實(shí)驗(yàn)三紙色譜

1、實(shí)驗(yàn)三 紙色譜一、實(shí)驗(yàn)原理、方法、注意事項(xiàng)1、原理紙層色譜為在紙上將混合物進(jìn)行分離的色譜方法，分為分析型和制備型紙層色譜。多數(shù)情況下，紙層色譜的原理屬于分配色譜原理，色譜濾紙為支持劑，濾紙纖維可以吸附25%30%的水分，其中67%的水分和濾紙結(jié)構(gòu)中的羥基以氫鍵結(jié)合，為固定相。其他溶劑可自由通過(guò)，為流動(dòng)相。流動(dòng)相流經(jīng)支持物時(shí)，與固定相之間連續(xù)抽提，使物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。物質(zhì)被分離后在紙色譜圖譜上的位置用Rf值（比移值）來(lái)表示：Rf值 = 原點(diǎn)到色譜點(diǎn)中心的距離/ 原點(diǎn)到溶劑前沿的距離在一定條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)，其大小受物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)物質(zhì)組成與比例、pH值、選用濾紙

2、質(zhì)地和溫度等多種因素影響。此外，樣品中的鹽分、其他雜質(zhì)以及點(diǎn)樣過(guò)多均會(huì)影響的有效分離。但由于影響比移值的因素較多，因而一般采用在相同實(shí)驗(yàn)條件下與對(duì)照物質(zhì)對(duì)比以確定其異同。作為藥品的鑒別時(shí)，供試品在色譜中所顯主斑點(diǎn)的顏色（或熒光）與位置，應(yīng)與對(duì)照品在色譜中所顯的主斑點(diǎn)相同。作為藥品的純度檢查時(shí)，可取一定量的供試品，經(jīng)展開(kāi)后，按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定，檢視其所顯雜質(zhì)斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)或呈色（或熒光）的強(qiáng)度。作為藥品的含量測(cè)定時(shí)，將主色譜斑點(diǎn)剪下洗脫后，再用適宜的方法測(cè)定。無(wú)色物質(zhì)的紙色譜圖譜可用光譜法（紫外光照射）或顯色法鑒定，氨基酸紙色譜圖譜常用茚三酮顯色法鑒定。紙層色譜適用于極性較大的親水性化合物或極性差別

3、較小的化合物的分離。2、實(shí)驗(yàn)方法(1) 下行法將供試品溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┲兄瞥梢欢舛鹊娜芤?。用微量吸管或微量注射器吸取溶液，點(diǎn)于點(diǎn)樣基線上，溶液宜分次點(diǎn)加，每次點(diǎn)加后，俟其自然干燥、低溫烘干或經(jīng)溫?zé)釟饬鞔蹈?，樣點(diǎn)直徑為24mm，點(diǎn)間距離約為1.52.0cm，樣點(diǎn)通常應(yīng)為圓形。將點(diǎn)樣后的色譜濾紙上端放在溶劑槽內(nèi)并用玻棒壓住，使色譜紙通過(guò)槽側(cè)玻璃支持棒自然下垂，點(diǎn)樣基線在支持棒下數(shù)厘米處。展開(kāi)前，展開(kāi)室內(nèi)用各品種項(xiàng)下規(guī)定的溶劑的蒸氣使之飽和，一般可在展開(kāi)室底部放一裝有規(guī)定溶劑的平皿或?qū)⒔幸?guī)定溶劑的濾紙條附著在展開(kāi)室內(nèi)壁上，放置一定時(shí)間，俟溶劑揮發(fā)使室內(nèi)充滿飽和蒸氣。然后添加展開(kāi)劑使浸沒(méi)溶劑槽內(nèi)的

4、濾紙，展開(kāi)劑即經(jīng)毛細(xì)管作用沿濾紙移動(dòng)進(jìn)行展開(kāi)，展開(kāi)至規(guī)定的距離后，取出濾紙，標(biāo)明展開(kāi)劑前沿位置，俟展開(kāi)劑揮散后按規(guī)定方法檢出色譜斑點(diǎn)。(2) 上行法點(diǎn)樣方法同下行法。展開(kāi)室內(nèi)加入展開(kāi)劑適量，放置俟展開(kāi)劑蒸氣飽和后，再下降懸鉤，使色譜濾紙浸入展開(kāi)劑約0.5cm,展開(kāi)劑即經(jīng)毛細(xì)管作用沿色譜濾紙上升，除另有規(guī)定外，一般展開(kāi)至約15cm后，取出晾干，按規(guī)定方法檢視。展開(kāi)可以向一個(gè)方向進(jìn)行，即單向展開(kāi)；也可進(jìn)行雙向展開(kāi),即先向一個(gè)方向展開(kāi),取出，俟展開(kāi)劑完全揮發(fā)后，將濾紙轉(zhuǎn)動(dòng)90°,再用原展開(kāi)劑或另一種展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi);亦可多次展開(kāi)、連續(xù)展開(kāi)或徑向展開(kāi)等。3、注意事項(xiàng)1 層析紙使用前，應(yīng)在烘箱中

5、干燥，具體方法為100度的溫度下，烘12小時(shí)。否則會(huì)產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。2 畫線時(shí)只能使用鉛筆，不能使用其它的筆。其它筆的顏色為有機(jī)染料，在有機(jī)溶劑中染料溶解，顏色會(huì)產(chǎn)生干擾。3 無(wú)論是畫線還是點(diǎn)樣，不能用手接觸層析紙前沿線以下的任何的部位，因?yàn)?，手指上有相?dāng)量的氨基酸，并足以在本實(shí)驗(yàn)方法中檢出干擾實(shí)驗(yàn)。4 紙層析須在密閉容器中展開(kāi)。加入展開(kāi)劑后，再等20分鐘左右，使標(biāo)本缸內(nèi)形成此溶液的飽和蒸汽。 5 噴有顯色劑的層析紙，在烘干時(shí)應(yīng)注意溫度的控制，溫度太高，不但氨基酸會(huì)產(chǎn)生顏色，茚三酮也會(huì)產(chǎn)生顏色干擾實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。6 Rf值隨分離化合物的結(jié)構(gòu)，固定相與流動(dòng)相的性質(zhì)、溫度以及紙的質(zhì)量等因素而變化。當(dāng)溫度、

6、濾紙等實(shí)驗(yàn)條件固定時(shí)，比移值就是一個(gè)特有的常數(shù)，因而可作定性分析的依據(jù)。二、實(shí)驗(yàn)用紙色譜法分離氨基酸（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)對(duì)氨基酸的分離，學(xué)習(xí)運(yùn)用紙色譜法分離混合物的基本原理，掌握紙色譜的操作方法。（二）藥品和儀器1儀器層析缸 毛細(xì)管(內(nèi)徑為0.5mm) 層析紙 噴霧器 7.5cm×15cm標(biāo)本缸 新華1號(hào)(5×14cm。) 直尺、 鉛筆2試劑0.1甘氨酸水溶液 0.1亮氨酸水溶液 0.1茚三酮乙醇溶液 正丁醇 甲酸 未知液（三）實(shí)驗(yàn)原理（參見(jiàn)本節(jié)一、1、）（四）實(shí)驗(yàn)步驟1、層析紙的準(zhǔn)備：將活化1的一張5×14厘米的層析紙條，在離底邊1.5厘米處用鉛筆2畫一直線作為始

7、線，在起始線上點(diǎn)A、B、C三個(gè)點(diǎn)，各點(diǎn)之間的距離為1.5厘米，A、C兩點(diǎn)分別離層析紙邊為1厘米，在起始線7厘米處畫一直線作為溶劑前沿線3。見(jiàn)圖5。 2、點(diǎn)樣。 取內(nèi)徑約0.5mm的毛細(xì)管三小段，分別插入試樣溶液中，借毛細(xì)虹吸現(xiàn)象吸取溶液少許，在A上點(diǎn)甘氨酸溶液，B上點(diǎn)未知液，C上點(diǎn)亮氨酸溶液，樣點(diǎn)的直徑約23mm，如溶液太稀，第一次點(diǎn)樣，吹干后，再點(diǎn)第二、第三次，每次都要點(diǎn)在同一位置上。 3、展開(kāi)： 將30毫升展開(kāi)劑（正丁醇：甲酸：水/5：3：2）倒入層析缸中，蓋上蓋子，飽和20分鐘后4，再將點(diǎn)好樣品的層析紙上端用回形針別住，把層析紙懸掛在層析缸蓋的鉤上，使層析紙的底邊浸入展開(kāi)劑0.5厘米，如圖9所示。展開(kāi)劑到達(dá)前沿線后，展開(kāi)完畢，取出層析紙，晾干或紅外燈下烘干。4、顯色：將烘干的層析紙，用噴霧器噴灑顯色劑(茚三酮溶液)，再到紅外燈下烘到顯色為止5。5、計(jì)算各氨基酸的Rf值：用筆畫出斑點(diǎn)，找出斑點(diǎn)的中心距離，并量出起始線至斑點(diǎn)中心的距離，如圖6所示。根據(jù)下列公式計(jì)算各氨基酸的Rf值，并將純樣品和未知樣品的Rf值進(jìn)行對(duì)照，鑒定未液6。 圖5 層析紙的準(zhǔn)備 圖 6斑點(diǎn) 圖9展開(kāi) 1層析缸 2層析紙 3展開(kāi)劑圖 7 層析紙的操作（五）思考題1、展開(kāi)劑的液面高出濾紙上的樣點(diǎn)，將會(huì)產(chǎn)生什么后果2、紙色