黃曲霉毒素測(cè)定

1、73 黃曲霉毒素測(cè)定黃曲霉毒素的測(cè)定 黃曲霉毒素（Aflatoxins,簡(jiǎn)寫AFT），是黃曲霉、寄生曲霉及溫特曲霉等產(chǎn)毒株的代謝產(chǎn)物，是一群結(jié)構(gòu)類似的化合物。目前已發(fā)現(xiàn)17種黃曲霉毒素，根據(jù)其在波長(zhǎng)為365nm紫外光下呈現(xiàn)不同顏色的熒光而分為B、G二大類，其中B大類在氧化鋁薄層板上于紫外光下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，而G大類則呈綠色熒光。 黃曲霉毒素屬劇毒物質(zhì)，其毒性比氰化鉀還高，也是目前最強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)。其中AFT B1的毒性和致癌性最強(qiáng)，幫其在食品中允許量各國(guó)都有嚴(yán)格規(guī)定。 AFT主要污染糧油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染嚴(yán)重。黃曲霉毒素允許量標(biāo)準(zhǔn) 食品品種允許量標(biāo)準(zhǔn)（ppb或1

2、0-6） 玉米、花生、花生油20 玉米及花生制品20 大米、其他食用油10 裱花蛋糕、餅干、面包5 嬰兒代乳食品不得檢出本章重點(diǎn) 薄層層析法測(cè)黃曲霉毒素 薄層層析是在黃曲霉毒素研究方面應(yīng)用最廣的分離技術(shù)。自1990年，它被列為AOAC(association of official agricultural chemists)標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法同時(shí)具有定性和定量分析黃曲霉毒素的功能。原理 本法是利用樣品中的黃曲霉毒素B1，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、凈化、濃縮、薄層分離后，在波長(zhǎng)365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來(lái)測(cè)定黃曲霉毒素B1的含量。 薄層色譜法黃曲霉毒素Bt的最低檢

3、出量為0000 4ug，最低檢出濃度為5ugKg。儀器儀器 小型粉碎機(jī) 樣篩 電動(dòng)振蕩器 玻璃濃縮器 玻璃板5cm20cm、薄層板涂布器 展開槽(25cm6cm4cm) 紫外光燈100一125w、波長(zhǎng)365nm濾光片、微量注射器試劑 三氯甲烷、正己烷(沸程3060)或石油醚(沸程6090)、甲醇、苯、乙腈、無(wú)水乙醚或乙醚經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水、丙酮。以上試劑在試驗(yàn)前需先進(jìn)行空白試驗(yàn)，如不干擾測(cè)定即可使用，否則需逐一進(jìn)行重蒸。吸附劑硅膠 薄層層析用硅膠有多種規(guī)格。 應(yīng)用最多的是摻有粘合劑石膏的硅膠，稱有硅膠G，其摻入的石膏量為5-20%不等。硅膠有時(shí)含有鐵鹽及氯離子等雜質(zhì)，它們可被展開劑提取出來(lái)，對(duì)層

4、析的結(jié)果產(chǎn)生一定影響。 硅膠H不含粘合劑和其他添加劑（不會(huì)被展開劑提出雜質(zhì)）。 硅膠HF254 摻有熒光指示劑，可在短波254納米的紫外光下觀察到熒光。 硅膠GF254含石膏及熒光物質(zhì)。黃曲霉毒素黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液 1、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取112mg AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光、于冰箱4保存。此標(biāo)準(zhǔn)液濃度約為10ugmL。先用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，再用苯一乙腈混合液調(diào)整其濃度為準(zhǔn)確100ugmL。在350nm，AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩爾消光系數(shù)為19 800 .2、黃曲霉毒素B標(biāo)準(zhǔn)使用液： I液(1.0

5、ugmL)：取1mL AFTB標(biāo)準(zhǔn)液(10.0ugmL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀釋、定容。 液(0.2ugmL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 液(0.04ugmL)：取液1mI。，按上法定容5mI。思考：在配制黃曲霉毒素B標(biāo)準(zhǔn)使用液時(shí)，為什么需要用貯備液來(lái)稀釋而不是直接配制？ 次氯酸鈉溶液次氯酸鈉溶液 配制：取100g漂白粉，加入500mL水，攪拌均勻。另將80g工業(yè)用碳酸鈉(Na2CO3H2O)溶于500mL溫水中。將兩液合并、攪拌、澄清、過(guò)濾。此液含次氯酸25gL。 思考題： 1、次氯酸鈉溶液的作用是什么？ 消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸鈉溶液浸泡可達(dá)到去毒的效果。 2

6、、為什么次氯酸鈉溶液能起到消毒的作用？操作步驟操作步驟 樣品處理提取 濃縮薄板制備點(diǎn)樣展開定量(1)樣品處理樣品處理 樣品從大樣經(jīng)粗碎及連續(xù)多次用四分法縮減至05l kg后全部粉碎。糧食樣品全部通過(guò)20目篩，花生樣品全部通過(guò)10目篩、混勻。(2)提取提取 稱取20.00g經(jīng)粉碎樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水清液。 振蕩30min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過(guò)濾于分液漏斗中，待下層甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶?jī)?nèi)。 取20.00mL甲醇水溶液置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振搖2min、靜置分層，如出現(xiàn)乳

7、化現(xiàn)象，可滴加甲醇促使分層。放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10g預(yù)先用三氯甲烷濕潤(rùn)的無(wú)水硫酸鈉的定量慢速濾紙，過(guò)濾于50mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗過(guò)濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。濃縮 將蒸發(fā)皿放在通風(fēng)柜，于65水浴上通風(fēng)揮干，然后于冰盒上冷卻23min后，準(zhǔn)確加入1mL苯一乙腈混合液。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只旌?，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL的具塞試管中。 注意：若有苯的結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失。測(cè)定單向展開法 1、薄板制備：稱取3g硅膠G，加23倍量的水，研磨12min呈糊狀后

8、，倒人涂布器推成5cm20cm，厚度約0.25mm的薄層板3塊。在空氣中干燥15min，在100活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存23d，若放置時(shí)間較長(zhǎng)，可再活化后使用。點(diǎn)樣 將薄板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血紅素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距為lcm，點(diǎn)直徑約3mm，在同一板上滴加點(diǎn)的大小應(yīng)一致，滴加時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)用冷風(fēng)邊吸邊加。滴加樣式如下： 第一點(diǎn)：10L AFTB，標(biāo)準(zhǔn)使用液(004gmL)。 第二點(diǎn)：20L樣液。 第三點(diǎn)：20L樣液+10L 0.04gmL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第四點(diǎn)：20L樣液+10L 0.02tL

9、g，m L AFTB。標(biāo)準(zhǔn)使用液。展開與觀察展開與觀察 在展開槽內(nèi)加10mL無(wú)水乙醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展開1012cm，取出，在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下： a由于樣液上加滴了AFTB1標(biāo)準(zhǔn)，可使AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液中AFTB1熒光點(diǎn)重疊。若樣液為陰性，薄板上第三點(diǎn)AFTB1為0000 4g，可用作檢查樣液中AFTB1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；若樣液為陽(yáng)性；則起定性作用。薄層板上第四點(diǎn)AFTB1標(biāo)準(zhǔn)為0002ug主要起定位作用。 b若第二點(diǎn)與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)位置上無(wú)藍(lán)色熒光點(diǎn)，則表示樣品中AFTBl含量5ugkg；若在相應(yīng)位置

10、上有藍(lán)色熒光點(diǎn)，則須進(jìn)行確證試驗(yàn)。確證試驗(yàn)確證試驗(yàn) 為確認(rèn)薄層樣上樣液熒光系由黃曲霉毒素B1產(chǎn)生的，加滴三氟乙酸，產(chǎn)生AFTB1的衍生物，展開后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)。 第一點(diǎn)：10uL 004ugmL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第二點(diǎn)：20L樣液于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2min(板上溫度不高于40)，再于薄層板上滴加以下兩點(diǎn)。 第三點(diǎn)：10uL 0.04ugmL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。第四點(diǎn)：20L樣液。 按上法展開并觀察，樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四兩點(diǎn)，可依次作為標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)的衍

11、生物空白對(duì)照。 稀釋定量：樣液中的AFTB1熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，如與AFTB1。標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)最低檢出量(0.00 04g)的熒光強(qiáng)度一致，則樣品中AFTB1含量為即為5gkg 若樣液中熒光強(qiáng)度比最低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)，減少滴加微升數(shù)，或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。滴加式樣如下：第一點(diǎn)：l0uL AFTB1，標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.04ugmL)。第二點(diǎn)：根據(jù)情況滴加10uL樣液。第三點(diǎn)：根據(jù)情況滴加15uL樣液。第四點(diǎn)：根據(jù)情況滴加20uL樣液。4)結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算 X = 式中：X 一 樣品中AFTBl的含量，ugkg； V1一加入苯一乙腈混合液的

12、體積，mL； V2出現(xiàn)最低熒光時(shí)滴加樣液的體積，mL； D一樣液的總稀釋倍數(shù)； m1加入苯一乙腈混合液溶解時(shí)相當(dāng)樣品的質(zhì)量， g； 0.0004AFTBl的最低檢出限量，ug。測(cè)定雙向展開法測(cè)定雙向展開法 原理 如用單向展開法后，薄層色譜由于雜質(zhì)干擾掩蓋了AFTB1的熒光強(qiáng)度，需采用雙向展開法。薄層板先用無(wú)水乙醚做橫向展開，將干擾的雜質(zhì)展至樣液點(diǎn)的一邊，而AFTB1不動(dòng)，然后再用丙酮一三氯甲烷(8+92)做縱向展開，樣品在相應(yīng)處的雜質(zhì)底色大量減少，因而提高了方法的靈敏度。 操作步驟操作步驟 (1)點(diǎn)樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上，在距左邊緣081cm第二篇食品理化檢測(cè)技術(shù)處，各滴加10

13、uL AFTB1(0.04ugmL)標(biāo)準(zhǔn)液，在距左邊緣2.83cm處，各滴加20uL樣液。然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上滴加l0uL AFTBl(0.04ugmL)標(biāo)準(zhǔn)液，在第三塊板的樣液點(diǎn)上滴加10uL AFTB1(0.02ugmL)標(biāo)準(zhǔn)液。(2)展開：展開： a橫向展開：在展開槽內(nèi)的長(zhǎng)邊置一玻璃支架，加10mL無(wú)水乙醇，將上述點(diǎn)好的薄層板靠標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長(zhǎng)邊，置于展開槽內(nèi)展開，展至板端后，取出揮干。根據(jù)情況，需要時(shí)，可再重復(fù)l2次。 b縱向展開：揮干的薄層板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展開至1012cm為止。丙酮與氯甲烷的比例，根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。 觀察與評(píng)定結(jié)果觀察與評(píng)定結(jié)果 a在紫外光下觀察第一

14、、二塊板，若第二塊板在AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而在第一板與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光，則樣品中AFTBl含量5ugkg. b若第一塊板與第二塊板的相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一塊板與第三塊板比較，這第三塊板上第二點(diǎn)與第一塊板上第二點(diǎn)的相同位置上的熒光點(diǎn)是否與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗(yàn)。在具體測(cè)定中，三塊板可以同時(shí)做，也可按順序做。當(dāng)?shù)谝粔K板出現(xiàn)陰性時(shí)，第三塊板可以省略，如第一塊板為陽(yáng)性，則第二塊板可省略，直接做第三塊。確認(rèn)試驗(yàn)確認(rèn)試驗(yàn) 另取薄層板二塊，于第四、五兩板距左邊緣0.81cm處，各滴加10u LATTB1(0.04ugmL)標(biāo)準(zhǔn)液及一小滴三氟乙酸

15、；在距左邊緣2.83cm處，于第四板滴加20uL樣液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20gL樣液、10uL。AFTBl(0.04ugmL)標(biāo)準(zhǔn)液及一小滴三氟乙酸，反應(yīng)5min后，用熱風(fēng)吹2min(板上溫度不高于40)。再用雙向展開法展開后，觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物。觀察時(shí)，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。若樣液AFTB1含量較高時(shí)，則將樣液稀釋后，按單向展開法中(4)做確認(rèn)試驗(yàn) . (5)稀釋定量：稀釋定量： 若樣液中AFTBl含量較高，可按單向展開法中(5)稀釋定量操作。若AFTB1含量較低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果判斷，可將樣液再做雙向展

16、開法測(cè)定，以確定含量。 3.2.3 結(jié)果計(jì)算 同單向展開法。 3.2.4 說(shuō)明及注意事項(xiàng) 用過(guò)后受污染的玻璃器皿，應(yīng)經(jīng)次氯酸溶液(25gL)，浸泡消毒后再清洗之。 2、黃曲霉毒素B標(biāo)準(zhǔn)使用液： I液(1.0ugmL)：取1mL AFTB標(biāo)準(zhǔn)液(10.0ugmL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀釋、定容。 液(0.2ugmL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 液(0.04ugmL)：取液1mI。，按上法定容5mI。思考：在配制黃曲霉毒素B標(biāo)準(zhǔn)使用液時(shí)，為什么需要用貯備液來(lái)稀釋而不是直接配制？ 第一點(diǎn)：10L AFTB，標(biāo)準(zhǔn)使用液(004gmL)。 第二點(diǎn)：20L樣液。 第三點(diǎn)：20L樣液

17、+10L 0.04gmL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第四點(diǎn)：20L樣液+10L 0.02tLg，m L AFTB。標(biāo)準(zhǔn)使用液。確證試驗(yàn)確證試驗(yàn) 為確認(rèn)薄層樣上樣液熒光系由黃曲霉毒素B1產(chǎn)生的，加滴三氟乙酸，產(chǎn)生AFTB1的衍生物，展開后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)。 第一點(diǎn)：10uL 004ugmL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。 第二點(diǎn)：20L樣液于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2min(板上溫度不高于40)，再于薄層板上滴加以下兩點(diǎn)。 第三點(diǎn)：10uL 0.04ugmL AFTBl標(biāo)準(zhǔn)使用液。第四點(diǎn)：20L樣液。4)結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算 X = 式中：X 一 樣品中AFTBl的含量，ugkg； V1一加入苯一乙腈混合液的體積，mL； V2出現(xiàn)最低熒光時(shí)滴加樣液的體積，mL； D一樣液的總稀釋倍數(shù)； m1加入苯一乙腈混合液溶解時(shí)相當(dāng)樣品的質(zhì)量， g； 0.0004AFTBl的最低檢出限量，ug。操作步驟操作步驟 (1)點(diǎn)樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上，在距左邊緣081cm第二篇食品理化檢測(cè)技術(shù)處，各滴加10uL AFTB1(0.04ugmL)