無毒苗木培養(yǎng)

1、13 植物脫毒技術(shù)植物脫毒技術(shù)13.1 引言引言 多數(shù)農(nóng)作物多易受一種或一種以上多數(shù)農(nóng)作物多易受一種或一種以上病毒的周身侵染。例以知草莓能感染病毒的周身侵染。例以知草莓能感染62種病毒和類菌質(zhì)體。種病毒和類菌質(zhì)體。 無病毒植株產(chǎn)量最多可提高無病毒植株產(chǎn)量最多可提高300%（平均為（平均為30%） 由于大部分病毒都不是通過種子傳由于大部分病毒都不是通過種子傳 播的，因此若是使用未受侵染或侵染播的，因此若是使用未受侵染或侵染程度較輕的個(gè)體的種子進(jìn)行繁殖就程度較輕的個(gè)體的種子進(jìn)行繁殖就有可能得到無病毒植株。有可能得到無病毒植株。 病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，在受侵染的

2、植物中，頂端分生的，在受侵染的植物中，頂端分生組織一般說或者是無毒的，或者只組織一般說或者是無毒的，或者只攜帶有濃度很低的病毒。攜帶有濃度很低的病毒。13.2 術(shù)語釋義術(shù)語釋義 “無病毒無病毒”植物一詞只有當(dāng)某些植物一詞只有當(dāng)某些病毒在特定的檢驗(yàn)中為負(fù)結(jié)果時(shí)，病毒在特定的檢驗(yàn)中為負(fù)結(jié)果時(shí)，才能說該植物不帶有那些病毒。才能說該植物不帶有那些病毒。13.3 通過熱處理消除病毒通過熱處理消除病毒熱空氣處理：把旺盛生長的植物移入到熱空氣處理：把旺盛生長的植物移入到一個(gè)熱療室中，在一個(gè)熱療室中，在3540。C下處理一段下處理一段時(shí)間即可。處理的時(shí)間的長短，可由幾時(shí)間即可。處理的時(shí)間的長短，可由幾分鐘到數(shù)

3、周不等。因植物而異。分鐘到數(shù)周不等。因植物而異。熱處理時(shí)，最初幾天空氣溫度應(yīng)逐步增熱處理時(shí)，最初幾天空氣溫度應(yīng)逐步增高，直到達(dá)到要求的溫度為止。若鈍化高，直到達(dá)到要求的溫度為止。若鈍化病毒所需要的連續(xù)高溫處理會(huì)傷害寄主病毒所需要的連續(xù)高溫處理會(huì)傷害寄主組織，則應(yīng)當(dāng)試驗(yàn)高低溫交替的效果。組織，則應(yīng)當(dāng)試驗(yàn)高低溫交替的效果。和單獨(dú)采用熱療法相比，莖尖培養(yǎng)和單獨(dú)采用熱療法相比，莖尖培養(yǎng)具更廣泛的適用性。莖尖培養(yǎng)現(xiàn)在具更廣泛的適用性。莖尖培養(yǎng)現(xiàn)在已成為消除病毒的一個(gè)很常用的手已成為消除病毒的一個(gè)很常用的手段。段。13.4 通過莖尖培養(yǎng)消除病毒通過莖尖培養(yǎng)消除病毒13.4.1 外植體的名稱外植體的名稱1、

4、在應(yīng)用組織培養(yǎng)方法以獲得無病原菌、在應(yīng)用組織培養(yǎng)方法以獲得無病原菌植物時(shí)，所用的外植體可以是莖尖，也植物時(shí)，所用的外植體可以是莖尖，也可以是莖的頂端分生組織?？梢允乔o的頂端分生組織。2、莖的頂端分生組織：指莖的最幼齡葉、莖的頂端分生組織：指莖的最幼齡葉原基上方的一部分，最大直徑約為原基上方的一部分，最大直徑約為100um，最大長度約為，最大長度約為250um。3、莖尖：是指由頂端分生組織、莖尖：是指由頂端分生組織及其下方的及其下方的13個(gè)幼葉原基一起個(gè)幼葉原基一起構(gòu)成的。構(gòu)成的。13.4.2 方法方法1、防止莖尖變干。、防止莖尖變干。2、最好先把供試植株種在無菌的盆土中，、最好先把供試植株種在

5、無菌的盆土中， 并放在溫室中進(jìn)行栽培。澆水時(shí)，水并放在溫室中進(jìn)行栽培。澆水時(shí)，水 要直接澆在土壤上，而不要澆在葉片要直接澆在土壤上，而不要澆在葉片 上。另外，最好還要給植株定期噴施上。另外，最好還要給植株定期噴施 內(nèi)吸殺菌劑，如苯菌靈（內(nèi)吸殺菌劑，如苯菌靈（0.1%）和）和 抗生素鏈霉素（抗生素鏈霉素（0.1%）的混合液）的混合液。3、在切取外植體之前一般仍需對(duì)莖芽進(jìn)、在切取外植體之前一般仍需對(duì)莖芽進(jìn) 行表面消毒。葉片包被嚴(yán)緊的芽，只行表面消毒。葉片包被嚴(yán)緊的芽，只 需在需在75%酒精浸醺一下，而葉片包酒精浸醺一下，而葉片包 被松散的芽，則要用被松散的芽，則要用0.1%的次氯酸的次氯酸 鈉溶液

6、表面消毒鈉溶液表面消毒10min。4、在剖取莖尖使要防止染、在剖取莖尖使要防止染菌。菌。5、有莖尖長出的新莖，若不能、有莖尖長出的新莖，若不能生根，則須把脫病毒的莖嫁接到生根，則須把脫病毒的莖嫁接到健康的砧木上。健康的砧木上。13.4.3 在莖尖培養(yǎng)中影響在莖尖培養(yǎng)中影響 脫毒效果的因素脫毒效果的因素13.4.3.1 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 通過正確選擇培養(yǎng)基，可以顯著提高通過正確選擇培養(yǎng)基，可以顯著提高獲得完整植株的成功率，所應(yīng)考慮的培獲得完整植株的成功率，所應(yīng)考慮的培養(yǎng)基的主要性質(zhì)是它的營養(yǎng)成分、生長養(yǎng)基的主要性質(zhì)是它的營養(yǎng)成分、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和物理狀態(tài)。調(diào)節(jié)物質(zhì)和物理狀態(tài)。1、培養(yǎng)基中必須有一定量的

7、、培養(yǎng)基中必須有一定量的K+和和NH 4+。2、MS培養(yǎng)基使用于莖尖培養(yǎng)。培養(yǎng)基使用于莖尖培養(yǎng)。3、一般來說，含有少量（、一般來說，含有少量（0.1 0.5mg/L) 或者二者兼有常常是有利的。生長或者二者兼有常常是有利的。生長 素可能是由第而對(duì)幼葉原基形成的。素可能是由第而對(duì)幼葉原基形成的。 在洋紫蘇、胡蘿卜、煙草、旱金蓮在洋紫蘇、胡蘿卜、煙草、旱金蓮 以及一種百合植物中，要能成功的以及一種百合植物中，要能成功的 培養(yǎng)不帶任何葉原基的分生組織外培養(yǎng)不帶任何葉原基的分生組織外 植體，外源激素的存在是必不可少植體，外源激素的存在是必不可少的。在麝香石竹離體頂端分生組織培養(yǎng)的。在麝香石竹離體頂端分

8、生組織培養(yǎng)中，既需要生長素，也需細(xì)胞分裂素。中，既需要生長素，也需細(xì)胞分裂素。 在各種不同的生長素中，應(yīng)當(dāng)避免使用在各種不同的生長素中，應(yīng)當(dāng)避免使用2，4D，因?yàn)樗ǔＤ苷T導(dǎo)外植體形，因?yàn)樗ǔＤ苷T導(dǎo)外植體形成愈傷組織。廣泛使用的生長素是成愈傷組織。廣泛使用的生長素是NAAIAA，其中，其中NAA由于比較穩(wěn)定，效果更由于比較穩(wěn)定，效果更好。好。4、GA3培養(yǎng)基有作者認(rèn)為能抑制愈培養(yǎng)基有作者認(rèn)為能抑制愈傷組織的形成，有助于更好地生長傷組織的形成，有助于更好地生長和分化。然而其他一些作者卻發(fā)現(xiàn)，和分化。然而其他一些作者卻發(fā)現(xiàn)， GA3并沒有什么顯著作用，在高濃并沒有什么顯著作用，在高濃度時(shí)甚至有抑

9、制效應(yīng)。度時(shí)甚至有抑制效應(yīng)。13.4.3.2 外植體大小外植體大小1、外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機(jī)、外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機(jī)會(huì)也越多。小的外植體可能不利于會(huì)也越多。小的外植體可能不利于莖的生根。但外植體大小與脫毒效莖的生根。但外植體大小與脫毒效率呈負(fù)相關(guān)。外植體大小應(yīng)小到足率呈負(fù)相關(guān)。外植體大小應(yīng)小到足以能根除病毒，大到足以能發(fā)育成以能根除病毒，大到足以能發(fā)育成一個(gè)完整的植株。一個(gè)完整的植株。2、葉原基的存在與否也影響分生組、葉原基的存在與否也影響分生組織形成植株的能力。不帶葉原基的織形成植株的能力。不帶葉原基的頂端分生組織可能有利于形成完整頂端分生組織可能有利于形成完整的植株，但不利于脫

10、毒。故用較大的植株，但不利于脫毒。故用較大的帶葉原基的莖尖做外植體比只用的帶葉原基的莖尖做外植體比只用分生組織效果較好。分生組織效果較好。13.4.3.3 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件1、在莖尖培養(yǎng)中，一般照光培養(yǎng)的、在莖尖培養(yǎng)中，一般照光培養(yǎng)的 效果通常比暗培養(yǎng)好。但天竺葵效果通常比暗培養(yǎng)好。但天竺葵 莖尖培養(yǎng)使須一段時(shí)間的黑暗。莖尖培養(yǎng)使須一段時(shí)間的黑暗。2、對(duì)溫度的要求，培養(yǎng)物通常都是、對(duì)溫度的要求，培養(yǎng)物通常都是 放在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)室溫度下。放在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)室溫度下。 （25 。C +2 。C）13.4.3.4 外植體的生理狀態(tài)外植體的生理狀態(tài)1、莖尖最好要由活躍生長的芽上切取。、莖尖最好要由活躍生長的

11、芽上切取。為了增加脫毒植株的總數(shù)還是要采用腋為了增加脫毒植株的總數(shù)還是要采用腋芽，這是因?yàn)橐秆吭诿總€(gè)枝條上有好幾芽，這是因?yàn)橐秆吭诿總€(gè)枝條上有好幾個(gè)，而頂芽只有一個(gè)。個(gè)，而頂芽只有一個(gè)。2、取芽時(shí)間必須在生長旺盛的季節(jié)，不、取芽時(shí)間必須在生長旺盛的季節(jié)，不要在休眠期進(jìn)行，若要在休眠期進(jìn)行，要在休眠期進(jìn)行，若要在休眠期進(jìn)行，則必須采用某中適當(dāng)?shù)奶幚?。則必須采用某中適當(dāng)?shù)奶幚怼?3.4.3.5 熱療法熱療法把莖尖培養(yǎng)和與熱療法結(jié)合起來，把莖尖培養(yǎng)和與熱療法結(jié)合起來，有利于或得脫病毒植株。熱處理可有利于或得脫病毒植株。熱處理可在切取莖尖之前在母株上進(jìn)行，也在切取莖尖之前在母株上進(jìn)行，也可以在莖尖培養(yǎng)

12、期間進(jìn)行。但在切可以在莖尖培養(yǎng)期間進(jìn)行。但在切取莖尖之前的母株上進(jìn)行可切取較取莖尖之前的母株上進(jìn)行可切取較大的外植體進(jìn)行培養(yǎng)，效果更好。大的外植體進(jìn)行培養(yǎng)，效果更好。要慎重處理熱處理的時(shí)間。在菊花中，要慎重處理熱處理的時(shí)間。在菊花中，熱處理時(shí)間由熱處理時(shí)間由10d增加到增加到30d，可使，可使無病毒植株百分?jǐn)?shù)由無病毒植株百分?jǐn)?shù)由9%增加到增加到90%，處理處理40d或更長并不能增加無毒植株的百或更長并不能增加無毒植株的百分?jǐn)?shù)，反而減少形成植株的莖尖總數(shù)。主分?jǐn)?shù)，反而減少形成植株的莖尖總數(shù)。主要是長時(shí)間的熱處理除可消除病毒要是長時(shí)間的熱處理除可消除病毒之外，也能鈍化寄主組織中的抗病毒因子。之外，

13、也能鈍化寄主組織中的抗病毒因子。如果連續(xù)進(jìn)行高溫處理會(huì)引起受如果連續(xù)進(jìn)行高溫處理會(huì)引起受處理寄主的損傷，可以試用晝夜處理寄主的損傷，可以試用晝夜或隔日高低溫交替處理?；蚋羧崭叩蜏亟惶嫣幚?。13.4.3.6 化學(xué)療法化學(xué)療法1、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)能減少組織中病毒、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)能減少組織中病毒 的濃度，但不可能把它們消除。的濃度，但不可能把它們消除。2、據(jù)報(bào)道，用齒舌蘭、據(jù)報(bào)道，用齒舌蘭 (Odontlossum)環(huán)斑病毒抗血環(huán)斑病毒抗血 清預(yù)處理蘭花的離體分生組織，清預(yù)處理蘭花的離體分生組織， 增加了脫毒植株的頻率。增加了脫毒植株的頻率。3、一種抗病毒制劑、一種抗病毒制劑Virazole已知對(duì)已知對(duì)若

14、干種動(dòng)物若干種動(dòng)物DNA和和RNA病毒是病毒是有效的。有效的。4、在植物中，放線菌、在植物中，放線菌-D酮和放酮和放線菌也能抑制原生質(zhì)體中病毒的線菌也能抑制原生質(zhì)體中病毒的復(fù)制。復(fù)制。13.5通過愈傷組織培通過愈傷組織培養(yǎng)消除病毒養(yǎng)消除病毒在用機(jī)械方法由受在用機(jī)械方法由受TMV侵染的煙草愈傷侵染的煙草愈傷組織分離出來的單個(gè)細(xì)胞中，只有組織分離出來的單個(gè)細(xì)胞中，只有40%帶有病毒。由受侵染的愈傷長一智中再帶有病毒。由受侵染的愈傷長一智中再生出很多不含有生出很多不含有TMV的植株，這一事實(shí)的植株，這一事實(shí)也證明了愈傷組織中的某些細(xì)胞是不含也證明了愈傷組織中的某些細(xì)胞是不含病毒的。病毒的。在一個(gè)受到

15、在一個(gè)受到TMV侵染的葉片中，暗綠色侵染的葉片中，暗綠色的組織或者是不含病毒的，或者是病毒的組織或者是不含病毒的，或者是病毒濃度很低。由這些組織中切取濃度很低。由這些組織中切取1mm的外植體進(jìn)行培養(yǎng)，在再生植株中的外植體進(jìn)行培養(yǎng)，在再生植株中有有50%是無毒的。是無毒的。確定在植物組織中是否有病毒存在的最確定在植物組織中是否有病毒存在的最簡(jiǎn)單的方法，是檢驗(yàn)葉和莖是否有該中簡(jiǎn)單的方法，是檢驗(yàn)葉和莖是否有該中病毒所特有的可見癥狀。病毒所特有的可見癥狀。病毒的汁液感染法是一般用于檢驗(yàn)病毒病毒的汁液感染法是一般用于檢驗(yàn)病毒的所有方法中最為敏感的方法。具體介的所有方法中最為敏感的方法。具體介紹如下：紹如

16、下：由受檢植株上取下葉片，置于等容積由受檢植株上取下葉片，置于等容積（W/V）的緩沖液（）的緩沖液（0.1mol/L磷酸鈉）磷酸鈉）13.6 脫毒效果的檢驗(yàn)脫毒效果的檢驗(yàn)中，用研缽和研桿將葉片研碎。在指示中，用研缽和研桿將葉片研碎。在指示植物（對(duì)某種或某些特定病毒非常敏感植物（對(duì)某種或某些特定病毒非常敏感的植物）的葉片上撒上少許的植物）的葉片上撒上少許600號(hào)金剛號(hào)金剛砂，然后用受檢植物的葉汁輕輕涂于其砂，然后用受檢植物的葉汁輕輕涂于其上。適當(dāng)用力摩擦，以使指示植物葉表上。適當(dāng)用力摩擦，以使指示植物葉表面細(xì)胞受到侵染，但又不要損傷葉片。面細(xì)胞受到侵染，但又不要損傷葉片。大約大約5mm后，用水輕

17、輕洗去接種葉片上后，用水輕輕洗去接種葉片上的殘余汁液。把接過種的指示植物放在的殘余汁液。把接過種的指示植物放在一間溫室或防蚜罩內(nèi)，株間以及與其他一間溫室或防蚜罩內(nèi)，株間以及與其他植物間都要隔開一定的距離。取決植物間都要隔開一定的距離。取決于病毒的性質(zhì)和液汁中病毒的數(shù)量，于病毒的性質(zhì)和液汁中病毒的數(shù)量，大概需要大概需要68d或是幾周，知指示植或是幾周，知指示植物即可表現(xiàn)癥狀。物即可表現(xiàn)癥狀。檢驗(yàn)植物中是否存在病毒的其他方檢驗(yàn)植物中是否存在病毒的其他方法，還有血清測(cè)驗(yàn)法和電鏡觀察法。法，還有血清測(cè)驗(yàn)法和電鏡觀察法。13.7 無毒原種的保存無毒原種的保存為解決無毒植株有可能很快又被重為解決無毒植株有

18、可能很快又被重新感染，應(yīng)將無毒原種種在田間的新感染，應(yīng)將無毒原種種在田間的隔離區(qū)內(nèi)，這樣就較少有重新感染隔離區(qū)內(nèi)，這樣就較少有重新感染的機(jī)會(huì)。的機(jī)會(huì)。另外一種更容易的方法是，把莖尖另外一種更容易的方法是，把莖尖得到的并已經(jīng)過脫毒檢驗(yàn)的植物通得到的并已經(jīng)過脫毒檢驗(yàn)的植物通過離體培養(yǎng)進(jìn)行繁殖和保存。過離體培養(yǎng)進(jìn)行繁殖和保存。13.8脫毒植株的應(yīng)用脫毒植株的應(yīng)用1.通過把已知病毒引入無毒植株，并比通過把已知病毒引入無毒植株，并比較同一個(gè)無性系的感病株和無毒株的表較同一個(gè)無性系的感病株和無毒株的表現(xiàn)，可對(duì)病毒造成的產(chǎn)量損失做出更精現(xiàn)，可對(duì)病毒造成的產(chǎn)量損失做出更精確的估計(jì)。確的估計(jì)。2.莖尖培養(yǎng)產(chǎn)生的植株比未受過處理的莖尖培養(yǎng)產(chǎn)生的植株比未受過處理的生活力強(qiáng)，產(chǎn)生插條的數(shù)目多生活力強(qiáng)，產(chǎn)生插條的數(shù)目多20%-30%，而且這些插條很容易生根。，而且這些插條很容易生根。13.9病毒以外病原菌的消除方法病毒以外病原菌的消除方法外植體的反復(fù)轉(zhuǎn)管或通過莖尖培養(yǎng)可消外植體的反復(fù)轉(zhuǎn)管或通過莖尖培養(yǎng)可消除病毒以外的病原菌。除病毒以外的病原菌。13.9 通過莖尖培養(yǎng)消除通過莖尖培養(yǎng)消除 病毒的注意事項(xiàng)病毒的注意事項(xiàng)要想得到和繁殖一個(gè)品種的脫毒植株，要想得到和繁殖一個(gè)品種的脫毒植株，首先必須了解有關(guān)該種植物的一些背景首先必須了解有關(guān)該種植物的一些背景知識(shí)