如何設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物

1、1. 找出這種細(xì)胞物種的PTN全長(zhǎng)核苷酸序列2. 采用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)：l 1. 引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)2。l 2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加2。l 3. 引物3端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)

2、堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A34。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物2。l 4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大25。l 5. 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method) 67。l 6. G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用

3、3端G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5端和中間G值相對(duì)較高的引物。引物的3端的G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)6。l 7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行8。l 8. 對(duì)引物的修飾一般是在5端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。 如果文獻(xiàn)上的這個(gè)基因跟你是同一物種來(lái)源的話 是可以運(yùn)用別人的引物 看看他的引物是基因組的還是cDNA的。cDNA的可以直接用。基因組的就再看看了 好的引物對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程不會(huì)延緩 我覺(jué)得在涉及引物只要遵循以下的原則，一

4、般是沒(méi)什么問(wèn)題!我是從來(lái)不借助什么專(zhuān)業(yè)軟件來(lái)設(shè)計(jì)，按照自己的需要選取就是了，一般20bp，不浪費(fèi)!到目前還沒(méi)有失敗過(guò)!引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則:(1) 引物長(zhǎng)度約為16-30bp， 太短會(huì)降低退火溫度影響引物與模板配對(duì)，從而使非特異性增高。太長(zhǎng)則比較浪費(fèi),且難以合成。(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm=4(G+C)+2(A+T).(3) 四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個(gè)G或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。(4) 引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng), 以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的

5、不配對(duì)。(5) 在引物內(nèi), 尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。(6) 兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ), 以防出現(xiàn)引物二聚體, 減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 (7) 引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大, 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等. 通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。(8) 引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無(wú)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu), 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,影響產(chǎn)量。 (9) 簡(jiǎn)并引物應(yīng)選用簡(jiǎn)并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的M

6、et, 3'端應(yīng)不存在簡(jiǎn)并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0mol/L。引物過(guò)多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體, 過(guò)低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì), 可精確計(jì)算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計(jì)算:X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。如何查找基因序列NC表示人類(lèi)基因組DNA的RefSeq。（鏈接序列）NM表示mRNA的RefSeq。NP表示蛋白質(zhì)的RefSeq1. 根據(jù)文獻(xiàn)中已

7、知的基因ID如果你在文獻(xiàn)中看到你感興趣的基因，而且文中還提到了該基因在Genbank中的ID號(hào)，那就好辦了，直接打開(kāi) ，在Search后的下拉框中選擇Nucleotide，把Genbank ID號(hào)輸入GO前面的文本框中，點(diǎn)“GO”，就可以找到了。(如GenBank accession number gi 16151096)”。 2. 根據(jù)已經(jīng)獲得的基因的相關(guān)信息進(jìn)行查找打開(kāi)在search后面的下拉框中選擇Gene，然后在中間的文本框中輸入基因名稱(chēng)“VEGF”，點(diǎn)擊GO。搜索結(jié)果出來(lái)了，點(diǎn)擊箭頭所指的Limits, Limits的意思其實(shí)就是高級(jí)檢索，你可以在這里對(duì)檢索詞進(jìn)行很多限制，

8、這樣能大大精簡(jiǎn)查詢結(jié)果。我們接著來(lái)，在Limits這個(gè)界面，先選擇查詢的限定范圍：先選Gene name(基因名稱(chēng))；然后再選擇Limit by Taxonomy（生物分類(lèi)限定）中的Homo sapiens（人類(lèi)），然后再點(diǎn)擊“GO”。直接點(diǎn)擊基因名稱(chēng)“VEGFA”就可以看到有關(guān)基因的信息了。需要指出的是，在Genbank中，基因有很多別名（Aliases），和Genbank中記錄的名稱(chēng)有可能不一致。比如在這里，VEGFA是Genbank中記錄的基因名稱(chēng)，而它還有很多別名，比如MGC70609, VEGF（這就是我們要找的基因名稱(chēng) ）, VEGF-A, VPF；還有，在這里可以看到該基因在染色

9、體上的位置.  再往下看，可以看到Genomic regions, transcripts, and products，這里顯示了該基因在基因組中的位置，以及轉(zhuǎn)錄本的生成情況：就看見(jiàn)了目的基因的mRNA的鏈接（如NM_001025366.1）和蛋白質(zhì)的鏈接（如NP_001020537.2 ）   這里得說(shuō)兩句，有的基因也許只有一個(gè)編碼序列，但有的基因有很多的mRNA剪接體，但都是歸在一個(gè)基因名稱(chēng)下面。比如，在VEGF基因下面有7個(gè)序列，分別是vascular endothelial growth factor A isoform a, isoform c, iso

10、form d, isoform e, isoform f , isoform g, isoform b precursor ，但是哪個(gè)是自己想找的基因呢？這就需要根據(jù)你自己查閱的文獻(xiàn)以及在這些基因序列后面的解釋來(lái)確定了。如果我想找的基因是第一個(gè)序列即isoform a, 就可以點(diǎn)擊NM_001025366.1，ncbi中查找基因序列的方法和三個(gè)號(hào)碼ncbi首頁(yè)，點(diǎn)擊左側(cè)Genes&Expression,進(jìn)入后，點(diǎn)擊中間頁(yè)面DATABASES里的GenBank，進(jìn)入GenBank頁(yè)面。選CoreNuleotide。搜“Saccharomyces cerevisiae tps1”一例子：查

11、找釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）里的海藻糖合成酶基因（tps1） 即可出現(xiàn)很多條目，找到Saccharomyces cerevisiae的就是NC_001134了，點(diǎn)擊后就進(jìn)入該基因所在染色體的界面了，再在“編輯”中“查找” tps1就可以看該基因所在的位置，再點(diǎn)擊CDS或者GeneID:852423都可以出現(xiàn)相關(guān)鏈接！當(dāng)然，如果你在文獻(xiàn)查到目的蛋白的序列號(hào)如NP_009684.1或者GeneID:852423，那分別在Search后選擇Protein或者Gene也可以出現(xiàn)相關(guān)鏈接！二基因CDS區(qū)界面的3個(gè)號(hào)碼找到后，我發(fā)現(xiàn)該界面有3個(gè)標(biāo)記，一個(gè)是NC_00113

12、4 ，其次是gi:50593115，最后是FEATURES中的gene中的 /db_xref= “GeneID:852423”，他們分別是什么號(hào)碼，用在什么地方呢？嘗試中，終于發(fā)現(xiàn)，在Search“Nucleotide”或者“Core Nucleotide”時(shí)，for后面是NC_001134，最終go到該基因所在染色體全長(zhǎng)序列的信息，所以NC_001134應(yīng)該是該染色體的登錄號(hào)吧？在Search“Nucleotide”或者“Core Nucleotide”時(shí)，for后面是50593115，最終go到該基因所在染色體全長(zhǎng)序列的信息，所以50593115應(yīng)該是該染色體的號(hào)吧？在Search“Gen

13、e”時(shí)，for后面是852423，最終go到該基因的信息，所以852423應(yīng)該是該基因的登錄號(hào)吧？所以我們?nèi)绻涀∧康幕蛟趎cbi中的位置就記住這個(gè)GeneID！其他像NP_009684是基因編碼的蛋白質(zhì)的登錄號(hào)。文獻(xiàn)中查到的基因往往給的是Gene ID三引物設(shè)計(jì)第一步-找編碼序列的方法 在Search“Gene”時(shí)，for后面是852423，最終go到目的基因的信息 點(diǎn)擊中的FASTA,獲得的就是mRNA的非模板鏈（其實(shí)就是mRNA里的U換成了T），也可以說(shuō)是CDNA的互補(bǔ)片段，因?yàn)榕c編碼的蛋白質(zhì)一一對(duì)應(yīng)，所以也就是引物設(shè)計(jì)真正的模板！引物設(shè)計(jì)后面的PCR要克隆的就是這段序列！所以千萬(wàn)不要搞錯(cuò)了！點(diǎn)擊GENBANK，獲得的是CDS區(qū)的序列和相關(guān)信息，這個(gè)CDS區(qū)包括CDNA，也包括其他不編碼的序列，所以PCR沒(méi)必要把CDS區(qū)全部克隆出來(lái)！其實(shí)在CDS界面（或者說(shuō)點(diǎn)擊GENBANK后出現(xiàn)的界面里），把Display里的GENBANK（full）改成FASTA也可以！其實(shí)在該界面中我們還可以了解到其他信息1. 點(diǎn)擊reference sequence details，可以看到NP_009684.1，點(diǎn)擊他，可以看到目的蛋白質(zhì)的信息2. 點(diǎn)擊獲得的是目的基因的圖譜，然后點(diǎn)擊TPS1后面的sv，也可以看到編碼序列了，當(dāng)然這里的DNA序列和蛋白質(zhì)一一對(duì)應(yīng)，更說(shuō)明是設(shè)計(jì)引物