學(xué)位論文研究課題孫麗娟

1、陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院碩士研究生學(xué)位論文開題報(bào)告題 目：通用型雙極電化學(xué)發(fā)光陣列生物傳感器的研究學(xué)號(hào)：121664姓名：孫麗娟學(xué)科專業(yè)：分析化學(xué)研究方向：生物電分析導(dǎo)師姓名：張成孝職稱：教授報(bào)告主持人：報(bào)告日期： 填表日期：年月日填 表 說 明1、開題報(bào)告是碩士生培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，研究生需在導(dǎo)師的指導(dǎo)下認(rèn)真完成，具體要求參見陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院關(guān)于研究生學(xué)位論文開題報(bào)告的規(guī)定。2、開題報(bào)告文獻(xiàn)綜述部分的基本要求：（1）國內(nèi)外本研究課題的發(fā)展現(xiàn)狀、趨勢(shì)及問題等，字?jǐn)?shù)6000字左右。（2）參考文獻(xiàn)量應(yīng)不少于30篇，對(duì)于個(gè)別新興研究領(lǐng)域其文獻(xiàn)量可酌情減少；參考文獻(xiàn)中最新研究文獻(xiàn)（近五年內(nèi)發(fā)表的文

2、獻(xiàn)）不少于三分之二，外文文獻(xiàn)不少于四分之三；（3）文獻(xiàn)引用格式需符合陜西師范大學(xué)學(xué)位論文參考文獻(xiàn)格式要求的相關(guān)規(guī)定。3、完成時(shí)間：研究生應(yīng)在入學(xué)后第三學(xué)期初（9月1日至10月1日）進(jìn)行，具體時(shí)間各學(xué)科可按實(shí)際情況進(jìn)行安排；2012級(jí)研究生應(yīng)在2013年11月15日前進(jìn)行開題。4、碩士生開題報(bào)告書應(yīng)首先獲導(dǎo)師認(rèn)可方可參加開題。5、打印要求：此表用A4紙雙面打印，各欄空格不夠時(shí)，請(qǐng)自行加頁。6、開題報(bào)告通過、修改、簽字完畢后，交學(xué)院辦公室存檔一份。選題基本情況（）本研究題目為： 1. 導(dǎo)師課題的一部分 ( )；2. 委培單位的課題 ( )；3. 其它（須具體說明） 。選題分類 （）1. 基礎(chǔ)研究

3、( )2. 應(yīng)用研究 ( )3. 綜合研究 ( )4. 其 他 ( )選題來源 （）1. 973、863項(xiàng)目( )2. 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 ( )3. 中央、國家各部門項(xiàng)目 ( )4. 陜西省項(xiàng)目( )5. 西安市項(xiàng)目 ( )6. 企、事業(yè)單位委托項(xiàng)目（ ）7. 國防項(xiàng)目 （ ）8. 其他 （ ）一、立題依據(jù)1.項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析，需結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢(shì)來論述科學(xué)意義；或結(jié)合國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中迫切需要解決的關(guān)鍵科技問題來論述其應(yīng)用前景。附主要參考文獻(xiàn)目錄）近幾年，無論在發(fā)展中國家還是在發(fā)達(dá)國家，心血管疾?。╟ardivovascular CVD）都是人類

4、死亡的一個(gè)重要原因。根據(jù)世界世界衛(wèi)生組織（WHO）的推測(cè)，預(yù)計(jì)到2015年，心血管疾病將是引發(fā)發(fā)展中國家人口死亡的首要病因。因此，發(fā)展穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、靈敏、可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種心血管疾病標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)的方法對(duì)與心血管疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療具有極其重要的意義1。生物傳感器2是一類以生物分子識(shí)別物質(zhì)(如酶、抗體、核酸、細(xì)胞等）作為生物敏感單元，對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物具有高度選擇性的檢測(cè)器。由于生物傳感器具選擇性好，靈敏度高、分析速度快、可檢測(cè)的目標(biāo)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，而在心血管疾病的早期診斷方面起著重要的作用3。目前報(bào)道的心血管疾病的標(biāo)志物有C反應(yīng)蛋白(C reaction protein簡(jiǎn)稱CRP)、心肌肌鈣蛋白I（

5、Cardiac tropinin I 簡(jiǎn)稱c TnI）、心肌肌鈣蛋白T（Cardiac tropinin T 簡(jiǎn)稱c TnT）、肌紅蛋白（Myoglobin 簡(jiǎn)稱Mb）、白細(xì)胞介素-6（interlukin-6 簡(jiǎn)稱IL-6）、白細(xì)胞介素-1（interlukin-1 簡(jiǎn)稱 IL-1)、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein 簡(jiǎn)稱LDL)、髓過氧化物酶（myeloperoxidase 簡(jiǎn)稱MPO) 、腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor alpha 簡(jiǎn)稱 TNF-)、腦鈉肽（brain natriuretic peptide簡(jiǎn)稱BNP）等。對(duì)于心血管

6、疾病標(biāo)志物檢測(cè)的方法有化學(xué)發(fā)光分析法、熒光分析法、電化學(xué)分析法、電化學(xué)發(fā)光分析法等。在這些方法中，電化學(xué)發(fā)光分析法(Eleertogneerated chmilmuniesecnce，簡(jiǎn)稱ECL)，是對(duì)電極施加一定的電壓進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物之間或反應(yīng)產(chǎn)物與體系中的某種組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)物質(zhì)，激發(fā)態(tài)物質(zhì)回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生發(fā)光，用光電倍增管等測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度，從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的分析的方法4。它作為電化學(xué)分析方法與化學(xué)發(fā)光分析法的產(chǎn)物，具有檢測(cè)限低、線性范圍寬、儀器簡(jiǎn)單、受電極污染小等優(yōu)點(diǎn)。相對(duì)于化學(xué)發(fā)光，具有可控性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；相對(duì)于電化學(xué)分析法，具有檢測(cè)限低的優(yōu)點(diǎn)；相對(duì)于熒光檢測(cè)，具有

7、無光漂白，不需要光源和分光系統(tǒng)等優(yōu)點(diǎn)，因而引起了國內(nèi)外分析化學(xué)家門的極大興趣。國外的Bard，Rusling，Miao，Walt研究小組，國內(nèi)長春應(yīng)用化學(xué)研究所，南京大學(xué)，福州大學(xué)，中國科技大學(xué)，南開大學(xué)，華東師范大學(xué)，青島科技大學(xué)，西北大學(xué)，濟(jì)南大學(xué)，陜西師范大學(xué)等，在電化學(xué)發(fā)光體系和生物分析，尤其是心血管疾病標(biāo)識(shí)物應(yīng)用研究方面取得了一系列的研究成果。目前，國內(nèi)外利用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行心血管疾病標(biāo)示物的傳感技術(shù)，主要集中于新型電化學(xué)發(fā)光體系、分子識(shí)別物質(zhì)固定化、信號(hào)放大和檢測(cè)系統(tǒng)等單個(gè)傳感器的研究，涉及多組分物質(zhì)檢測(cè)的電化學(xué)發(fā)光陣列傳感方法和器件的研究相對(duì)較少。雙極性電極是一個(gè)不與外電源連接

8、而置于驅(qū)動(dòng)陰極和陽極之間電解液中的導(dǎo)體5,6，與傳統(tǒng)的三電極體系相比，雙極性電極應(yīng)用于電分析化學(xué)的主要優(yōu)點(diǎn)是不需要電線的直接連接，簡(jiǎn)單的電源甚至電池就可以滿足供電，雙極性電極的電位容易控制。因而可以通過建立雙極性電極陣列來實(shí)現(xiàn)多組分的同時(shí)檢測(cè)。目前電化學(xué)發(fā)光分析法的檢測(cè)器主要分別為光電倍增管和CCD, 其中以CCD作為電化學(xué)發(fā)光分析法檢測(cè)工具的方法稱為電化學(xué)發(fā)光成像法。目前商品化的光電倍增管很難實(shí)現(xiàn)多信號(hào)的同時(shí)采集，而CCD卻可以實(shí)現(xiàn)多信號(hào)的采集。基于電化學(xué)發(fā)光成像是一種全新的成像技術(shù)，兼有化學(xué)發(fā)光成像法和電化學(xué)發(fā)的優(yōu)點(diǎn)，不僅能夠提供發(fā)光強(qiáng)度和電化學(xué)信號(hào)，而且能夠進(jìn)行光學(xué)成像7，該法不僅能提供

9、傳統(tǒng)分析化學(xué)所能確定的“是什么”和“有多少”的定性以及定量概念，而且可以提供 “什么位置有什么”、“有多少”的信息8。因而，電化學(xué)發(fā)光成像實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)檢測(cè)方面有著很大的優(yōu)勢(shì)。 在目前的研究中，對(duì)于雙極性電極陣列應(yīng)用于電化學(xué)發(fā)光傳感器中實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)測(cè)定的研究還未見報(bào)道?；诖耍撗芯繑M建立一種用于多組分同時(shí)測(cè)定的通用型雙極電化學(xué)發(fā)光陣列生物傳感器。本文將就近6年電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，陣列生物傳感器、電化學(xué)成像分以及和雙極性電極應(yīng)用方面的一些研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。1. 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究電化學(xué)發(fā)光生物傳感器(Electrochemiluminescence biosensor)是將特異性分

10、子識(shí)別物質(zhì)如酶、抗原/抗體、DNA作為分子識(shí)別物質(zhì)固定在換能器上，將待測(cè)物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)變?yōu)殡娀瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)信號(hào)的分析器件。電化學(xué)發(fā)光生物傳感器以其實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在分析化學(xué)的研究中起著越來越重要的地位，已廣泛用于生命科學(xué)、環(huán)境分析、藥物分析等領(lǐng)域。電化學(xué)發(fā)光生物傳感器根據(jù)是否標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型兩類模式。非標(biāo)記型電化學(xué)發(fā)光生物傳感器是將電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)通過吸附或插入等非標(biāo)記的方法引入傳感器中，利用目標(biāo)物質(zhì)與傳感器相互作用前后，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的變化而進(jìn)行檢測(cè)的傳感器。非標(biāo)記型電化學(xué)傳感器不需要復(fù)雜的標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)的過程，是

11、一種簡(jiǎn)單易行的傳感模式，但靈敏度相對(duì)較低、干擾較大。標(biāo)記型電化學(xué)發(fā)光生物傳感器是指利用電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)或分子識(shí)別物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記得到電化學(xué)發(fā)光信號(hào)探針，利用信號(hào)探針指示分子識(shí)別物質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)相互作用的傳感器。標(biāo)記型的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器以其高靈敏度備受人們的關(guān)注。南開大學(xué)的Yin等人9設(shè)計(jì)了一種非標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)凝血酶的生物傳感器。原理如圖1.1所示，該傳感器以Ru(phen)32+為信號(hào)物質(zhì)，凝血酶適體為分子識(shí)別物質(zhì)，將有27個(gè)堿基的單鏈巰基凝血酶適體自組裝于金電極表面，封閉劑封閉后，含有20個(gè)堿基的互補(bǔ)DNA與適體雜交結(jié)合于金電極表面。隨后，將Ru(phen)32+信號(hào)物質(zhì)插入雙

12、鏈DNA中，形成電化學(xué)發(fā)光傳感器。當(dāng)體系中存在凝血酶時(shí)，凝血酶適體特異性地識(shí)別凝血酶而使雙鏈DNA打開，釋放信號(hào)物質(zhì)，基于電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的降低值進(jìn)行檢測(cè)。 圖1.1 電化學(xué)發(fā)光適體傳感器檢測(cè)凝血酶原理圖Figure 1.1 Schematic for the principle of the developed ECL aptasensor for detecting thrombin.2008年，張成孝小組10以釕聯(lián)吡啶衍生物標(biāo)記的發(fā)卡型DNA作為分子識(shí)別物質(zhì)，構(gòu)建了一種高選擇性檢測(cè)目標(biāo)單鏈DNA的電化學(xué)發(fā)光傳感器(如圖1.2)。該傳感器對(duì)互補(bǔ)DNA序列的檢出限為9×10-11 M

13、，能有效區(qū)分單堿基錯(cuò)配與完全匹配DNA，解決了直接固定直鏈DNA電化學(xué)發(fā)光DNA探針而造成的高背景缺點(diǎn)，也克服了先固定化檢測(cè)單鏈DNA再雜交電化學(xué)發(fā)光DNA探針模式非傳感的缺點(diǎn)。圖1.2 基于雜交的發(fā)卡型DNA探針目標(biāo)DNA原理圖Fig. 1.2 Schematic diagram of the hairpin-DNA probe detection for DNA hybridization.2011年該小組11以釕聯(lián)吡啶作為信號(hào)物質(zhì)，溶菌酶適體(LBA)作為分子識(shí)別物質(zhì)，報(bào)道了一種新型的非標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光適體傳感器檢測(cè)溶菌酶的方法。檢測(cè)原理如圖1.3所示，溶菌酶適體(LBA)帶有大量負(fù)電荷，

14、一端帶有巰基，通過巰基自組裝于金電極表面。溶菌酶與靜電吸附在適體上的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)Ru(bpy)32+競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固定在電極上的適體。在溶菌酶存在時(shí)，帶陽離子的溶菌酶與帶陰離子的適體(LBA)序列易于形成LBA-lysozyme復(fù)合物，此時(shí)溶菌酶適體(LBA)上的陰離子減少使得通過靜電吸附作用吸附在適體上的Ru(bpy)32+減少，基于電化學(xué)發(fā)光信號(hào)降低值進(jìn)行檢測(cè)。圖1.3 非標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)溶菌酶原理圖Fig. 1.3 Schematic diagram of the label-free aptasensor for the detection of lysozyme.2. 陣列生物傳感

15、器的研究陣列生物傳感器是一種用可檢測(cè)的信號(hào)實(shí)現(xiàn)高通量生物學(xué)信息的轉(zhuǎn)換和獲取的傳感器件，是多個(gè)生物傳感器的集合體。它由分子識(shí)別物質(zhì)和換能器組成。陣列生物傳感器具有分析通量高、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)12。基于不同的檢測(cè)技術(shù)，發(fā)展了熒光陣列生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器、電化學(xué)發(fā)光生物傳感器等。2.1 熒光陣列生物傳感器Doong等人13利用溶膠-凝膠技術(shù)，將辣根過氧化物酶、谷氨酸脫氫酶和乙酰膽堿酯酶分別與不同的熒光物質(zhì)共同固定于載玻片上，采用熒光法同時(shí)測(cè)定老年癡呆癥的幾種生物標(biāo)示物- 淀粉樣多肽、谷氨酸和乙酰膽堿，對(duì)應(yīng)的檢測(cè)限分別為 0.63nM、0.55mM和1.0mM，并且沒有明顯的交叉干擾。Huan

16、g14等人以光量子表面作為傳感平臺(tái)構(gòu)建了高靈敏檢測(cè)腫瘤標(biāo)示物的蛋白陣列，實(shí)現(xiàn)了24種抗原的同時(shí)測(cè)定。在構(gòu)建的光量子表面的傳感平臺(tái)上，青色素5在其激發(fā)波長處能夠產(chǎn)生光學(xué)共振，從而可以提高了青色素5的熒光強(qiáng)度，使得陣列傳感器的靈敏度大大提高，該研究獲得了較低的檢測(cè)限（2 pg/mL）。2.2 電化學(xué)陣列生物傳感器Polsky等人15通過在陣列電極上可尋址固定探針DNA和捕獲抗體，發(fā)展了用于乳腺癌基因（BRCA1）和人白細(xì)胞介素-12（IL-12）同時(shí)檢測(cè)的傳感陣列。圖1.4是可尋址的固定探針DNA和捕獲抗體的示意圖。先將對(duì)氨基苯甲酸的重氮鹽可尋址的修飾在5個(gè)指定的電極上，通過羧基和氨基的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)探

17、針DNA的固定，再將修飾有重氮鹽的抗體通過電化學(xué)還原沉積在其余的四個(gè)電極上。此方法成功的將不同生物分子可尋址地固定在陣列電極的指定位置上，制得的陣列傳感器有好的選擇性，在復(fù)雜基質(zhì)中也能實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的準(zhǔn)確檢測(cè)。2008年，該小組16以修飾有重氮鹽的生物素標(biāo)記的抗體為模型，以親和素標(biāo)記的金納米和親和素標(biāo)記的HRP為信號(hào)，詳細(xì)探討了重氮化抗體在電極上的固定條件。以重組的腫瘤壞死因子（TNF）、 白細(xì)胞介素（IL-12）和人白細(xì)胞介素-1（IL-1）為模型，采用夾心模式，以HRP標(biāo)記的抗體為信號(hào)抗體，考察了基于電化學(xué)重氮鹽法構(gòu)建的可尋址多物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)的陣列傳感器的分析性能49。圖1.4電化學(xué)還原重氮鹽

18、法構(gòu)建的可尋址型DNA和抗體陣列傳感器的示意圖Fig. 1.4 DNA and antibody probe electrode array selectively functionalized via electroaddressable deposition of diazonium salts.2.3 電化學(xué)發(fā)光陣列生物傳感器2009年，Walt小組17報(bào)道了一種利用光纖陣列和聚苯乙烯微球?qū)Χ喾N抗原實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)的電化學(xué)發(fā)光方法。原理圖如1.5所示：首先將捕獲抗體各自固定在聚苯乙烯微球上，通過抗原-抗體的相互作用，將生物素標(biāo)記的抗體與目標(biāo)抗原結(jié)合，通過鏈霉親和素與生物素的相互作用，將釕聯(lián)吡

19、啶絡(luò)合物標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合，從而形成聚乙烯微球-抗體/目標(biāo)抗原/生物素標(biāo)記的抗體/釕聯(lián)吡啶絡(luò)合物標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物，將上述含有不同目標(biāo)抗原的聚苯乙烯微球填充到經(jīng)刻蝕并涂覆金層的光纖束的微孔中，從而形成電化學(xué)發(fā)光陣列，通過電化學(xué)發(fā)光成像來收集電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、白細(xì)胞介素-8 （IL-8）和金屬蛋白酶-1（ TIMP-1）的同時(shí)測(cè)定。 圖1.5多重夾心結(jié)構(gòu)電化學(xué)發(fā)光成像同時(shí)檢測(cè)VEGF、IL-8、TIMP-1Fig. 1.5 Multiplexed Sandwich Immunoassays Using Electrochemilu

20、minescence Imaging for the detection of VEGF , IL-8 and TIMP-12011年，美國Rusling研究小組18以腫瘤標(biāo)示物為對(duì)象，結(jié)合納米放大技術(shù)，以抗原/抗體之間的作用為基礎(chǔ)，建立了檢測(cè)腫瘤標(biāo)示物的電化學(xué)發(fā)光分析方法。研制了一種電化學(xué)發(fā)光陣列芯片，實(shí)現(xiàn)了對(duì)白介素6 (IL-6)和前列腺特異性抗原(PSA)的同時(shí)檢測(cè)。檢測(cè)原理如圖1.6 所示，碳納米管修飾的石墨芯片為傳感器平臺(tái)，Ru(bpy)32+作為電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)，二氧化硅納米粒子包裹的Ru(bpy)32+連接的抗體為信號(hào)抗體，在白細(xì)胞介素-6和前列腺特異性抗原存在下，分別形成夾心

21、復(fù)合物，用電化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)對(duì)白細(xì)胞介素-6和前列腺特異性抗原的進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。由于采用二氧化硅納米粒子多負(fù)載信號(hào)物質(zhì)Ru(bpy)32+的策略，白細(xì)胞介素-6的檢測(cè)限為0.25 pg/mL，前列腺特異性抗原的檢測(cè)限為1.0 pg/mL。這種多負(fù)載信號(hào)物質(zhì)的策略和陣列芯片的使用實(shí)現(xiàn)了高靈敏同時(shí)檢測(cè)多組份物質(zhì)，此工作將為同時(shí)檢測(cè)多組份物質(zhì)提供新的思路。圖1.6 電化學(xué)發(fā)光免疫同時(shí)檢測(cè)前列腺特異性抗原和白細(xì)胞介素-6Fig. 1.6 ECL Immunoarray detection of PSA and IL-6. 國內(nèi)電化學(xué)發(fā)光陣列傳感方面的工作近年來也得到人們的關(guān)注。2009年華東師范大學(xué)Fa

22、ng 等人19利用電化學(xué)固定化方法，選擇性的固定二氧化硅/殼聚糖包覆釕聯(lián)吡啶于金陣列電極表面，構(gòu)建了基于固定化釕聯(lián)吡啶的電化學(xué)發(fā)光陣列化學(xué)傳感器，進(jìn)行了TPA的分析檢測(cè)。2011年西南大學(xué)的Fu等人 20以印刷碳電極為檢測(cè)平臺(tái)，4個(gè)碳電極為工作電極，利用電化學(xué)發(fā)光免疫陣列傳感進(jìn)行人、兔和鼠免疫球蛋白的檢測(cè)。通過人為控制PMT的檢測(cè)位點(diǎn)，分別施加電壓進(jìn)行三物質(zhì)的順序檢測(cè)。2012年南京大學(xué)的Chen等人21利用量子點(diǎn)CdS和釕聯(lián)吡啶之間的電化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移，在ITO電極上利用免疫競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行了癌胚抗原、甲胎蛋白和前列腺抗原的同時(shí)檢測(cè)。2012-2013年濟(jì)南大學(xué)的Yu 等人22-24分別以釕聯(lián)吡啶

23、和碳納米點(diǎn)為電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)，結(jié)合流動(dòng)注射、微芯片技術(shù)和電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，進(jìn)行了癌胚抗原、甲胎蛋白和前列腺抗原等腫瘤標(biāo)識(shí)物的電化學(xué)發(fā)光順序檢測(cè)。3.雙極性電極在電化學(xué)發(fā)光分析中的應(yīng)用研究3.1雙極性電極系統(tǒng)原理：雙極性電極（bipolar electrode）是一個(gè)不與外電源連接而置于驅(qū)動(dòng)陰極和陽極之間電解液中的導(dǎo)體25,26。它是一個(gè)與離子導(dǎo)體相連接的電子導(dǎo)體。當(dāng)一個(gè)足夠高的電場(chǎng)施加于離子相時(shí)，即使雙極性電極與外電源沒有直接的電連接，法拉第反應(yīng)也能在雙極性電極的兩端發(fā)生。與傳統(tǒng)電化學(xué)三電極系統(tǒng)中的工作電極相比，雙極性電極有三點(diǎn)不同：（1）不與外電源直接電線連接；（2）電極與溶液間的電

24、位差決定于溶液中的電場(chǎng)，而不是直接決定于電位儀控制的界面電位；（3）雙極性電極上陽極端發(fā)生氧化反應(yīng)，陰極端發(fā)生還原反應(yīng)，即面對(duì)著驅(qū)動(dòng)陽極的一側(cè)起著陰極作用，面對(duì)著驅(qū)動(dòng)陰極的另一側(cè)起著陽極作用，而傳統(tǒng)的工作電極上只發(fā)生氧化反應(yīng)或還原反應(yīng)中的一種。經(jīng)過十年的發(fā)展，雙極性電化學(xué)已經(jīng)不再是無人問津的課題，而是逐漸發(fā)展成為能夠?qū)㈦娀瘜W(xué)方法集成于芯片實(shí)驗(yàn)室的一種非常有前途的新技術(shù)。一個(gè)電化學(xué)反應(yīng)能否發(fā)生，決定于電極與溶液間界面電位差的大小。換句話說，電子轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)力是界面電位差，而不是電極或者溶液的絕對(duì)電位27。在傳統(tǒng)的三電極電化學(xué)系統(tǒng)中，工作電極的電位通過恒電位儀控制，而溶液的電位不能直接控制，如圖1.

25、7a所示。也就是說，界面電位差由工作電極來決定。當(dāng)工作電極的電位控制在比溶液中電活性分子發(fā)生反應(yīng)的電位更負(fù)時(shí)，電子從電極轉(zhuǎn)移到溶液中的還原組分；同理，電化學(xué)氧化時(shí)，電子轉(zhuǎn)移的方向相反。如圖1.7b所示。在工作電極與對(duì)極間測(cè)量到的電流直接與電化學(xué)反應(yīng)的速率成正比。圖1.7 三電極系統(tǒng)與雙極性電極系統(tǒng)構(gòu)造圖Fig.1.7 Configuration of three-electrode and bipolar-electrode雙極性電極的構(gòu)造與傳統(tǒng)體系有點(diǎn)相反。即溶液與電極間的界面電位差決定于溶液中的電場(chǎng)分布。盡管在雙極性電極的實(shí)驗(yàn)中,溶液和電極的作用互換,但我們?nèi)匀豢梢詫?duì)界面電位差進(jìn)行控制。雙

26、極性電極的構(gòu)造如圖1.7c所示。一個(gè)與外電源沒有連接的導(dǎo)體材料被放置在一個(gè)微通道中。通道的兩端各有一個(gè)驅(qū)動(dòng)電極，由一個(gè)簡(jiǎn)單的直流電源為這兩個(gè)驅(qū)動(dòng)電極提供電壓降Etot。因?yàn)橥ǖ离娮韬芨?，施加于通道兩端的Etot大部分沿通道線性降落。與類似的并聯(lián)電路進(jìn)行對(duì)比，能夠幫助理解雙極性電極如何響應(yīng)Etot，如圖1.8a，1.8b， 1.8c。當(dāng)電流通過雙極性電極時(shí)，就會(huì)在其兩端產(chǎn)生電位差。根據(jù)并聯(lián)電路中，各支路兩端電壓相等的原理可知，雙極性電極兩端的電位差Eelec等于Etot在該位置處、相同長度的電解質(zhì)溶液上產(chǎn)生的電壓降。因此，Eelec是通道總壓降Etot的一部分(圖3.2c)，是Etot和電極長度

27、lelec的函數(shù)。圖1.8 雙極性電極系統(tǒng)原理圖Fig.1.8 Schematic diagram for bipolar-electrodeEtot代表了雙極性電極的兩極上耦合的兩個(gè)法拉第反應(yīng)的總驅(qū)動(dòng)力。對(duì)于同時(shí)發(fā)生的這兩個(gè)氧化還原反應(yīng)，Eelec值必須高于這兩個(gè)反應(yīng)式量電位的差值。當(dāng)RsRe（即通道中的電流主要由離子遷移承擔(dān)）時(shí)，體系中Eelec可以通過(1)式估算：(1)這說明，對(duì)于一個(gè)給定的電場(chǎng)強(qiáng)度（Etot/lchannel），電極越長，則產(chǎn)生的Eelec值就越大，相應(yīng)的ibpe也就越大。因此，Etot值的大小能否觸發(fā)電化學(xué)反應(yīng)，既決定于溶液組成，也跟電極長度和通道長度的比值有關(guān)。對(duì)

28、于已經(jīng)報(bào)道的大部分結(jié)果，Etot的范圍在2030V之間，沒有超過100V的。因此，廉價(jià)的電源就能用來進(jìn)行許多有趣的雙極性電極實(shí)驗(yàn)。3.2 雙極性電極在用電致化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)電活性分子研究國際上對(duì)于雙極性電極的研究小組主要有：美國Richard M. Crooks教授 (The University of Texas at Austin)；法國Francois Mavre教授 (Universite´ Paris Diderot)；瑞典Leif Nyholm教授 (Linko¨ping University)；德國Ulrich Tallarek教授 (Philipps-UniV

29、ersita¨t Marburg)等，國內(nèi)有南京大學(xué)徐靜娟教授和陳洪淵院士研究小組。2001年，Andreas Manz等人首次將電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)應(yīng)用于雙極性電極中28，提出利用雙極性電極陽極端的電化學(xué)發(fā)光間接報(bào)告陰極端的法拉第電流這一非常有發(fā)展?jié)摿Φ牟呗?9,30，利用溶液中陰極端O2和H2O的電化學(xué)還原可檢測(cè)陽極端的10-16 mol Ru(phen)32+ (10-6 M) 和 4.5´10-16 mol Ru(bpy)32+ (5´10-6 M)；2008年，Crooks等人開始研究雙極性電極微電化學(xué)陣列30，他們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)無電線連接的DNA微電化學(xué)陣列，如

30、圖1.9所示，將陰極端固定有相同序列單鏈DNA探針的3個(gè)微金雙極電極 (1.00×0.25 mm)，即將所制備的DNA微電化學(xué)陣列暴露于用4-nm Pt納米粒子標(biāo)記的與目標(biāo)DNA完全匹配的DNA雜交后，置于PDMS微通道（長1.2 cm，寬1.7 mm，高28mm）中，通道裝有Ru(bpy)32+和TPrA水溶液，基于雜交，標(biāo)記的Pt納米粒子催化溶解氧的還原，對(duì)這一反應(yīng)所需要的電子來源于Ru(bpy)32+和TPrA的氧化。因此，在雙極性電極的陽極端產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。雙極性電極具有長度可調(diào)固有的性質(zhì)，在微電化學(xué)陣列的電極數(shù)量上可以大大地增加而不受到限制，而且仍保持著常規(guī)三電極陣列的所有

31、優(yōu)點(diǎn)。盡管沒有考察檢測(cè)靈敏度，但是為雙極性電極電化學(xué)發(fā)光DNA檢測(cè)開創(chuàng)了新途徑。2008年，Crooks等人31還發(fā)展了由1000個(gè)金微雙極性電極的微電化學(xué)陣列，每一個(gè)雙極性電極長500 mm、寬50 mm，用一對(duì)驅(qū)動(dòng)電極就可以使所有1000個(gè)雙極性電極活化而在陽極端發(fā)射光。然而，和微流控裝置相比，電解池的構(gòu)造卻非常的簡(jiǎn)單：將上面載有電極的玻璃板浸入盛有電解質(zhì)、Ru(bpy)32+和TPrA混合溶液的池子中，并在池子的兩端各放置一個(gè)不銹鋼板作為驅(qū)動(dòng)電極即可。平行放置的驅(qū)動(dòng)電極能夠保證池子中的電場(chǎng)是勻強(qiáng)電場(chǎng)（如圖1.10 b所示）。當(dāng)通道總電壓Etot足夠高時(shí)，即使沒有DNA的參與，每個(gè)雙極性電

32、極的陽極也會(huì)產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光（如圖1.10c所示）。該裝置并沒有涉及DNA，為了只達(dá)到驗(yàn)證的目的，陰極反應(yīng)只簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)為在金雙極電極直接還原氧氣為水。圖1.10d表示的是圖1.10c中三個(gè)白色箭頭所指橫排處，所有電極的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度分布圖。該研究工作雖然沒有涉及DNA等生物檢測(cè)，但是，均勻的發(fā)射強(qiáng)度表明這些大容量的陣列在傳感應(yīng)用領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。2011年，南京大學(xué)徐靜娟教授和陳洪淵院士研究小組32,33成功地利用ITO芯片雙極性電極建立了電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)細(xì)胞的新方法。 圖1.9 微型雙極性電極電化學(xué)發(fā)光DNA陣列傳感器Fig.1.9 A schematic of a microdevice

33、 showing three BPEs and the driving electrodes and an illustration showing an approach for sensing DNA.圖3.4 大規(guī)模雙極性電極電化學(xué)發(fā)光陣列Fig.3.4 Optical micrograph(a)、electrolytic cell configuration(b)、Electrochemiluminescence micrograph (c) and ECL intensity profile(d) of an array comprising 1000 individual BPEs

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