微生物常規(guī)鑒定技術(shù)

1、微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察 、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過(guò)染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細(xì)菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。，以此可以對(duì)不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。）細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)

2、基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長(zhǎng)情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒(méi)有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(zhǎng)，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無(wú)限伸長(zhǎng)沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌

3、在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。革蘭氏染色:革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔

4、徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色步驟：（1）涂片：涂片方法與簡(jiǎn)單染色涂片相同。（2）晾干：與簡(jiǎn)單染色法相同。（3）固定，與簡(jiǎn)單染色法相同（4）結(jié)晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1分鐘。（5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。（6）媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色2025s至流出液無(wú)色，立即水洗。（9）復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。（11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。（12）鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍，再

5、用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。（13）實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：將浸過(guò)油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭?？春蟮娜旧Ｆ脧U紙將香柏油擦干Aseptic technique:Streak plate:Pour plateSpread plate二、生理生化試驗(yàn)微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：1、

6、尿素酶（Urease）試驗(yàn)有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖?，?xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。試驗(yàn)方法：挑取1824h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果。或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留底部作變色對(duì)照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽(yáng)性。2、氧化酶（Oxidase）試驗(yàn)氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧

7、化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。試驗(yàn)方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑12滴，陽(yáng)性者Kovacs氏試劑呈粉紅色深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無(wú)顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。注意事項(xiàng)：（1） 鹽酸二甲基對(duì)苯撐二胺溶液容易氧化，溶液應(yīng)裝在棕色瓶中，并在冰箱內(nèi)保存，如溶液變?yōu)榧t褐色，即不宜使用。（2） 鐵、鎳鉻絲等金屬可催化二甲基對(duì)苯撐二胺呈紅色反應(yīng)，若用它來(lái)挑取菌苔，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，故必須用白金絲或玻璃棒（或牙簽）來(lái)挑取菌苔。（3） 在濾紙上滴加試劑，以剛剛打濕濾紙為宜，如濾紙過(guò)濕，會(huì)防礙空氣與菌苔接觸，從而延長(zhǎng)了反應(yīng)時(shí)間，造成假陰性。3、過(guò)氧化氫酶的

8、測(cè)定過(guò)氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過(guò)氧化氫分解水和氧。1 試劑：310過(guò)氧化氫（H2O2）2 菌種培養(yǎng)：將測(cè)試菌種接種于合適的培養(yǎng)基斜面上，適溫培養(yǎng)1824h。3 試驗(yàn)方法：取一干凈的載波片，在上面滴1滴310的H2O2，挑取1環(huán)培養(yǎng)1824h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)，則為過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，無(wú)氣泡者為陰性。也可將過(guò)氧化氫溶液直接加入斜面上，觀察氣泡的產(chǎn)生。4 注意事項(xiàng)：過(guò)氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶，所以測(cè)試菌所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基不可含有血紅素或紅血球。4、甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn) 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由

9、于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。試驗(yàn)方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于MRVP生化鑒定管，于36通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36±1°C或30°C（以30°C較好）35天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲基紅指示劑12滴，陽(yáng)性呈鮮紅色，弱陽(yáng)性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.46.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強(qiáng)黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，在pH5.0或上下接近

10、時(shí)，可能變色不夠明顯，此時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)。5、V-P試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP（+）反應(yīng)。試驗(yàn)方法：）OMeara氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液1ml加OMeara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動(dòng)試管12min，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張?jiān)?85

11、0°C水浴放置2h后判定結(jié)果者。）Barritt氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°C萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動(dòng)25min，陽(yáng)性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無(wú)紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能

12、使用。本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時(shí)，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。6、含碳化合物的利用細(xì)菌能否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否產(chǎn)生代謝這種化合物的有關(guān)酶系，因而作為鑒定依據(jù)。測(cè)定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方很多，因種而異。現(xiàn)介紹1種合成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有些細(xì)菌還可適當(dāng)補(bǔ)加各種維生素。培養(yǎng)基可制成液體，分裝試管，也可制成固體平板?？捎糜跍y(cè)定的底物種類很多，有單糖、雙糖、糖醇、脂肪酸、羥基酸及其他有機(jī)酸、醇、各種氨基酸類胺類以及碳?xì)浠衔锏?。糖的含量一般?，醇類酚類等的含量一般為0.10.2，氨基酸的含量一般為0.5

13、。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒稍谝后w培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，或加入到45的固體培養(yǎng)基中，振蕩后立即倒成平板。有些底物不宜用高壓滅菌，可用過(guò)濾法滅菌后加入已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，某些醇類和酚類不必滅菌。接種和觀察結(jié)果：菌種最好做成懸液，避免帶入少量碳源干擾試驗(yàn)結(jié)果。平板培養(yǎng)用接種環(huán)點(diǎn)種，液體培養(yǎng)則用直針接種。每一測(cè)定菌必須接種未加碳水化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照。適溫培養(yǎng)2、5、7天后觀察，凡測(cè)定菌在有碳水化合物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況，明顯超過(guò)空白培養(yǎng)基的生長(zhǎng)量為陽(yáng)性，否則為陰性。假若兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況差別不明顯，開(kāi)在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種3次，如差別仍不明顯則以陰性論。7、葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中，糖

14、類發(fā)酵產(chǎn)酸是1項(xiàng)重要依據(jù)。細(xì)菌對(duì)糖類的利用有2種類型：1種是從糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，不需要以分子氧作為最終受氫體，稱發(fā)酵型產(chǎn)酸；另一種則以分子氧作為最終受氫體，稱氧化型產(chǎn)酸。前者包括的菌種類型為多數(shù)。氧化型產(chǎn)酸量較少，所產(chǎn)生的酸常常被培養(yǎng)基中的蛋白胨分解時(shí)所產(chǎn)生的胺所中和，而不表現(xiàn)產(chǎn)酸。為此，Hugh和Leifson提出一種含有低有機(jī)氮的培養(yǎng)基，用以鑒定細(xì)菌從糖類產(chǎn)酸是屬氧化型產(chǎn)酸或發(fā)酵型產(chǎn)酸。這一試驗(yàn)廣泛用于細(xì)菌鑒定。一般用葡萄糖作為糖類代表。也可利用這一基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)測(cè)定細(xì)菌從其他糖類或醇類產(chǎn)酸的能力。（1）接種 ：以1824h的幼齡菌種，穿刺接種在上述培養(yǎng)基中，每株菌接4管，其中2管用油封蓋（凡士

15、林：液體石蠟1：1混合后滅菌），約加0.51厘米厚，以隔絕空氣為閉管。另2管不封油為開(kāi)管，同時(shí)還要有不接種的閉管作對(duì)照。適溫培養(yǎng)1、2、4、7天觀察結(jié)果。（2）結(jié)果觀察：氧化型產(chǎn)酸僅開(kāi)管產(chǎn)酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿（12d），后來(lái)才稍變酸。發(fā)酵型產(chǎn)酸則開(kāi)管及閉管均產(chǎn)酸，如產(chǎn)氣，則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。8、糖或醇類發(fā)酵試驗(yàn)不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法：以無(wú)菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0°

16、C培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無(wú)改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無(wú)氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽(yáng)性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無(wú)微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無(wú)動(dòng)力，若有動(dòng)力、培養(yǎng)物可呈彌散生長(zhǎng)。本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別，因而每次試驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)和An-drade指示劑。注：對(duì)于糖醇類發(fā)酵現(xiàn)在一般用糖、醇類細(xì)菌微量生化鑒定管在361824h即可出結(jié)果。9、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗(yàn)有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾?。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢

17、驗(yàn)。試驗(yàn)方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽(yáng)性，若無(wú)紅色出現(xiàn)則為陰性。用-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，陽(yáng)性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照。-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意。10、靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于36±1C培養(yǎng)

18、24h時(shí)后，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑23滴，輕搖試管，呈紅色為陽(yáng)性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。11、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)試驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫

19、化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。12、氨基酸脫羧酶的測(cè)定 有些細(xì)菌含有氨基酸脫羧酶，使羧基釋出，生成胺類和二氧化碳。此反應(yīng)在偏酸的條件下進(jìn)行。當(dāng)培養(yǎng)基含胺類時(shí)呈堿性反應(yīng)，使指示劑變色。接種與觀察結(jié)果：用幼齡培養(yǎng)液作為菌種，直接接種。接種后封油，對(duì)照管與測(cè)定管同時(shí)接種封油。腸肝菌科的細(xì)菌于37培養(yǎng)4天觀察。當(dāng)指示劑呈紫色或帶紅色調(diào)的紫色者為陽(yáng)性，呈黃色者為陰性。對(duì)照管應(yīng)呈黃色反應(yīng)。13、硫化氫（H2S）試驗(yàn)有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)

20、基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。試驗(yàn)方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36±1培養(yǎng)2428h，培養(yǎng)基呈黑色為陽(yáng)性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營(yíng)養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會(huì)被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1培養(yǎng)16天。紙條變黑為陽(yáng)性。14、檸檬酸鹽或丙酸鹽的利用某些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽或丙酸鹽作為碳源，及磷酸胺作為氮源，將檸檬酸分解為二氧化碳，則培養(yǎng)基中由于有游離鈉離子存在而呈堿性。接種與觀察結(jié)果：取幼齡菌種接種于斜面上，適溫培養(yǎng)37天，培養(yǎng)基呈堿性

21、（藍(lán)色）者為陽(yáng)性反應(yīng)，不變者則為陰性。15、利用丙二酸鹽試驗(yàn)丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細(xì)菌鑒定中的一個(gè)鑒別性特征。許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個(gè)環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來(lái)催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，抑制了三羧酸循環(huán)。接種和觀察結(jié)果：用幼齡菌種接種測(cè)定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫培養(yǎng)12d，觀察培養(yǎng)基變色情況。如測(cè)定培養(yǎng)基生長(zhǎng)并變藍(lán)色，表示可利用丙二酸鹽，為陽(yáng)性結(jié)果。反之，如測(cè)定培養(yǎng)基未變色，而空白對(duì)照培養(yǎng)基生長(zhǎng)，則為陰性，即不利用丙二酸鹽。16、葡萄糖酸鹽的氧化假單胞菌屬

22、和腸道桿菌科的細(xì)菌，可氧化葡萄糖酸為2酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸無(wú)還原性基團(tuán)，氧化后形成酮基，則可將斐林氏試劑的呈藍(lán)色的銅鹽還原為磚紅色的Cu2O沉淀。試驗(yàn)方法：用pH7.2的磷酸緩沖液配制成含1葡萄糖酸鹽（可用葡萄糖酸鈉或葡萄糖酸鈣）的溶液。分裝試管，每管2mL。刮取適溫培養(yǎng)1824小時(shí)的菌苔至2mL的葡萄糖酸鹽溶液中制成濃的菌懸液，置30過(guò)夜，然后每管加入0.5mL的斐林試劑，放在沸水浴中加熱10分鐘，試管中液體由藍(lán)色變?yōu)辄S綠，綠橙色或出現(xiàn)紅色沉淀者為陽(yáng)性反應(yīng)，如溶液不變色者為陰性。17、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（SIM）瓊脂試驗(yàn)試驗(yàn)方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度，置36

23、77;1培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽(yáng)性，混濁或沿穿刺線向外生長(zhǎng)為有動(dòng)力，然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對(duì)照。本試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。18、-半乳糖苷酶（ONPG）的測(cè)定本試驗(yàn)應(yīng)用于腸肝菌科的鑒定。測(cè)定步驟：（1） 將測(cè)定菌接種于TSI斜面上，培養(yǎng)于3718h（或其他最適溫度）（2） 挑取1大環(huán)菌苔入約0.25mL的生理鹽水中制成菌懸液，每管加1滴甲苯，搖勻（有助于酶的釋放），于37放置5分鐘。（3） 在菌懸液中加入0.25mL的0.75mol

24、/L ONPG，測(cè)定管置于37水浴培養(yǎng)。經(jīng)30分、1、2、3、24h進(jìn)行觀察，如有黃色者則為陽(yáng)性。19、耐鹽性試驗(yàn)本試驗(yàn)是觀察滲透壓對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。由于不同菌類耐鹽性不同，故常以此作為鑒別特征。一般可根據(jù)不同種類的菌株，選擇其適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，在其中加入不同量的NaCl，接種后觀察其生長(zhǎng)與否，以判斷其耐鹽性。以肉湯培養(yǎng)液根據(jù)鑒定需要，配成不同濃度的NaCl，如2、3.5、5、7、10等。培養(yǎng)基要求十分澄清，接種時(shí)應(yīng)采用幼齡菌液，直針接種，適溫培養(yǎng)37d，與未接種的對(duì)照管對(duì)比，目測(cè)生長(zhǎng)情況。20、卵磷脂酶的測(cè)定菌體如存在有卵磷脂酶，就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿。接種與觀察結(jié)果：將

25、測(cè)試菌的菌液，環(huán)接在有卵黃的試管和不加卵黃的對(duì)照管中，適溫培養(yǎng)1、3或5天觀察。假若與對(duì)照管相比較，在卵黃胰胨液中或表面，形成白色沉淀者，則為陽(yáng)性反應(yīng)，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿，說(shuō)明有卵磷酶的存在。另一種方法：以無(wú)菌操作取出卵黃，放入滅菌的三角瓶中，加相當(dāng)于等量的生理鹽水搖勻后，取10mL卵黃液加入到溶化的約5055的200mL肉汁胨瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿，制成卵黃平板，過(guò)夜后即可使用。接種與觀察結(jié)果：將測(cè)試菌點(diǎn)接在卵黃平板上，每皿可分散點(diǎn)接45株菌、（芽孢桿菌以點(diǎn)接12株菌為宜）以不影響結(jié)果觀察為度，如測(cè)試厭氧菌，則須在上面加蓋無(wú)菌的蓋玻片。每株菌至少重復(fù)點(diǎn)接

26、兩皿。適溫培養(yǎng)12d觀察，在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)，表示卵磷脂被分解，生成脂肪，說(shuō)明該菌株有卵磷脂酶存在。21、石蕊牛奶的反應(yīng)牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊在中性時(shí)呈淡紫色，酸性時(shí)呈粉紅色，堿性呈藍(lán)色，還原時(shí)則自上而下地褪色變白。細(xì)菌對(duì)牛奶的作用有一下幾種：（1） 產(chǎn)酸細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變紅。（2） 產(chǎn)堿細(xì)菌分解酪蛋白產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使石蕊變藍(lán)。（3） 胨化細(xì)菌產(chǎn)生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶變得比較澄清。（4） 酸凝固細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變化，當(dāng)酸度很高時(shí)，可使牛奶凝固。（5） 凝乳酶凝固有些細(xì)菌能產(chǎn)生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固

27、，此時(shí)石蕊常呈藍(lán)色或不變色。（6） 還原細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，使培養(yǎng)基氧化還原電位降低，因此石蕊還原褪色。接種與觀察結(jié)果：接種待測(cè)菌株，適溫培養(yǎng)3、5、7d或14d，按上述特征觀察和記錄牛奶產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固或胨化等反應(yīng)。22、酪素水解試驗(yàn)（酪蛋白水解）牛奶平板的制備：取5g脫脂奶粉加入50mL蒸餾水中（或用50mL脫脂牛奶），另稱1.5g瓊脂溶于50mL蒸餾水中，將兩液分開(kāi)滅菌。待冷至4550時(shí)，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過(guò)夜，使表面水分干燥，然后將菌種點(diǎn)接在平板上，每皿可點(diǎn)接35株菌。適溫培養(yǎng)1、3、5天，記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制該培養(yǎng)基時(shí)，切勿將牛奶和瓊脂混

28、合滅菌，以防牛奶凝固。23、酪氨酸水解將L酪氨酸0.5g懸浮于10mL蒸餾水中，8磅20分鐘滅菌，然后于100mL無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂混合，傾倒平板，待凝固后，將測(cè)試菌接種于平皿上，培養(yǎng)7到14d，記錄酪氨酸結(jié)晶是否被水解而變透明。24、苯丙氨酸脫氨試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌（如變形桿菌）具有苯丙氨酸脫氨酶，能將苯丙氨酸氧化脫氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化鐵呈藍(lán)綠色。本試驗(yàn)用于腸肝菌科和某些芽孢桿菌屬的鑒定。接種與觀察結(jié)果：將菌種接種于該培養(yǎng)基斜面上，適溫培養(yǎng)37d（某些芽孢桿菌須培養(yǎng)21d）。取10的FeCl3水溶液45滴，滴加在生長(zhǎng)菌苔的斜面上，當(dāng)斜面和試劑液面處呈藍(lán)綠色時(shí)為陽(yáng)性反應(yīng)，表示從苯丙氨酸

29、形成苯丙酮酸。25、產(chǎn)糊精結(jié)晶試驗(yàn)?zāi)承┬柩跹挎邨U菌能產(chǎn)生淀粉酶，使淀粉水解為糊精。該反應(yīng)僅用于區(qū)別多粘芽孢菌，浸麻芽孢菌和環(huán)狀芽孢菌的培養(yǎng)物。在大試管中（200X20mm）裝碾過(guò)的小麥（或燕麥）0.5g，CaCO30.2g，蒸餾水10mL，滅菌后接種，35培養(yǎng)3、5和7d后，取1滴盧哥爾氏碘液混勻，干燥后，用顯微鏡觀察有暗褐色或藍(lán)色的六角形結(jié)晶的糊精，假若大量形成，則排列為扇形或針狀。26、從甘油產(chǎn)生二羥基丙酮本試驗(yàn)主要是用于區(qū)分醋酸單胞菌屬和假單胞菌屬以及某些芽孢桿菌的鑒定。生酮反應(yīng)是由相應(yīng)的多元醇的脫氫酶的作用，此反應(yīng)就是測(cè)定有否這些脫氫酶。接種與觀察結(jié)果：融化三角瓶中的培養(yǎng)基，倒成平板，

30、凝固后在平板上劃短線接種，適溫培養(yǎng)10天，在平板上倒入斐林試劑A、B混合液，以覆蓋菌落為度，2小時(shí)內(nèi)檢查，若在菌落周圍出現(xiàn)紅色的暈者為陽(yáng)性反應(yīng)。為了能掌握這一試驗(yàn)，可接種多粘芽孢桿菌作陽(yáng)性對(duì)照。27、厭氧硝酸鹽產(chǎn)氣在厭氧情況下，有些好氧細(xì)菌，能以硝酸鹽代替分子氧作為受氫體，進(jìn)行厭氧呼吸，將硝酸鹽還原為氣態(tài)氮，即為土壤中的反硝化作用。某些芽孢桿菌，假單胞菌及產(chǎn)堿菌等屬的細(xì)菌具有此反應(yīng)。接種封油：以斜面菌種用接種環(huán)接種后，用凡士林油（凡士林和液體石蠟為1：1）封管，封油的高度約1厘米。必須同時(shí)接種不含有硝酸鉀的肉汁胨培養(yǎng)液作對(duì)照。觀察結(jié)果：培養(yǎng)27d，觀察在含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有否生長(zhǎng)和產(chǎn)生氣泡。

31、如有氣泡產(chǎn)生，表示反硝化作用產(chǎn)生氮?dú)猓瑸殛?yáng)性反應(yīng)。但如不含硝酸鉀的對(duì)照培養(yǎng)基也可產(chǎn)生氣泡，則只能按可疑或陰性處理。28、馬尿酸鹽水解試驗(yàn)本試驗(yàn)作為區(qū)分某些芽孢桿菌的鑒定和黃單胞菌屬的鑒定之用。接種和觀察結(jié)果：以幼齡菌種接種于上述培養(yǎng)液中，適溫培養(yǎng)4周（高溫芽孢菌培養(yǎng)2周），取1mL培養(yǎng)物，和1.5mL50的；硫酸混合，靜置片刻，在酸性混合物中有針狀結(jié)晶出現(xiàn)為陽(yáng)性，證明從馬尿酸鹽形成安息香酸。29、對(duì)疊氮化鈉的抗性本試驗(yàn)用于高溫芽孢桿菌的測(cè)定。接種和觀察結(jié)果：取1環(huán)幼齡的菌液，接種于上述培養(yǎng)基中，同時(shí)接種營(yíng)養(yǎng)肉湯作為對(duì)照。45培養(yǎng)7至14d觀察生長(zhǎng)情況。30、氰化鉀試驗(yàn)氰化鉀（KCN）是呼吸鏈末

32、端抑制劑。能否在含有氰化鉀的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，是鑒別腸桿菌科各屬常用的特征之一。接種和觀察結(jié)果：用幼齡菌種接種于加氰化鉀的測(cè)定培養(yǎng)基和未加氰化鉀的空白培養(yǎng)基中，適溫培養(yǎng)12d，觀察生長(zhǎng)情況。能在測(cè)定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)者，表示氰化鉀對(duì)測(cè)定菌無(wú)毒害作用，為陽(yáng)性。若在測(cè)定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)，表示空白培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不適于測(cè)定菌的生長(zhǎng)，必須選用其它合適的培養(yǎng)基。而測(cè)定菌在空白培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)，在含氰化鉀的測(cè)定培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，為陰性結(jié)果。應(yīng)該注意：氰化鉀是劇毒藥品，操作時(shí)必須小心。培養(yǎng)基用畢，每管加幾粒硫酸亞鐵和0.5mL20KOH以解毒，然后清洗。31、對(duì)溶菌酶抗性的測(cè)定在100mL的三角瓶中，放入60

33、65mL無(wú)菌的0.01mol/L HCL，在其中加入0.1g溶菌酶，瓶上塞無(wú)菌棉花，在小火上煮沸20分鐘后，冷到室溫，加無(wú)菌的0.01mol/L HCL補(bǔ)足到100mL。取1mL溶菌酶溶液與99mL無(wú)菌的肉湯培養(yǎng)液混合，分裝無(wú)菌試管，每管2.5mL，在含有0.001溶菌酶肉湯管子及無(wú)溶菌酶的營(yíng)養(yǎng)肉湯對(duì)照管中，各接種1環(huán)菌液，適溫培養(yǎng)57d，記錄兩管的生長(zhǎng)情況。32、在pH5.7營(yíng)養(yǎng)肉湯上的生長(zhǎng)本試驗(yàn)應(yīng)用于芽孢桿菌屬中種的鑒定。接種和觀察結(jié)果：取菌液一環(huán)，接種于上述培養(yǎng)基中，同時(shí)接種普通肉湯液（7.2pH）作對(duì)照。適溫培養(yǎng)13d后觀察生長(zhǎng)情況。該培養(yǎng)液要求十分澄清，pH必須準(zhǔn)確，最好用pH計(jì)調(diào)測(cè)

34、。33、需氧性試樣若在培養(yǎng)基中加入還原劑，如巰基醋酸鈉和甲醛次硫酸鈉等，以除去培養(yǎng)基中的氧氣或氧化型物質(zhì)，使厭氧菌能在有氧情況下生長(zhǎng)。1 接種與觀察結(jié)果：用1小環(huán)（外徑1.5毫米的接種環(huán)）的肉湯菌液，穿刺接種到上述培養(yǎng)基中，必須穿刺到管底。30培養(yǎng)，分別在3至7天觀察結(jié)果。如細(xì)菌在瓊脂柱表面上生長(zhǎng)者為好氧菌，如沿著穿刺線上生長(zhǎng)者為厭氧菌或兼性厭氧菌。34、明膠（Gelatin）液化試驗(yàn)有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。試驗(yàn)方法：挑取1824h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基。于2022培

35、養(yǎng)714天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化，如確被液化，即為試驗(yàn)陽(yáng)性。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽(yáng)性，1020min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。35、淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。試驗(yàn)方法：以1824h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)接種，試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1°C培養(yǎng)2448h，或于20°培養(yǎng)

36、5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無(wú)色透明環(huán)、或肉湯顏色無(wú)變化。陰性反應(yīng)則無(wú)透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過(guò)程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。36、生長(zhǎng)溫度的測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)的最高、最適和最低溫度，常常是某些細(xì)菌鑒定的特征之一。測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)溫度，要求培養(yǎng)液十分清晰（如普通肉湯培養(yǎng)液），并采用液體菌種直針接種（不用接

37、種環(huán)接種）。放置于恒溫水浴培養(yǎng)。指示溫度計(jì)應(yīng)放在同樣的試管和培養(yǎng)基內(nèi)，在指定溫度下培養(yǎng)25d，觀察生長(zhǎng)情況。在接近0的低溫培養(yǎng)，則觀察時(shí)間可延長(zhǎng)至710d，甚至30d。觀察記錄結(jié)果：目測(cè)生長(zhǎng)情況，與未接種的空白培養(yǎng)基對(duì)比，注意混濁度、沉淀物和懸浮物等項(xiàng)，并分級(jí)記錄如下：（1）“：表示生長(zhǎng)良好；與對(duì)照管相比，可清楚地判定是混濁的。（2）“：表示生長(zhǎng)差；與對(duì)照管相比，只有在某一觀察角度時(shí)方能看到明顯的混濁。（3）“：表示不生長(zhǎng)；在適宜的角度下觀察，與對(duì)照無(wú)差異?？傊?，培養(yǎng)5d，能生長(zhǎng)者均按生長(zhǎng)計(jì)，否則按不生長(zhǎng)計(jì)，凡培養(yǎng)5d仍屬可疑者或不生長(zhǎng)者必須重測(cè)，在重測(cè)時(shí)，可能出現(xiàn)有時(shí)生長(zhǎng)，有時(shí)不生長(zhǎng)的不穩(wěn)定

38、現(xiàn)象，這可能有兩種原因：一種是水浴溫度不穩(wěn)定，培養(yǎng)時(shí)溫度波動(dòng)大；另一種原因可能是所測(cè)定的溫度，恰好是測(cè)定菌的臨界生長(zhǎng)溫度，在這種情況下，可用提高一度或降低一度的辦法肯定之。必須注意，當(dāng)測(cè)定的試管較多時(shí)，不可將試管捆成一捆浸于水浴中，這樣捆著的試管內(nèi)外溫度不一致，易出現(xiàn)誤差。最好用特制試管架放試管，所用溫度計(jì)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)標(biāo)定過(guò)。37、形成芽孢的培養(yǎng)基形成芽孢是芽孢桿菌的關(guān)鍵性特征，但不是所有的芽孢桿菌都能在任何條件下形成芽孢。在鑒定細(xì)菌時(shí)，為了確定是否屬芽孢菌，需要對(duì)那些在一般條件下不形成芽孢的細(xì)菌，采用生孢子培養(yǎng)基，來(lái)確定是否能形成芽孢。38、O/129的敏感性試驗(yàn)O/129即2，4二氨基6

39、，7二異丙醇喋啶，為弧菌抑制劑。該試驗(yàn)用于弧菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬的鑒定。取2，4二氨基6，7二異丙醇喋啶150mg，溶于10mL1：1的乙醇：二乙基乙醚中。把6mm大小的濾紙片浸入該溶液后取出，在空氣中晾桿，然后放在帶菌的半固體培養(yǎng)基上做擴(kuò)散敏感試驗(yàn)。三、血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來(lái)鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)：1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。3)抗原體的

40、結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。4)血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無(wú)嚴(yán)格界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見(jiàn)階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長(zhǎng)時(shí)間。而且，在第二階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。、凝集反應(yīng)顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)（Agglutination reaction）。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反應(yīng)中，因