第四章高效液相色譜分析法

1、生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第四章第四章 高效液相色譜分析法高效液相色譜分析法第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀 第二節(jié)第二節(jié) 主要分離類型主要分離類型第三節(jié)第三節(jié) 液相色譜的固定相與流動(dòng)相液相色譜的固定相與流動(dòng)相第四節(jié)第四節(jié) 影響分離的因素與分離類型的選擇影響分離的因素與分離類型的選擇生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀美國安捷倫公司美國安捷倫公司 Agilent 1200生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀美國戴安公司美國戴安公司 UltiMa

2、te3000生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀一、一、 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程 二、二、 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)三、三、 梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置六、六、 液相色譜檢測器液相色譜檢測器五、五、 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)四、四、 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀儲液瓶儲液瓶高壓泵高壓泵進(jìn)樣器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱檢測器檢測器廢液廢液一、一、 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程 高壓輸液泵、高效分離住、高靈敏度檢測器高壓輸液泵、高效分離住、

3、高靈敏度檢測器生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀二、二、 高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵）高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵）要求：要求：輸出壓力高；輸出壓力高；平穩(wěn)、脈沖??；平穩(wěn)、脈沖小；流量穩(wěn)定可調(diào)；流量穩(wěn)定可調(diào)；耐腐蝕。耐腐蝕。機(jī)械往復(fù)柱塞泵結(jié)構(gòu)圖機(jī)械往復(fù)柱塞泵結(jié)構(gòu)圖生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀三、三、 梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置 在液相色譜中在液相色譜中, ,可以通過改變流動(dòng)相的組成、可以通過改變流動(dòng)相的組成、極性來改善分離和調(diào)節(jié)出峰時(shí)間。極性來改善分離和調(diào)節(jié)出峰時(shí)間。生物與化學(xué)工程學(xué)院

4、生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定比例送入混合器，混合后進(jìn)入色譜柱。比例送入混合器，混合后進(jìn)入色譜柱。一臺高壓泵一臺高壓泵, , 通過比例調(diào)節(jié)閥通過比例調(diào)節(jié)閥, ,將兩種或多種不同將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入混合器中混合。極性的溶劑按一定的比例抽入混合器中混合。高壓梯度高壓梯度(外梯度外梯度)低壓梯度低壓梯度( (內(nèi)梯度內(nèi)梯度) )生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀通過改變流動(dòng)相的組成來調(diào)整組分通

5、過改變流動(dòng)相的組成來調(diào)整組分的的k值，改變分離因子值，改變分離因子值，以達(dá)到值，以達(dá)到最短時(shí)間內(nèi)得到最佳分離的目的。最短時(shí)間內(nèi)得到最佳分離的目的。梯度洗脫梯度洗脫梯度洗脫梯度洗脫的特點(diǎn)的特點(diǎn)改善分離改善分離, 加快分析速度；加快分析速度；改善峰形改善峰形, 減少拖尾減少拖尾;可能引起可能引起基線漂移?；€漂移。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀四、四、 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)六通閥進(jìn)樣六通閥進(jìn)樣 裝置裝置生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀內(nèi)徑：內(nèi)徑：16 mm，柱長：柱長：550

6、cm；柱填料粒徑：柱填料粒徑：5 10m 為保護(hù)色譜柱，為保護(hù)色譜柱，通常在柱前加一支填料與色譜柱相同的保護(hù)柱。通常在柱前加一支填料與色譜柱相同的保護(hù)柱。 五、五、 分離系統(tǒng)（色譜柱）分離系統(tǒng)（色譜柱）生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀六、六、 液相色譜檢測器液相色譜檢測器類類型型紫外檢測器紫外檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器熒光檢測器熒光檢測器電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀（一）、紫外檢測器（一）、紫外檢測器應(yīng)用最廣泛的檢測

7、器應(yīng)用最廣泛的檢測器基本原理：基本原理：試樣組分對特定波長的紫外光具有選擇試樣組分對特定波長的紫外光具有選擇性的吸收，吸光度與試樣組分濃度之間的定量關(guān)系性的吸收，吸光度與試樣組分濃度之間的定量關(guān)系符合郎伯符合郎伯- -比耳定律。比耳定律。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，線形范圍寬；靈敏度高，線形范圍寬；死體積小；死體積??；波長可選；波長可選；對流速和溫度變化不對流速和溫度變化不 敏感；敏感；可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵?。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：無紫外無紫外-可見吸收組分不響應(yīng)；可見吸收組分不響應(yīng)；流動(dòng)相選擇受一定限制。流動(dòng)相選擇受一定限制。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相

8、色譜儀高效液相色譜儀一些常用溶劑的紫外截止波長一些常用溶劑的紫外截止波長溶劑溶劑二硫二硫化碳化碳氯仿氯仿四氫四氫呋喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截止紫外截止波長波長/nm380245212210190205187生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀(a) 可變波長紫外檢測器可變波長紫外檢測器(b) 二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀兩種檢測器的色譜圖兩種檢測器的色譜圖(a)：可變波長紫外檢測器；可變波長紫外檢測器；(b)：二極管陣列檢測器二極

9、管陣列檢測器峰純度峰純度檢驗(yàn)檢驗(yàn)生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀（二）、示差折光檢測器（二）、示差折光檢測器通用型檢測器通用型檢測器基本原理：基本原理：連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光系數(shù)差值，該值與試樣池流動(dòng)相中的組分濃的折光系數(shù)差值，該值與試樣池流動(dòng)相中的組分濃度成正比。度成正比。每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)。 生命科學(xué)中各類糖類化合物，沒有紫外吸收，生命科學(xué)中各類糖類化合物，沒有紫外吸收，一般要用示差折光檢測器。一般要用示差折光檢測器。 生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與

10、化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：靈敏度低；靈敏度低；對溫度敏感；對溫度敏感；不能用于梯度洗脫。不能用于梯度洗脫。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀（三）、熒光檢測器（三）、熒光檢測器專用型檢測器專用型檢測器 基本原理：基本原理：在一定的條件下，熒光強(qiáng)度與流動(dòng)在一定的條件下，熒光強(qiáng)度與流動(dòng)相中的組分的濃度成之比。相中的組分的濃度成之比。 對多環(huán)芳對多環(huán)芳烴，維生素?zé)N，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾

11、類化合物等有響應(yīng)。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 高靈敏度；高靈敏度； 高選擇性；高選擇性； 可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵?。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第二節(jié)第二節(jié) 主要分離類型主要分離類型一、液一、液-固吸附色譜固吸附色譜二、液二、液-液分配與化學(xué)鍵合相色譜液分配與化學(xué)鍵合相色譜三、離子交換色譜三、離子交換色譜四、離子對色譜四、離子對色譜五、空間排阻色譜五、空間排阻色譜六、親和色譜六、親和色譜生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第二節(jié)第二節(jié) 主要分離類型主要分離類型一、液一

12、、液-固吸附色譜固吸附色譜 流動(dòng)相流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。各種不同極性的一元或多元溶劑。固定相固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等。固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等。顆粒度較小，顆粒度較小，5-10m分離機(jī)理：分離機(jī)理：流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子(X)與溶劑分子與溶劑分子(S)在固體吸附劑上競爭吸附的結(jié)果。在固體吸附劑上競爭吸附的結(jié)果。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第二節(jié)第二節(jié) 主要分離類型主要分離類型MSSMXnSXnS 下標(biāo)下標(biāo)M、s分別代表流動(dòng)相和固定相，分別代表流動(dòng)相和固定相，n代表被吸附的代表被吸附的溶劑分子數(shù)；溶劑分子數(shù)；K代表吸附平衡常數(shù)

13、。代表吸附平衡常數(shù)。吸附平衡常數(shù)吸附平衡常數(shù)K不等于分配系數(shù)。不等于分配系數(shù)。K值越大，保留時(shí)間越長，分配系數(shù)大。值越大，保留時(shí)間越長，分配系數(shù)大。 適用對象：適用對象：相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第二節(jié)第二節(jié) 主要分離類型主要分離類型二、液二、液-液分配與化學(xué)鍵合相色譜液分配與化學(xué)鍵合相色譜（一）、液（一）、液- -液分配色譜液分配色譜固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）。固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）。基本原理基本原理：組

14、分在固定相和流動(dòng)相上的分配。：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配。與氣相色與氣相色譜中氣譜中氣-液液色譜比較？色譜比較？改變流動(dòng)相的組成來改變流動(dòng)相的組成來 改善分離效果。改善分離效果。K不僅與固定相的種不僅與固定相的種類有關(guān)，也與流動(dòng)相類有關(guān)，也與流動(dòng)相的種類有關(guān)。的種類有關(guān)。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第二節(jié)第二節(jié) 主要分離類型主要分離類型固定相極性固定相極性流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性正相分配色譜正相分配色譜（正相柱）（正相柱）組分極性越大，保留組分極性越大，保留時(shí)間越長；使用極性時(shí)間越長；使用極性化合物的分離?；衔锏姆蛛x。反相分配色譜反相分配色譜（反相柱）（反相柱）固定相極

15、性固定相極性流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性組分極性越小，保留組分極性越小，保留時(shí)間越長；適用非極時(shí)間越長；適用非極性化合物的分離。性化合物的分離。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第二節(jié)第二節(jié) 主要分離類型主要分離類型（二）、化學(xué)鍵合固定相色譜（二）、化學(xué)鍵合固定相色譜 固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因此它可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因此它適用于種類繁多樣品的分離。適用于種類繁多樣品的分離。特點(diǎn)特點(diǎn) 將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。

16、（擔(dān)體）表面的游離羥基上。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第二節(jié)第二節(jié) 主要分離類型主要分離類型1. 鍵合固定相制備鍵合固定相制備ODS(C18)鍵合相鍵合相硅膠硅膠十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非極性非極性硅烷化反應(yīng)硅烷化反應(yīng)使用使用pH范圍：范圍： 2-8生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第二節(jié)第二節(jié) 主要分離類型主要分離類型2. 鍵合固定相類型鍵合固定相類型類類型型反相柱反相柱正相柱正相柱氨丙基氨丙基氰乙基、醚和醇等氰乙基、醚和醇等極性基團(tuán)極性基團(tuán)不同碳原子數(shù)的不同碳原子數(shù)的烷烴（烷烴（C8和和C18）、）、苯基等疏水基團(tuán)苯基等疏水基團(tuán)生物與化學(xué)工程學(xué)

17、院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第二節(jié)第二節(jié) 主要分離類型主要分離類型保留時(shí)間：保留時(shí)間：例：以例：以O(shè)DS鍵合色譜柱、甲醇鍵合色譜柱、甲醇- -水為流動(dòng)相分離水為流動(dòng)相分離以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。以下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。COOHOHOHCOOHOHOHHO沒食子酸沒食子酸3,4-二羥基苯甲酸二羥基苯甲酸固定相固定相: 非極性非極性; 流動(dòng)相流動(dòng)相: 極性極性組分極性組分極性: 3,4-二羥基苯甲酸二羥基苯甲酸 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙丙酮酮 二氧六環(huán)二氧六環(huán) 四氫呋喃四氫呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酸乙酯乙酯 乙醚乙醚 異丙醚異

18、丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳環(huán)己烷環(huán)己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)常用溶劑的極性順序常用溶劑的極性順序生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第三節(jié)第三節(jié) 液相色譜的固定相與流動(dòng)相液相色譜的固定相與流動(dòng)相1、盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的問題選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的問題2、避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或、避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑

19、破壞損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。氧化鋁固定相等。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第三節(jié)第三節(jié) 液相色譜的固定相與流動(dòng)相液相色譜的固定相與流動(dòng)相3、試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止、試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。4、流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使、流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。用紫外檢測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第四節(jié)第四節(jié) 影響分離的因素與分離類型選擇影響分離的因素與分離類型選擇一、影響分離的因素一、影響分離的因素二、分離類型的選擇二、分離類型的選擇生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第四節(jié)第四節(jié) 影響分離的因素與分離類型選擇影響分離的因素與分離類型選擇一、影響分離的因素一、影響分離的因素速率方程速率方程2BD溶質(zhì)在液相流動(dòng)相溶質(zhì)在液相流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，約中的擴(kuò)散系數(shù)，約為氣相中擴(kuò)散系數(shù)為氣相中擴(kuò)散系數(shù)的萬分之一的萬分之一生物與化學(xué)工程學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院儀器分析儀器分析第四節(jié)第四節(jié) 影響分離的因素與分離類型選擇影響分離的因素與分離類型選擇修正的速率方程：修正的速率方程： A. 降低顆粒度大小，填充均勻；降低顆粒度大小