動(dòng) 4、對(duì)生命科學(xué)的貢獻(xiàn) 柯赫準(zhǔn)則 1、某一種微生物，當(dāng)被懷疑是病原體時(shí)，它一定伴隨著病害而存在。 2、必須能自原寄主分離出這種微生物，并培養(yǎng)成為純培養(yǎng)。 3、用已純化的純培養(yǎng)微生物，人工接種寄主，必須能誘發(fā)與原來病害相同病害。 4、必須自人工接種發(fā)病的寄主內(nèi)，能重新分離出同一病原微生物并培養(yǎng)成純培養(yǎng)。第一章 原核微生物類群與形態(tài)結(jié)構(gòu) 細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和革蘭氏染色 各類微生物的繁殖方式和生活史(3)細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 第 1 節(jié)：細(xì)菌 細(xì)菌是單細(xì)胞的，大小在 1um左右，1000 倍以上顯微鏡才能

4、看到其形狀。 一、細(xì)菌的形態(tài)和大小 （一）、基本形態(tài)球菌，桿菌，螺旋菌，異常形態(tài) （二）細(xì)菌大小： 如何測量：顯微測微尺。細(xì)菌大小也不是一成不變的?？勺鳛榉诸愯b別標(biāo)準(zhǔn)。 二、細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu) （一） 基本結(jié)構(gòu) 1、細(xì)胞壁 cell wall：位于細(xì)胞表面，較堅(jiān)硬，略具彈性結(jié)構(gòu)。 功能：1）維持細(xì)胞外形；2）保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷和滲透壓危害；3）鞭毛運(yùn)動(dòng)支點(diǎn)；4）正常細(xì)胞分裂必需；5）一定的屏障作用；6）噬菌體受體位點(diǎn)所在。另外與細(xì)菌的抗原性、致病性有關(guān)。 革蘭氏染色 ，1884 發(fā)明（Koch 實(shí)驗(yàn)室） 染色過程： 結(jié)晶紫初染一到兩分鐘；清水沖洗，碘液媒染一到兩分鐘；清水沖洗，95%乙醇或丙酮沖洗

5、輛到三次；清水沖洗以停止洗脫，結(jié)晶紫或沙黃染液進(jìn)行復(fù)染一到兩分鐘，清水沖洗。鏡檢。（1） 革蘭氏陽性菌 細(xì)胞壁構(gòu)成：一連續(xù)層，厚 20-80nm ，兩部分：網(wǎng)狀骨架：微纖絲組成 基質(zhì)：骨架埋于基質(zhì)中 ，化學(xué)組成：主要是肽聚糖和磷壁酸 肽聚糖 (粘肽、胞壁質(zhì)) : 大分子復(fù)合體，許多亞單位交聯(lián)而成。 1）雙糖單位：N-乙酰胞壁酸（NAM）和 N-乙酰葡萄糖胺（NAG）通過 â-1，4 糖苷鍵相連而成。2）短肽：L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala 3) 肽橋：短肽之間連接。 短肽全部或部分連至 NAM 上，短肽之間也有連接，組成一網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁特有成分，也是原

6、核微生物特有成分（古生菌沒有） 磷壁酸 (垣酸) : G+特有成分。 多元醇與磷酸復(fù)合物，通過磷酸二酯鍵與 NAM 相連。 主要功能：使壁形成負(fù)電荷環(huán)境，吸附二價(jià)金屬離子，維持壁硬度和一些酶活性。還可提供噬菌體位點(diǎn)。 （2） 革蘭氏陰性菌 : 以大腸桿菌為例： 內(nèi)壁層：厚 2-3 nm，單（雙）分子層，由肽聚糖構(gòu)成。 與 G+區(qū)別：交聯(lián)低；DAP取代 L-Lys；肽橋。 外壁層：內(nèi)層：脂蛋白層，以脂類部分與肽聚糖相連。中層：磷脂層。外層：脂多糖層，外壁重要成分，8-10 nm。 脂多糖 LPS : G- 特有成分。 結(jié)構(gòu)：類脂 A + 核心多糖 + O-側(cè)鏈 功能：1）內(nèi)毒素物質(zhì)基礎(chǔ)；2）吸附

7、鎂、鈣離子；3）決定 G-表面抗原；4）噬菌體受體位點(diǎn)。 鈣離子是維持 LPS穩(wěn)定性所必需的。 （3） 細(xì)胞壁缺陷細(xì)菌 1、 原生質(zhì)體 ：人工條件下用溶菌酶除去細(xì)胞壁或用青霉素抑制細(xì)胞壁合成后，所留下的部分。一般由 G+形成。 2、 球形體 ：殘留部分細(xì)胞壁，一般由 G-形成。有一定抗性。 特點(diǎn)：對(duì)滲透壓敏感；長鞭毛也不運(yùn)動(dòng)；對(duì)噬菌體不敏感；細(xì)胞不能分裂等。 3、 細(xì)菌 L 型：一種由自發(fā)突變形成的變異型，無完整細(xì)胞壁，在固體培養(yǎng)基表面形成 “油煎蛋 ”狀小菌落。 4、 支原體：長期進(jìn)化形成。 2 細(xì)胞膜 : 在細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)之間的一層柔軟而富有彈性的半透性膜。 化學(xué)組成：蛋白和磷脂，蛋白含量

8、高達(dá) 75%，種類也多。膜不含甾醇類。 功能：1）高度選擇透性膜，物質(zhì)運(yùn)輸：2）滲透屏障，維持正常滲透壓；3）重要代謝活動(dòng)中心；4）與壁、莢膜合成有關(guān)；5）鞭毛著生點(diǎn)，供運(yùn)動(dòng)能量。 3、間體 (中質(zhì)體) : 細(xì)胞膜內(nèi)陷形成。 功能：1）擬線粒體，呼吸酶系發(fā)達(dá)。 2）與壁合成，核分裂，芽孢形成有關(guān)。 （二）特殊結(jié)構(gòu) 1、莢膜 ：某些細(xì)菌細(xì)胞壁外面覆蓋著一層疏松透明粘性物質(zhì)。厚度不同，名稱不同。 折光率低，負(fù)染法觀察。 成分：90%以上為水，余為多糖（肽）。 功能：1）抵抗干燥；2）加強(qiáng)致病力，免受吞噬；3）堆積某些代謝廢物; 4）貯存。 2、 鞭毛與菌毛鞭毛 ：某些細(xì)菌表面一種纖細(xì)呈波狀的絲狀物

9、，是細(xì)菌運(yùn)動(dòng)器官。 菌毛 ：許多G-尤其是腸道菌，表面有比鞭毛更細(xì)，數(shù)目多，短直硬的絲狀體。 3、芽孢 某些菌生長一定階段，于營養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)內(nèi)生孢子，是對(duì)不良有抗性的休眠體。每一細(xì)胞僅形成一個(gè)芽孢，所以其沒有繁殖功能。三、細(xì)菌繁殖與群體形態(tài) 1、繁殖方式：裂殖為主，少數(shù)有性接合。 2、菌落形態(tài)：菌落 ：由單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面繁殖出來的，肉眼可見的子細(xì)胞群體。 第 2 節(jié)：放線菌 ：因菌落呈放射狀而得名，是絲狀分枝細(xì)胞的細(xì)菌。 一般分布在含水量低，有機(jī)質(zhì)豐富的中性偏堿性土壤中，特殊土腥味。 大多數(shù)是腐生菌，少數(shù)寄生；多數(shù)異養(yǎng)，好氧。 突出特性是產(chǎn)各種抗生素。 一、形態(tài)與結(jié)構(gòu) 由

10、菌絲構(gòu)成，：基內(nèi)菌絲（營養(yǎng)菌絲）；氣生菌絲 孢子絲，無橫隔，仍是單細(xì)胞。 二、繁殖 ：以無性孢子為主，菌絲斷裂片段也可繁殖成新菌體。 孢子形成方式：橫隔分裂 第 3 節(jié) 藍(lán)細(xì)菌 本章小結(jié) 1. 原核生物可粗分為“三菌”和“三體”6個(gè)大類。 三菌：細(xì)菌（含古生菌），放線菌，藍(lán)細(xì)菌 三體：支原體，立克次氏體，衣原體 共同特點(diǎn)：個(gè)體微小、形態(tài)簡單、進(jìn)化地位低，基因組為原核狀態(tài) 2. 原核生物的共同特征 細(xì)胞細(xì)小、核的結(jié)構(gòu)原始，無核膜包裹，細(xì)胞壁含獨(dú)特的肽聚糖，細(xì)胞內(nèi)無細(xì)胞器分化。 3. 原核細(xì)胞的共同結(jié)構(gòu)和特殊構(gòu)造 共同結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁（支原體除外）；細(xì)胞質(zhì)膜；細(xì)胞質(zhì)；核區(qū)；各種內(nèi)含物等； 特殊構(gòu)造：糖

11、被（莢膜、粘液層）；鞭毛；菌毛；芽孢等。第二章 真核微生物的形態(tài)、構(gòu)造和功能1、教學(xué)重點(diǎn)： 酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生活史 各類真核微生物的繁殖方式和生活史 （3）酵母菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 第二節(jié)：酵母菌 yeast （一）繁殖方式 1、無性繁殖 (1)芽殖 budding：最普遍方式（過程） (2)裂殖 fission：少數(shù)（裂殖酵母） (3)無性孢子：節(jié)孢子、擲孢子、厚垣孢子。 2、有性繁殖 ： 產(chǎn)生子囊和子囊孢子。過程：質(zhì)配-核配-減數(shù)分裂 3、形成孢子條件 營養(yǎng)充足強(qiáng)壯幼齡細(xì)胞；適當(dāng)溫、濕度（25-30，80%）；空氣要流通；適當(dāng)?shù)纳咦优囵B(yǎng)基 （二）生活史 life history(life

12、 cycle) 某種生物在整個(gè)發(fā)育階段，有一個(gè)或幾個(gè)同形或不同形的個(gè)體前后相繼形成一個(gè)有規(guī)律的循環(huán)。 四種基本類型： 1、無生殖，僅有營養(yǎng)繁殖。 （細(xì)菌）2、僅有一個(gè)單倍體生活，雙倍體短。 3、僅有一個(gè)雙倍體生活，單倍體短。 4、有世代交替現(xiàn)象，單倍體有性，雙倍體無性。 酵母菌有三種類型： 單倍體型：八孢裂殖酵母，雙倍體型：路德類酵母 世代交替型：釀酒酵母 第3節(jié)：霉菌 molds 第四節(jié)、產(chǎn)大型子實(shí)體的真菌蕈菌：中國食用和藥用大型真菌 第三章 病毒 （virus）和亞病毒 （subvirus）1、 教學(xué)重點(diǎn)： 病毒的繁殖過程、病毒的溶源性和病毒的一步生長曲線 第 1 節(jié) 病毒 ：非細(xì)胞型生物

13、，有區(qū)別于細(xì)胞型特征： 特點(diǎn)：1、形體十分微小，濾過，電鏡可見； 2、無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，分子生物，由核酸和蛋白組成，且一種病毒僅含一種類型核酸； 3、專性活細(xì)胞內(nèi)寄生，有宿主專一性，無獨(dú)立代謝酶系，依賴宿主自身復(fù)制； 4、對(duì)抗生素不敏感，對(duì)干擾素敏感。 概念：病毒是超顯微的，無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，專性活細(xì)胞內(nèi)寄生，在活細(xì)胞外具一般化學(xué)大分子特征，一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞又具有生命特征。 二、繁殖（烈性噬菌體為例） 1、吸附：分兩階段。感染復(fù)數(shù) m.o.i 2、侵入：頭部 DNA通過尾管注入至細(xì)胞中，外殼留在胞外。自外裂解 3、增殖：包括 DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成。雙鏈 DNA噬菌體三階段轉(zhuǎn)錄： 遺傳信息轉(zhuǎn)移： 4、成熟

14、（裝配）：潛伏期 5、裂解（釋放）：裂解期 上述烈性噬菌體的生長方式，稱為一步生長。 裂解量：每個(gè)被感染的細(xì)菌釋放新的噬菌體的平均數(shù)。 三、噬菌體與宿主關(guān)系 1、烈性噬菌體：凡能引起宿主細(xì)胞迅速裂解的噬菌體。敏感細(xì)菌。 2、溫和性噬菌體：噬菌體侵染宿主后，并不增殖，裂解，而與宿主DNA結(jié)合，隨宿主 DNA復(fù)制而復(fù)制，此時(shí)細(xì)胞中找不到形態(tài)上可見的噬菌體，這種噬菌體稱為溫和性噬菌體。含有溫和性噬菌體的細(xì)菌稱為溶源性細(xì)菌 溫和性噬菌體存在狀態(tài) 1）游離具感染性的 virion； 2）前噬菌體（prophage）：附著或整合在宿主染色體上，一道復(fù)制； 3）營養(yǎng)期噬菌體：指導(dǎo)合成。 3、溶源性細(xì)菌特性

15、1）遺傳性 ；2）自發(fā)裂解 ；3）誘發(fā)裂解：雙氧水、UV、X、等；4）免疫性 ；5）復(fù)愈（消失溶源性） ；6）溶源轉(zhuǎn)變 怎樣證實(shí)有噬菌體存在：宿主特異性；噬菌斑、液體培養(yǎng)變清等。 1、雙層平板法 ；2、單層平板法 ；3、玻片快速法 第 2 節(jié)、亞病毒 1、類病毒 ：沒有衣殼包裹的 RNA分子。 2、擬病毒 (類類病毒）：一類包括在植物病毒粒子中的類病毒，RNA。 3、朊病毒 ：一類能侵染動(dòng)物并在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的小分子無免疫性的疏水性蛋白。 噬菌體效價(jià)的測定方法。 第四章 微生物營養(yǎng)和培養(yǎng)基教學(xué)重點(diǎn)： 微生物的營養(yǎng)類型的特點(diǎn)及多樣性微生物進(jìn)入細(xì)胞的方式 （3）微生物進(jìn)入細(xì)胞的方式 營養(yǎng)物：必須得

16、到的細(xì)胞結(jié)構(gòu) 成分，必須得到的能量儲(chǔ)存物質(zhì)。 營養(yǎng)：把營養(yǎng)物從外界吸收至細(xì)胞內(nèi)，復(fù)制出新細(xì)胞結(jié)構(gòu)的過程。 二、主要營養(yǎng)物及其功能 主要功能：提供合成原生質(zhì)和代謝產(chǎn)物原料；產(chǎn)生合成反應(yīng)及生命活動(dòng)所需能量；調(diào)節(jié)新陳代謝。 （一）碳源物質(zhì) 定義：凡能提供微生物營養(yǎng)所需碳元素的營養(yǎng)源。功能：碳源、能源 （二）氮源物質(zhì) 定義：凡能提供微生物營養(yǎng)所需氮元素的營養(yǎng)源。 功能：氮源，一般不作能源。 微生物氮源譜： 氨基酸自養(yǎng)型和異養(yǎng)型生物 速效氮源和遲效氮源 ； （三）能源 化學(xué)能：有機(jī)物-化能異養(yǎng)微生物 ；無機(jī)物 -化能自養(yǎng)微生物 ；光能 （四）生長因子 定義：一類對(duì)微生物正常代謝必不可少且又不能從簡單的碳

17、、氮源自行合成的所需極微量的有機(jī)物。 種類：維生素、AA、base、FA等。 作用：輔酶或酶活化 來源：酵母膏、玉米漿、麥芽汁等，復(fù)合維生素。 （五）無機(jī)鹽 所需濃度在 10-3-10-4M 的元素為大量元素 所需濃度在 10-6-10-8M 為微量元素。 主要功能：構(gòu)成菌體成分；酶活性基組成或維持酶活性；調(diào)節(jié)滲透壓、pH、Eh； （六）水 ：存在狀態(tài)：游離態(tài)（溶媒）和結(jié)合態(tài)（結(jié)構(gòu)組成） 第 2 節(jié)：微生物營養(yǎng)類型 光能自養(yǎng)型，光能異養(yǎng)型，化能自養(yǎng)型，化能異養(yǎng)型 其中，化能異養(yǎng)型又據(jù)利用有機(jī)物特性，分成腐生和寄生。 營養(yǎng)類型劃分不是絕對(duì)的，不同生活條件下，可相互轉(zhuǎn)變。 第 3 節(jié)：營養(yǎng)物吸收與

18、代謝物分泌 營養(yǎng)物吸收至胞內(nèi)被利用，代謝物分泌到胞外以免積累，這就是物質(zhì)運(yùn)輸過程。 一般大分子：先水解為小分子，再吸收；脂溶性物質(zhì)：易透過 ；離子化合物：弱快強(qiáng)慢（極性） 一、營養(yǎng)物吸收 1、單純擴(kuò)散 依靠胞內(nèi)外溶液濃度差，順濃度梯度運(yùn)輸，不消耗代謝能，無特異性。水、二氧化碳、氧氣、甘油、乙醇等。 2、促進(jìn)擴(kuò)散 借助載體蛋白順濃度梯度運(yùn)輸，不耗能，有特異性。載體蛋白（滲透酶）有底物特異性，是誘導(dǎo)產(chǎn)生的。硫酸根、磷酸根、糖（真核） 3、主動(dòng)運(yùn)輸 ：吸收營養(yǎng)物的主要機(jī)制。 逆濃度梯度運(yùn)輸，耗能，需載體蛋白，有特異性。氨基酸、乳糖等糖類、鈉、鈣等無機(jī)離子。 親和力改變蛋白構(gòu)象改變耗能 4、基團(tuán)轉(zhuǎn)位

19、屬主動(dòng)運(yùn)輸，但溶質(zhì)分子發(fā)生化學(xué)修飾-定向磷酸化。主要依賴磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）。 第 4 節(jié)：培養(yǎng)基 ：選用各種營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)人工配制用來培養(yǎng)微生物的基質(zhì)。 第五章 微生物代謝 1、 教學(xué)重點(diǎn)： 微生物的分解代謝和合成代謝 微生物的代謝調(diào)控 分解代謝：復(fù)雜營養(yǎng)物分解為簡單化合物（異化作用）。 合成代謝：簡單小分子合成為復(fù)雜大分子（同化作用） 初級(jí)和次級(jí)代謝：依據(jù)代謝產(chǎn)物在微生物中作用不同，又有初級(jí)代謝和次級(jí)代謝。 初級(jí)代謝：能使?fàn)I養(yǎng)物轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)物質(zhì)、具生理活性物質(zhì)或提供生長能量的一類代謝。產(chǎn)物有小分子前體物、單體、多聚體等生命必需物質(zhì)。 次級(jí)代謝：某些微生物中并在一

20、定生長時(shí)期出現(xiàn)的一類代謝。產(chǎn)物有抗生素、酶抑制劑、毒素、甾體化合物等，與生命活動(dòng)無關(guān)，不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也不是酶活性必需，但對(duì)人類有用。 二者關(guān)系：先初后次，初級(jí)形成期也是生長期，只有大量生長，才能積累產(chǎn)物。 1、發(fā)酵（分子內(nèi)呼吸） 無氧條件下，底物脫氫后產(chǎn)生的還原力不經(jīng)呼吸鏈而直接傳遞給某一中間代謝物的低效產(chǎn)能反應(yīng)。 在此過程中，有機(jī)物是氧化基質(zhì)，又是最終氫受體，且是未徹底氧化產(chǎn)物，結(jié)果仍積累有機(jī)物，產(chǎn)能少。 在發(fā)酵過程中，借底物水平磷酸化合成 ATP，是合成 ATP唯一方式。 XP + ADP ATP + X 高能化合物：1 ，3- 二磷酸甘油酸、乙酰磷酸、氨甲酰磷酸、PEP、 酰基輔酶 A

21、。 三、氮類物質(zhì)合成 （一）生物固氮 分子 N2 通過固氮微生物作用形成 NH3 的過程。 1、固氮微生物 （都是原核微生物） 自生固氮菌：好氧、厭氧、兼性厭氧及各種營養(yǎng)類型。 共生固氮菌：與豆科共生為根瘤菌，與非豆科共生是放線菌。 聯(lián)合固氮菌：根際、葉面微生物。 第 4 節(jié)：代謝調(diào)控 代謝生化反應(yīng)酶催化基因編碼基因調(diào)控 環(huán)境因子影響 環(huán)境調(diào)控 代謝調(diào)節(jié)部位：真核和原核 合成調(diào)節(jié)：誘導(dǎo)合成、終產(chǎn)物阻遏、分解代謝物阻遏 酶活性調(diào)節(jié)：反饋（終產(chǎn)物）抑制、酶活性共價(jià)修飾 第六章 微生物生長 1、 教學(xué)重點(diǎn)： 微生物群體生長的規(guī)律及其在生長實(shí)踐中的應(yīng)用 ：（2）測定微生物群體生長的方法（3）溫度、PH

22、值和氧等環(huán)境因素對(duì)微生物的影響 繁殖：單細(xì)胞-由于細(xì)胞分裂引起個(gè)體數(shù)目的增加。多細(xì)胞-通過無性或有性孢子使個(gè)體數(shù)目增加的過程。 發(fā)育：適合條件下，生長與繁殖始終是交替進(jìn)行的，從生長到繁殖是一個(gè)由量變到質(zhì)變的過程，這個(gè)過程稱為發(fā)育。 第 1 節(jié)：微生物的發(fā)育周期 一、概念 發(fā)育周期、單細(xì)胞微生物、絲狀真菌 二、發(fā)育周期中細(xì)胞學(xué)上變化 1、細(xì)胞壁與質(zhì)膜的延伸 2、DNA的復(fù)制 第 2 節(jié)：微生物純培養(yǎng)的生長 一、純培養(yǎng)的分離方法 表 二、生長測定（適用、注意事項(xiàng)） 直接計(jì)數(shù)法（全數(shù)） 間接計(jì)數(shù)法（活菌數(shù)） 測細(xì)胞物質(zhì)量 三、細(xì)菌純培養(yǎng)群體生長規(guī)律 將少量純培養(yǎng)接種到一恒定體積的新鮮液體培養(yǎng)基中，適

23、宜條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測定細(xì)菌含量，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)，得繁殖曲線，對(duì)單細(xì)胞而言，又稱生長曲線。 根據(jù)生長速率不同，分為幾個(gè)時(shí)期。 （一）延遲期 (停滯期、調(diào)整期） 表現(xiàn)：不立即繁殖，生長速率近于 0，菌數(shù)幾乎不變，細(xì)胞形態(tài)變大。 特點(diǎn)：分裂遲緩，合成代謝活躍，體積增長快，對(duì)外界不良環(huán)境敏感。 原因：調(diào)整代謝，合成新的酶系和中間代謝產(chǎn)物以適應(yīng)新環(huán)境。 消除：增加接種量；采用最適菌齡接種；培養(yǎng)基成分（種子、發(fā)酵） （二）對(duì)數(shù)期 表現(xiàn)：代謝活性最強(qiáng)，幾何級(jí)數(shù)增加，代時(shí)最短，生長速率最大。 特點(diǎn)：細(xì)菌數(shù)目增加與原生質(zhì)總量增加，與菌液濁度增加呈正相關(guān)性。 代時(shí) ：單

24、個(gè)細(xì)胞完成一次分裂所需時(shí)間，亦即增加一代所需時(shí)間。 影響 G因素：菌種、營養(yǎng)成分、營養(yǎng)物濃度（很低時(shí)影響）、培養(yǎng)溫度。 （三）穩(wěn)定期 (最高生長期、靜止期） 表現(xiàn)：新增殖細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，活菌數(shù)動(dòng)態(tài)平衡。 特點(diǎn)：生長速率又趨于 0，細(xì)胞總數(shù)最高。 原因：養(yǎng)分減少；有毒代謝物產(chǎn)生。 穩(wěn)定期細(xì)胞內(nèi)開始積累貯存物，此階段收獲菌體，也是發(fā)酵過程積累代謝產(chǎn)物的重要階段。 延長：補(bǔ)料，調(diào) pH、溫度等。 此時(shí)，菌體總數(shù)量與所消耗的營養(yǎng)物之間存在一定關(guān)系，稱為產(chǎn)量常數(shù)（生長效率） 。Y = X - X0 /C 其中 X-穩(wěn)定期細(xì)胞干重/ml， X0 -接種時(shí)干重/ml，C-限制性營養(yǎng)物濃度。

25、根據(jù)這一原理，可進(jìn)行生物測定。 將未知混合物加到只缺乏特定限制性營養(yǎng)物的完全培養(yǎng)基中，測定培養(yǎng)基所能達(dá)到的生長量，就可以計(jì)算出原混合物中特定限制性營養(yǎng)物的濃度。 （四）衰亡期 表現(xiàn)：出現(xiàn) “負(fù)生長 ”，有些細(xì)胞開始自溶。 對(duì)于絲狀真菌，細(xì)胞數(shù)目不呈幾何級(jí)數(shù)增加，無對(duì)數(shù)生長期，一般有調(diào)整期，最高生長期，衰退期。 四、連續(xù)培養(yǎng) continuous cultivation 分批培養(yǎng) ：將微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲。 若不斷補(bǔ)充新鮮營養(yǎng)，并及時(shí)不斷以同樣速度排出培養(yǎng)物，則可延長對(duì)數(shù)期。 只要培養(yǎng)液的流動(dòng)量能使增殖的新菌數(shù)相當(dāng)于流出的老菌數(shù)，就可保證總菌量不變，此即連續(xù)培

26、養(yǎng)原理。 主要參數(shù)：D（稀釋率）=F（流動(dòng)速率）/V（容積） 連續(xù)培養(yǎng)方法 1、恒濁連續(xù)培養(yǎng) turbidostat 不斷調(diào)節(jié)流速使培養(yǎng)液濁度保持恒定。 適用：收獲菌體及與菌體相平行的產(chǎn)物。 2、恒化連續(xù)培養(yǎng) chemostat 恒定流速，及時(shí)補(bǔ)充營養(yǎng)，營養(yǎng)物濃度基本恒定，從而保持恒定生長速率。又稱恒組成連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分中，必須將某種必需的營養(yǎng)物控制在較低的濃度，以作為限制性因子，而其它營養(yǎng)物過量。常用的有氨、氨基酸、葡萄糖、生長因子、無機(jī)鹽等。 適用；科研 五、同步生長 synchronous growth 概念：使所有的細(xì)胞都能處于同一生長階段，同時(shí)分裂的生長方式。 同步培養(yǎng)法獲得：

27、（一）機(jī)械法（選擇法） 1、離心沉降分離法 2、過濾分離法 3、硝酸纖維素薄膜法 （二）調(diào)整生理?xiàng)l件法（誘導(dǎo)法） 1、溫度調(diào)整法：亞適生長溫度->最適生長溫度培養(yǎng)。 2、營養(yǎng)條件調(diào)整法：控制濃度或組成，使細(xì)胞只能進(jìn)行一次分裂。 3、用穩(wěn)定期的培養(yǎng)物接種：穩(wěn)定期細(xì)胞處于衰老狀態(tài)，移入新鮮培養(yǎng)基，可得同步生長。 （三）抑制 DNA合成法 DNA合成是細(xì)胞分裂前提。抑制一段時(shí)間再解除抑制。 第 3 節(jié)：環(huán)境條件對(duì)生長影響 一、溫度 最低、最適、最高生長溫度，致死溫度。 二、pH 主要影響：引起膜電荷變化，從而影響營養(yǎng)吸收；影響酶活性；改變營養(yǎng)物狀態(tài)和有害物毒性。 有最適 pH，此時(shí)酶活性最高，

28、其他條件適合，生長速率最高，但不是生產(chǎn)的最適 pH。 微生物細(xì)胞內(nèi)的 pH多接近于中性。 第 4 節(jié) 微生物培養(yǎng)法概論 一個(gè)良好的微生物培養(yǎng)裝置的基本條件是：按微生物的生長規(guī)律進(jìn)行科學(xué)的設(shè)計(jì)，能在提供豐富而均勻營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，保證微生物獲得適宜的溫度和良好通氣條件（只有少數(shù)厭氧菌例外），此外，還要為微生物提供一個(gè)適宜的物理化學(xué)條件和嚴(yán)防雜菌的污染等。 微生物的培養(yǎng)方法可分為八個(gè)大類（一）固體培養(yǎng)法 1. 好氧菌的固體培養(yǎng) 試管斜面（test-tube slant） 培養(yǎng)皿瓊脂平板（agar plate） 2. 厭氧菌的固體培養(yǎng) 厭氧菌固體培養(yǎng)的具體方法 （1）高層瓊脂柱 （2）厭氧培養(yǎng)皿 （

29、3）亨蓋特滾管技術(shù) （4）厭氧罐 （5）厭氧手套箱 （二）液體培養(yǎng)法 1.好氧菌的液體培養(yǎng) 大多數(shù)微生物都是好氧菌，微生物一般只能利用溶于水中的氧，要保證在培養(yǎng)液中始終有較高的溶解氧濃度。 一般情況下（1 大氣壓， 20 ）下，氧在水中的溶解度僅為 6.2mlL（0.28mmol），這些氧只能保證氧化 8.3mg （即 0.046mmol）葡萄糖，僅相當(dāng)培養(yǎng)基中常用葡萄糖濃度的 1。氧的供應(yīng)始終是好氧菌生長、繁殖中的限制因子。 一般可通過增加液體與氧的接觸面積或提高氧分壓來提高溶氧速率，具體措施有： 淺層液體靜止培養(yǎng)； 將三角瓶內(nèi)培養(yǎng)物利用往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式搖床（shaker）作搖瓶培養(yǎng) 在深層液

30、體培養(yǎng)器的底部通入加壓空氣，并用氣體分布器使其均勻、密集的微小氣泡； 對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行機(jī)械攪拌，并在培養(yǎng)器的壁上設(shè)置阻擋裝置等。 實(shí)驗(yàn)室中常用的好氧菌培養(yǎng)法 （1）試管液體培養(yǎng) （2）三角瓶淺層液體培養(yǎng) （3）搖瓶培養(yǎng) （4）臺(tái)式發(fā)酵罐 2.厭氧菌的液體培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)室中對(duì)厭氧菌進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)，保證培養(yǎng)基的氧化還原電位（Eh）降至-150mV-420mV ，以適合嚴(yán)格厭氧菌的生長。 二、生產(chǎn)實(shí)踐中培養(yǎng)微生物的裝置 （一）固體培養(yǎng)法 1. 好氧菌的曲法培養(yǎng) 原始的曲法培養(yǎng)就是將麩皮、碎麥或豆餅等固態(tài)基質(zhì)經(jīng)蒸煮和自然接種后，薄薄的鋪在培養(yǎng)容器表面，使微生物既可獲得充足的氧氣，又可利于散發(fā)熱量，對(duì)真菌來說，

31、還十分有利于產(chǎn)生大量孢子。 2.厭氧菌的堆積培養(yǎng)法 生產(chǎn)實(shí)踐上對(duì)厭氧菌進(jìn)行大規(guī)模固體培養(yǎng)的例子還不多見。在白酒生產(chǎn)中，一向用大型深層地窖對(duì)固態(tài)發(fā)酵料進(jìn)行堆積式固態(tài)發(fā)酵，這對(duì)酵母菌的酒精發(fā)酵和己酸菌的己酸發(fā)酵等都十分有利，可生產(chǎn)名優(yōu)大曲酒（蒸餾白酒）。 （二）液體培養(yǎng)法 1.好氧菌的培養(yǎng) 淺盤培養(yǎng) ；深層液體通氣培養(yǎng) （1）高層瓊脂柱 把含有還原劑的固體或半固體培養(yǎng)基裝入試管中，經(jīng)滅菌后，除表層上有一些溶解氧外，越是深層，其氧化還原勢(shì)越低，故有利于厭氧菌的生長。 例如，韋榮氏管（Veillon tube）是由一根長 25cm、內(nèi)徑 1cm，兩端可用橡皮塞封閉的玻璃管，可作稀釋、分離厭氧菌并對(duì)其進(jìn)

32、行菌落計(jì)數(shù)。 （2）厭氧培養(yǎng)皿 利用特制皿底有兩個(gè)相互隔開的空間，其一放焦性沒食子酸，另一則放 NaOH溶液，待在皿蓋平板上接入待培養(yǎng)的厭氧菌后，立即密閉之，經(jīng)搖動(dòng)，使兩試劑接觸而發(fā)生吸氧反應(yīng)，從而造成無氧環(huán)境， （3）亨蓋特滾管技術(shù)（hungate roll-tube technique） 由著名美國微生物學(xué)家 R.E.Hungate 于 1950 年分離瘤胃微生物和產(chǎn)甲烷菌等嚴(yán)格厭氧菌時(shí)設(shè)計(jì)的一種具有劃時(shí)代意義的嚴(yán)格厭氧技術(shù)亨蓋特滾管技術(shù) 。 （4）厭氧罐（anaerobic jar） 這是一種常規(guī)的但不很嚴(yán)格的厭氧菌培養(yǎng)技術(shù)，原因是它除能保證厭氧菌在培養(yǎng)過程中處于良好的無氧環(huán)境外，無法使

33、培養(yǎng)基配制、接種、觀察、分離、保藏等操作也不接觸氧氣。 （5）厭氧手套箱（anaerobic glove box） 一種用于操作、培養(yǎng)和研究嚴(yán)格厭氧菌用的箱形裝置，其內(nèi)充滿氮?dú)?、二氧化碳和氫氣氣體，有兩個(gè)塑料手套用于操作，箱內(nèi)設(shè)有接種、除氧和培養(yǎng)等設(shè)備。 （1）試管液體培養(yǎng) 裝液量可多可少。此法的通氣效果不夠理想，僅適合培養(yǎng)兼性厭氧菌。 （2）三角瓶淺層液體培養(yǎng) 在靜止?fàn)顟B(tài)下，三角瓶內(nèi)的通氣狀況與其中裝液量和棉塞通氣程度對(duì)微生物的生長速度和生長量有很大的關(guān)系。此法一般也僅適宜培養(yǎng)兼性厭氧菌。 （3）搖瓶培養(yǎng) 又稱振蕩培養(yǎng)，一般將三角瓶內(nèi)培養(yǎng)液的瓶口用 8 層紗布包扎，以利通氣和防止雜菌污染，同

34、時(shí)減少瓶內(nèi)裝液量，把它放到往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式搖床上作有節(jié)奏的振蕩，以達(dá)到提高溶氧量的目的。此法是荷蘭的 A. J. Kluyver 等在1933 年最早試用，目前廣泛地用于菌種的篩選以及進(jìn)行生理、生化發(fā)酵和生命科許多領(lǐng)域的研究工作。 （4）臺(tái)式發(fā)酵罐（benchtop fermentor） 這是一種利用現(xiàn)代高科技制成的實(shí)驗(yàn)室研究用的發(fā)酵罐，體積一般為數(shù)升至數(shù)十升，有良好的通氣、攪拌及其他各種必要裝置，并有多種傳感器（sensor） 、自動(dòng)記錄和用計(jì)算機(jī)的調(diào)控裝置?，F(xiàn)成的商品種類很多，應(yīng)用較為方便。 （1）淺盤培養(yǎng)（shallow pan cultivation） 這是一種用大型的盤子對(duì)好氧菌進(jìn)行淺

35、層液體靜止培養(yǎng)的方法。在早期青霉素和檸檬酸等發(fā)酵中，均使用過淺盤培養(yǎng)。 缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)效率低和產(chǎn)品易污染等，難以推廣。 （2）深層液體通氣培養(yǎng) 這是一類應(yīng)用大型發(fā)酵罐進(jìn)行深層液體通氣攪拌的培養(yǎng)技術(shù)，它的發(fā)明在微生物培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展史上具有革命性的意義，并成為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的標(biāo)志。 發(fā)酵罐（fermenter或 fermentor）是一種最常規(guī)的生物反應(yīng)器（bioreactor），一般是鋼質(zhì)圓筒形直立容器，其底和蓋為扁球形的，高與直徑之比一般為 122.5。容積可大可小，大型發(fā)酵罐的容積在 50500m3，最大的為英國用于甲醇蛋白生產(chǎn)的巨型發(fā)酵罐，其有效容積達(dá) 1500m3。 發(fā)酵罐的主要作用

36、是要為微生物提供豐富而均勻的養(yǎng)料，良好的通氣和攪拌，適宜的溫度和酸堿度，并能確保防止雜菌的污染。為此，除了罐體有合理的結(jié)構(gòu)（圖 7-17）外，還要有一套必要的附屬裝置，例如培養(yǎng)基配制系統(tǒng)，蒸氣滅菌系統(tǒng)，空氣壓縮和過濾系統(tǒng)，以及發(fā)酵產(chǎn)物的后處理系統(tǒng) 第 5 節(jié)：滅菌與消毒 滅菌 sterilization ：殺死所有微生物。 消毒 disinfection ：殺死一切病原微生物。 防腐 antisepsis：利用理化因素抑制微生物生長繁殖。 化療 chemotherapy：利用具有選擇毒性化學(xué)藥物或抗生素來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達(dá)到治療的一種措施。 一、常用滅菌消毒方法 1、干熱

37、滅菌法 ：火焰滅菌（灼燒滅菌）、干熱滅菌 2、濕熱滅菌 ：巴氏消毒、煮沸消毒、高壓蒸汽滅菌、間歇加熱滅菌、實(shí)罐滅菌 3、過濾除菌 4、放射線滅菌 二、抗生素 作用范圍：抗菌譜 1、抑制細(xì)胞壁合成：青霉素，多氧霉素 2、影響細(xì)胞膜功能：多肽類，多烯類 3、干擾蛋白合成：抑制而非殺死 4、阻礙核酸合成：對(duì)細(xì)胞有毒 第七章 微生物遺傳變異和育種教學(xué)難點(diǎn)： 微生物基因突變的特點(diǎn)和基因重組和雜交育種 遺傳 heredity親代將其特有的生物學(xué)特性傳遞給子代。 遺傳性子代總保持與親代相同的生物學(xué)特性。 遺傳型 genotype生物體所具有的全套遺傳物質(zhì)總稱。又稱基因型。 表型 phenotype特定環(huán)境中

38、生物體表現(xiàn)出的種種形態(tài)與生理特征。 變異 variation 遺傳型的改變。 適應(yīng)或飾變 modification表型的改變。 基因指帶有足以決定一個(gè)蛋白質(zhì)全部組成所需信息的最短 DNA片段。 微生物在遺傳上特點(diǎn)： 1、微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。 2、很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。 3、對(duì)環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強(qiáng)。大多是無性生殖，變異易保留。 第 1 節(jié)：遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) 一、證明經(jīng)典實(shí)驗(yàn) （一）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) （二）噬菌體 T2 的感染實(shí)驗(yàn) （三）病毒拆開與重建實(shí)驗(yàn) 二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中存在方式 （一）細(xì)胞水平 （二）核水平

39、 （三）染色體水平 （四）核酸水平 （五）基因水平 （六）密碼子水平 （七）核苷酸水平（最低突變或交換單位） 染色體外遺傳物質(zhì)質(zhì)粒 ：染色體外，獨(dú)立存在的，能自主復(fù)制的遺傳物質(zhì)。 雙股環(huán)狀 DNA，可游離存在，也可整合到宿主 DNA上。 吖啶類染料、高溫、某些離子作用可消除質(zhì)粒。 附加體 episome：質(zhì)粒插入到染色體上和染色體一起復(fù)制。 質(zhì)粒種類 1、F 因子（致育因子）：大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，含質(zhì)粒為 F+（）；無質(zhì)粒為 F-（）；質(zhì)粒DNA整合到染色體上為 Hfr. 2、R 因子（耐藥性）：痢疾桿菌，多價(jià)耐藥性，耐藥信息攜帶在質(zhì)粒上。 3、Col 因子（大腸桿菌素產(chǎn)生因子） 4、青霉素酶質(zhì)粒

40、 5、Ti 質(zhì)粒（誘癌質(zhì)粒）：植物根癌，植物基因工程重要載體。 6、降解質(zhì)粒：Pseudomonas 隱蔽質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒、分泌質(zhì)粒等。 第 2 節(jié)：基因突變 突變 遺傳物質(zhì)核酸中的核苷酸順序突然發(fā)生了可遺傳的變化。 包括：基因突變（點(diǎn)突變）由于 DNA鏈上的一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基發(fā)生改變而引起。 染色體畸變DNA 的大段變化現(xiàn)象，表現(xiàn)為插入、缺失、重復(fù)、易位、倒位。 由于重組或附加體等外源遺傳物質(zhì)的整合而引起的 DNA改變，不屬突變范圍。 一、基因突變 （一）類型 按突變體 mutant 表型 特征不同 1、形態(tài)突變型：細(xì)胞或菌落形態(tài)改變。 2、生化突變型：代謝途徑變異 營養(yǎng)缺陷型由基因突變引起某

41、酶合成能力喪失，必須在原有培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能生長。 抗性突變型能抵抗有害理化因素，包括抗藥性、抗噬菌體等。 抗原突變型細(xì)胞成分尤其是表面成分的細(xì)致變異。 3、致死突變型：基因突變導(dǎo)致個(gè)體死亡。 4、條件致死突變型：在某一條件下呈現(xiàn)致死效應(yīng)，如溫度敏感突變型。 如果從研究者能否從巨大群體中迅速檢測和分離出個(gè)別突變體的目的來看，則只有兩類突變： 選擇性突變具有選擇性標(biāo)記，可通過某種環(huán)境條件使它們得到優(yōu)勢(shì)生長，從而取代原始菌株。 非選擇性突變無選擇性標(biāo)記，而只有一些性狀的數(shù)量差別，如菌落大小、顏色深淺、代謝物產(chǎn)量等。 （二）特點(diǎn) 1、不對(duì)應(yīng)性： 突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對(duì)應(yīng)關(guān)

42、系。 相應(yīng)的環(huán)境僅起著淘汰原有非突變型個(gè)體的作用，如果說其有誘變作用，也可以誘發(fā)任何性狀的變異，而不是專一性地誘發(fā)一種變異。 2、自發(fā)性： 各種突變可以在沒有人為的誘變因素下自發(fā)發(fā)生。 3、稀有性： 自發(fā)突變頻率較低，一般 10-610-9 。 突變率 每個(gè)細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率?；蛎繂挝蝗后w在繁殖一代過程中形成的突變體的數(shù)目。 一個(gè)細(xì)胞長大分裂成兩個(gè)細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞世代。 4、獨(dú)立性： 突變的發(fā)生一般是獨(dú)立的，某一基因的突變，既不提高也不降低其他基因的突變率。突變不僅對(duì)某一細(xì)胞是隨機(jī)的，而且對(duì)某一基因也是隨機(jī)的。 5、誘變性： 誘變劑作用可提高突變率。 6、穩(wěn)定性： 遺傳物

43、質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生的穩(wěn)定變化，因而產(chǎn)生的新性狀也是穩(wěn)定的，可遺傳的。 7、可逆性 （三）自發(fā)性與不對(duì)應(yīng)性的證明 突變是通過適應(yīng)而產(chǎn)生的，突變的原因與性狀間是相對(duì)應(yīng)的。 突變是自發(fā)的，與環(huán)境是不相對(duì)應(yīng)的。 1、變量試驗(yàn)（1943，Luria & Delbruck） 實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)： 結(jié)果：甲各皿抗性菌落數(shù)相差較大，乙各皿數(shù)基本相同。 說明：抗性突變不是由噬菌體誘導(dǎo)出來的。 如果是噬菌體誘導(dǎo)的話，結(jié)果會(huì)怎樣？ 突變發(fā)生在什么時(shí)間？ 噬菌體起什么作用？ 2、涂布試驗(yàn)（1949，Newcombe 設(shè)計(jì)） 實(shí)驗(yàn)要點(diǎn) 說明：抗性突變發(fā)生在未接觸噬菌體之前，噬菌體加入只起篩選作用。 如果不是這樣，結(jié)果會(huì)怎樣？ 3

44、、影印培養(yǎng)試驗(yàn)（1952，Lederberg設(shè)計(jì)） 影印培養(yǎng)法使在一系列培養(yǎng)皿相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法。 利用此法可以從在非選擇性條件下生長的群體中，分離出各類突變體。 實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)： 結(jié)果：3 上出現(xiàn)抗性菌落，在 2 上找出相應(yīng)菌落接種到含藥平板上，長出抗性菌落。而取與3 上無對(duì)應(yīng)關(guān)系的菌落接種到含藥平板上則無生長。 （四）突變機(jī)制 1、誘變機(jī)制 induce mutation , mutagen 1）堿基對(duì)置換（點(diǎn)突變） ：只涉及一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換，分為轉(zhuǎn)換和顛換。 2）移碼突變 由一種誘變劑引起 DNA 分子中一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸的增添或缺失，從而使該部位后面的全部

45、密碼的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯發(fā)生錯(cuò)誤。也屬于 DNA 分子的微小損傷。 3）染色體畸變 ：DNA分子大的損傷。 4）轉(zhuǎn)座因子 transposible element 。 在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段 DNA序列稱作轉(zhuǎn)座因子。 2、自發(fā)突變機(jī)制：指微生物在沒有人工參與下發(fā)生的突變。 1）背景輻射和環(huán)境因素的誘變：低劑量長期效應(yīng)。輻射、高溫、低濃度誘變劑。 2）自身代謝產(chǎn)物的誘變：H2O2內(nèi)源誘變劑。 3）互變異構(gòu)效應(yīng)： 4）環(huán)出效應(yīng)：DNA 復(fù)制過程中偶爾環(huán)出。 （五）紫外線對(duì) DNA的損傷及機(jī)體對(duì)損傷 DNA 的修復(fù) 紫外線作用：同鏈 DNA 的相鄰 T 間形成共價(jià) T二聚體，阻礙堿基間

46、正常配對(duì)，從而引起突變或死亡。 機(jī)體對(duì)損傷 DNA的修復(fù)： 1、光復(fù)活作用：經(jīng) UV照射后的微生物暴露于可見光下，可明顯降低起死亡率，此稱光復(fù)活作用。 2、暗修復(fù)作用（切補(bǔ)修復(fù)）：與光無關(guān)，須4種酶參與：核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶。 第 3 節(jié)：突變與育種 菌種工作包括三方面：選種、育種、復(fù)壯和保藏。 選種從自然界和生產(chǎn)中選擇符合需要菌種。 育種進(jìn)一步提高已有菌種某種性能，使更符合要求。 選育新菌種可從幾方面著手： 1）從原有菌株入手進(jìn)行各種遺傳改造工作。 2）根據(jù)文獻(xiàn)資料報(bào)導(dǎo)的微生物種屬，向國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)索取同種或同屬菌株，從中尋求符合要求者。 3）根據(jù)所需菌種特

47、性、嗜好或工藝要求，從特定的生態(tài)環(huán)境中以特定方法重新分離自然菌株。 （二）自發(fā)突變與育種 （三）誘變育種 利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變率大幅度提高，然后設(shè)法采用簡便、快速、高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合目的的突變株，以供生產(chǎn)科研之用。 基本工作步驟： 原種 （出發(fā)菌株） 純化斜面同步培養(yǎng)離心洗滌振蕩打散過濾菌懸液 誘變處理 平板分離 斜面 斜面 斜面 保藏及擴(kuò)大試驗(yàn) （活菌計(jì)數(shù)） （計(jì)數(shù)） （變異率）（初篩） （復(fù)篩） （再復(fù)篩） 一、出發(fā)菌株的選擇 用作出發(fā)菌株有：野生型菌株；生產(chǎn)菌株；經(jīng)過誘變的菌株。 一般要求生長快，營養(yǎng)要求粗放，發(fā)育早，產(chǎn)孢子多，對(duì)誘變劑

48、敏感性高，已能積累少量產(chǎn)品或前體物的菌株。 二、菌懸液制備 一般采用單孢子或單細(xì)胞懸液。 誘變劑一般只作用與 DNA的一條鏈，發(fā)生變異無法反映在當(dāng)代表型上，只有經(jīng)過 DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才會(huì)使表型發(fā)生變異，此即表型延遲。 制備菌懸液時(shí)要注意生理狀態(tài)、均一性、細(xì)胞濃度、菌懸液介質(zhì)（生理鹽水或緩沖液）。 三、誘變處理 1、常用誘變劑： 物理誘變劑：紫外線（UV）、X射線、r射線、快中子（0.2-10Mev）。 化學(xué)誘變劑：硫酸二乙酯 DES，甲基磺酸乙酯 EMS，亞硝基胍 NTG。 2、誘變劑量： 誘變劑作用：提高突變率；擴(kuò)大產(chǎn)量變異幅度；使變異朝正變或負(fù)變方向移動(dòng)。 凡是在高誘變率基礎(chǔ)上，既

49、能擴(kuò)大變異幅度，又能使變異移向正變范圍的劑量就是合適劑量。3、處理方法： 采用復(fù)合處理，包括誘變劑先后使用，同時(shí)使用和重復(fù)使用，提高效果。 四、變異菌株的分離和篩選 ：誘變處理后一般要經(jīng)過后培養(yǎng)和變異株篩選。 高效篩選方案： 尋找利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與生產(chǎn)性狀間的相關(guān)性。 篩選抗生素生產(chǎn)菌時(shí)，可采用瓊脂塊培養(yǎng)法：圖 8-22 （四）營養(yǎng)缺陷型篩選 基本培養(yǎng)基（MM，）：凡能滿足某一菌種野生型和原養(yǎng)型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的組合培養(yǎng)基。 完全培養(yǎng)基（CM，+）：在基本培養(yǎng)基中加入一些富含生長因子的物質(zhì)，以滿足該微生物各種營養(yǎng)缺陷型要求。 補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM，X）：在基本培養(yǎng)基中有針對(duì)性地加上某一種

50、或幾種其自身不能合成的成分，以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基。 營養(yǎng)缺陷型表示：所要求的營養(yǎng)物的頭三個(gè)字母表示，如 bio-，對(duì)應(yīng)的野生型 以 bio+表示。 一般步驟： 1、誘變處理 2、淘汰野生型：抗生素法、菌絲過濾法。 3、檢出缺陷型：1）夾層培養(yǎng)法： 2）限量補(bǔ)充培養(yǎng)法：含微量蛋白胨（0.01%）的一上。 3）逐個(gè)檢出法：分別接種到和+上。 4）影印接種法：+培養(yǎng)，影印至上。 4、鑒定缺陷型： 1）生長譜法：缺陷型斜面培養(yǎng)后，制成菌懸液涂布于上，平板上劃成不同區(qū)域，分別加上一種所需測驗(yàn)的營養(yǎng)物，培養(yǎng)觀察。 2）組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法：菌株較多時(shí)用。 營養(yǎng)缺陷型應(yīng)用 1、標(biāo)記菌種：代謝途徑、雜

51、交、基因重組中。 2、生物測定用菌 3、生產(chǎn)菌株：前體積累。 （五）抗性突變株篩選 1、一次性篩選：在對(duì)于出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中一次性篩選少數(shù)抗性突變株。 2、階梯性篩選：使用濃度梯度與某一空間或時(shí)間。 第 4 節(jié):基因重組與雜交育種 雜交 ：兩個(gè)性狀不同的菌株或變種之間進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合，遺傳物質(zhì)交換重新組合成新的性狀。 基因重組 ：兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子的重新組合后，形成新遺傳型個(gè)體的方式。 一、原核微生物的基因重組 （一）轉(zhuǎn)化 transformation 概念：受體菌直接吸收了來自供體菌的 DNA片段，通過交換，把它組合到自己的基因組中，從而獲得供體菌部分遺傳

52、性狀的現(xiàn)象。 轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱轉(zhuǎn)化子 ，DNA轉(zhuǎn)化因子。 條件： 1、能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞必須是感受態(tài)的。即受體菌最易接收外源 DNA片段并實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。 2、DNA一般都是線狀雙鏈 DNA，不小于 5×105D，轉(zhuǎn)化的片段小于 107D，平均含 15個(gè)基因。 轉(zhuǎn)化頻率較低，一般 0.11%。 雙鏈 DNA結(jié)合酶促分解、形成片段一條單鏈降解，一條進(jìn)入同源配對(duì)、受體相應(yīng)段切除，交換，雜種 DNA復(fù)制、分離、轉(zhuǎn)化子。 轉(zhuǎn)化育種：DNA提取，感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)染：把噬菌體或其他病毒 DNA（RNA）提取出來，用它去感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并產(chǎn)生正常噬菌體或病毒后代。 （二）轉(zhuǎn)導(dǎo)

53、transduction 概念：通過缺陷噬菌體的媒介，把供體細(xì)胞的 DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。 U型管實(shí)驗(yàn)：兩株?duì)I養(yǎng)缺陷型 LA-22（try-)，溶源性細(xì)菌（受體）；LA-2（his-） ，敏感菌（供體）；溫和性噬菌體 P22。結(jié)果在 LA-22 端出現(xiàn)原養(yǎng)型 his+try+。原因？ 1、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 噬菌體可誤包裹供體菌中任何基因（包括染色體外遺傳物質(zhì)），并使受體菌實(shí)現(xiàn)各種性狀的轉(zhuǎn)導(dǎo)。 1）完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)： 噬菌體誤包入供體菌 DNA片段，形成完全不含本身 DNA的假噬菌體（一種完全缺陷噬菌體），感染受體菌后，受體不會(huì)溶源化，也不會(huì)裂解。導(dǎo)入的 DNA片

54、段與同源區(qū)配對(duì)，通過兩次交換而重組到受體菌 DNA上，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 在獲得供體菌 DNA片段的受體菌內(nèi)，如果轉(zhuǎn)導(dǎo)的 DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，其上的基因僅經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。 此外源 DNA 能夠保持下去，任何時(shí)候只有一個(gè)細(xì)胞含有它。表型上仍 出現(xiàn)供體菌特征，能在選擇性培養(yǎng)基上形成微小菌落。 2、局限轉(zhuǎn)導(dǎo) 通過某些部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。 產(chǎn)生機(jī)制：不正常切割 溫和噬菌體整合到細(xì)菌 DNA特定位點(diǎn)上，誘導(dǎo)裂解時(shí)，在插入位點(diǎn)兩側(cè)的少數(shù)宿主基因會(huì)因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體 DNA上， 一起包入噬菌體中，形成部分缺陷噬菌體，無

55、正常噬菌體的溶源性和增殖能力。 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)，低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 3、溶源轉(zhuǎn)變 當(dāng)溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體基因整合到宿主基因上，而使后者獲得了除免疫性以外新性狀的現(xiàn)象，稱溶源轉(zhuǎn)變。 與轉(zhuǎn)導(dǎo)本質(zhì)上不同，噬菌體不攜帶任何供體菌基因，是完整的，而非缺陷的。 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限轉(zhuǎn)導(dǎo)比較 （三）接合 概念：通過供體菌和受體菌完整細(xì)胞間的直接接觸而傳遞大段 DNA的過程。也稱雜交。 基本原理： F+ + F- = F+ F因子傳遞過程滾環(huán)模型： Hfr + F- = F- 與 F-接合時(shí)， Hfr染色體在 F 因子處發(fā)生斷裂，環(huán)狀變成線狀，轉(zhuǎn)移至 F- 約 100分鐘，F(xiàn)因子最后轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常會(huì)發(fā)生斷裂，所以重組頻率高，但很少出現(xiàn) F+ 。 轉(zhuǎn)移過程與 F 因子傳遞過程基本相同，但進(jìn)入