現(xiàn)代分子生物學復習要點和習題

1、第一章緒論分子生物學分子生物學的基本含義(p8)分子生物學是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結構特征及其重要性、規(guī)律性和相互關系的科學，是人類從分子水平上真正揭開生物世界的奧秘，由被動地適應自然界轉(zhuǎn)向主動地改造和重組自然界的基礎學科。分子生物學與其它學科的關系分子生物學是由生物化學、生物物理學、遺傳學、微生物學、細胞學、以至信息科學等多學科相互滲透、綜合融會而產(chǎn)生并發(fā)展起來的，凝聚了不同學科專長的科學家的共同努力。它雖產(chǎn)生于上述各個學科，但已形成它獨特的理論體系和研究手段，成為一個獨立的學科。生物化學與分子生物學關系最為密切:生物化學是從化學角度研究生命現(xiàn)象的科學，它著重研究生物體內(nèi)各

2、種生物分子的結構、轉(zhuǎn)變與新陳代謝。傳統(tǒng)生物化學的中心內(nèi)容是代謝，包括糖、脂類、氨基酸、核苷酸、以及能量代謝等與生理功能的聯(lián)系。分子生物學則著重闡明生命的本質(zhì)主要研究生物大分子核酸與蛋白質(zhì)的結構與功能、生命信息的傳遞和調(diào)控。細胞生物學與分子生物學關系也十分密切:傳統(tǒng)的細胞生物學主要研究細胞和亞細胞器的形態(tài)、結構與功能。探討組成細胞的分子結構比單純觀察大體結構能更加深入認識細胞的結構與功能，因此現(xiàn)代細胞生物學的發(fā)展越來越多地應用分子生物學的理論和方法。分子生物學則是從研究各個生物大分子的結構入手，但各個分子不能孤立發(fā)揮作用，生命絕非組成成分的隨意加和或混合，分子生物學還需要進一步研究各生物分子間的

3、高層次組織和相互作用，尤其是細胞整體反應的分子機理，這在某種程度上是向細胞生物學的靠攏。第一章序論1859年發(fā)表了物種起源，用事實證明“物競天擇，適者生存”的進化論思想。指出：物種的變異是由于大自然的環(huán)境和生物群體的生存競爭造成的，徹底否定了“創(chuàng)世說”。達爾文第一個認識到生物世界的不連續(xù)性。意義：達爾文關于生物進化的學說及其唯物主義的物種起源理論，是生物科學史上最偉大的創(chuàng)舉之一，具有不可磨滅的貢獻。細胞學說建立及其意義德國植物學家施萊登和動物學家施旺共同提出：一切植物、動物都是由細胞組成的，細胞是一切動植物的基本單位。經(jīng)典遺傳學兩條基本規(guī)律:統(tǒng)一律：當兩種不同植物雜交時，它們的下一代可能與親本

4、之一完全相同；分離規(guī)律：將不同植物品種雜交后的F1代種子再進行雜交或自交時，下一代就會按照一定的比例分離，因而具有不同的形式。1865年發(fā)表植物雜交試驗，直到1900年才被人們重新發(fā)現(xiàn)。孟德爾被公認為經(jīng)典遺傳學的奠基人?，F(xiàn)代遺傳學Morgan及其助手第一次將代表某一特性的基因同染色體聯(lián)系起來，使科學界普遍認識了染色體的重要性并接受了孟德爾的遺傳學原理。Morgan特別指出：種質(zhì)必須由某些獨立的要素組成，我們把這些要素稱為遺傳因子或基因。第二節(jié)分子生物學發(fā)展簡史準備和醞釀階段(19世紀后期到20世紀50年代初)對生命本質(zhì)的認識上的兩點重大突破：1 確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎物質(zhì)2確定了生物遺傳

5、的物質(zhì)基礎是DNA現(xiàn)代分子生物學的建立和發(fā)展階段(20世紀50年代初到70年代初):這一階段以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結構模型作為現(xiàn)代分子生物學誕生的里程碑開創(chuàng)了分子遺傳學基本理論建立和發(fā)展的黃金時代。在此期間的主要進展包括：遺傳信息傳遞中心法則的建立對蛋白質(zhì)結構與功能的進一步認識DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)的意義：確立了核酸作為信息分子的結構基礎；提出了堿基配對是核酸復制、遺傳信息傳遞的基本方式；從而最后確定了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎，為認識核酸與蛋白質(zhì)的關系及其在生命中的作用打下了最重要的基礎。Crick于1954年所提出的中心法則(CentralDogma)：初步認識生命本質(zhì)

6、并開始改造生命的深入發(fā)展階段(20世紀70年代后至今)基因工程技術的出現(xiàn)作為標志。其間的重大成就包括：重組DNA技術的建立和發(fā)展基因組研究的發(fā)展單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發(fā)展基因表達調(diào)控機理細胞信號轉(zhuǎn)導機理研究成為新的前沿領域第三節(jié)分子生物學的主要研究內(nèi)容一DNA重組技術(recombinantDNAtechnology)定義：又稱為基因工程，根據(jù)分子生物學和遺傳學的原理，將一種生物的遺傳物質(zhì)DNA轉(zhuǎn)移到另一生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達出所需要的產(chǎn)物。DNA重組技術的應用：利用微生物基因工程生產(chǎn)重組基因工程藥物、轉(zhuǎn)基因植物和動物體細胞克隆、基因表達與調(diào)控的基礎研究。二生物大分子

7、的結構功能研究三基因組、功能基因組與生物信息學的研究基因組、蛋白質(zhì)組與生物信息學基因組(Genome):細胞或生物體一條完整單體的全部染色體遺傳物質(zhì)的總和。人類基因組計劃(HumanGenomeProject,HGP)：測定出人基因組全部DNA3109鹼基對的序列、確定人類約5-10萬個基因的一級結構?；蚪M、蛋白質(zhì)組與生物信息學蛋白組計劃(Proteomeproject):又稱為后基因組計劃或功能基因組計劃，用于揭示并闡明細胞、組織乃至整個生物個體全部蛋白質(zhì)及其功能。生物信息學(Bioinformatics):是在生命科學的研究中，以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的科學。四基因表

8、達調(diào)控研究第二章染色體與DNA本章內(nèi)容1. 染色體2. DNA的結構3. DNA的復制4. 原核生物和真核生物DNA復制特點5. DNA的修復6. DNA的轉(zhuǎn)座第一節(jié)染色體(chromosome)概念：染色體(chromosome):原指真核生物細胞分裂中期具有一定形態(tài)特征的染色質(zhì)?，F(xiàn)在這一概念已擴大為包括原核生物及細胞器在內(nèi)的基因載體的總稱。染色質(zhì)(chromatin)：由DNA和蛋白質(zhì)構成，在分裂間期染色體結構疏松，稱為染色質(zhì)。其實染色質(zhì)與染色體只是同一物質(zhì)在不同細胞周期的表現(xiàn)。常染色質(zhì)(euchromatin)：是進行活躍轉(zhuǎn)錄的部位，呈疏松的環(huán)狀，電鏡下表現(xiàn)為淺染，易被核酸酶在一些敏感的

9、位點(hypersensitivesites)降解。異染色質(zhì)(heterochromatin):在間期核中處于凝縮狀態(tài)，無轉(zhuǎn)錄活性，也叫非活動染色質(zhì)(inactivechromatin)，是遺傳惰性區(qū)。在細胞周期中表現(xiàn)為晚復制，早凝縮，即異固縮現(xiàn)象(heteropycnosis)。原核細胞與真核細胞特征分析染色體特性：分子結構相對穩(wěn)定能夠自我復制，使親、子代之間保持連續(xù)性能夠指導蛋白質(zhì)的合成，從而控制整個生命過程能夠產(chǎn)生可遺傳的變異真核細胞染色體的組成DNA30%-40%組蛋白(histone)30%-40%非組蛋白(NHP)變化很大少量RNA染色體中的蛋白質(zhì)組蛋白(histone)：一類小的

10、帶有豐富正電荷(富含Lys、Arg)的核蛋白，與DNA有高親和力。組蛋白是染色體的結構蛋白，它與DNA組成核小體。組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3及H4。非組蛋白(non-histoneprotein)：是染色體上與特異DNA序列結合的蛋白質(zhì)，所以又稱為序列特異性DNA結合蛋白。組蛋白具有如下特性：1、進化上的極端保守性。2、無組織特異性。3、肽鏈上氨基酸分布的不對稱性。4、組蛋白的修飾作用。5、富含賴氨酸的組蛋白H5。非組蛋白：非組蛋白大約占組蛋白總量的6070%，種類很多。(1)HMG蛋白(highmobilitygroupprotein)，能與DNA結合(不牢固)，也能與H1作用,或

11、與DNA超螺旋結構有關。( 2) DNA結合蛋白：可能是一些與DNA的復制或轉(zhuǎn)錄有關的酶或調(diào)節(jié)物質(zhì)。( 3) A24非組蛋白：與H2A差不多，位于核小體內(nèi)，功能不祥。非組蛋白的一般特性：1 .非組蛋白的多樣性；非組蛋白的量大約是組蛋白的60%70%,但它的種類卻很多，約在20-100種之間，其中常見的有15-20種。2 .非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。DNAC值：通常指一種生物單倍體基因組DNA的總量。C值反?，F(xiàn)象：真核細胞基因組的最大特點是它含有大量的重復序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開，這就是著名的“C值反?，F(xiàn)象”。染色體中的DNA根據(jù)DNA的動力學研究，

12、真核細胞DNA可分為：高度重復序列：幾百-幾萬copy。如：衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。中度重復序列：10幾百copy。如：各種rDNA、tDNA及組蛋白基因。低度重復序列：2-10copy。如：血紅蛋白。單拷貝序列：大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的結構基因和基因間間隔序列。只有一個拷貝。如：蛋清蛋白。染色體折疊DNA核小體螺線管圓筒超螺旋(1)核小體染色質(zhì)纖維細絲是許多核小體連成的念珠狀結構。核小體(nucleosome)：DNA繞在組蛋白八聚體(H2A、H2B、H3、H4各一對)核心外1.8周(146bp),形成核小體核心顆粒。(2)螺線管10nm的染色質(zhì)細絲盤繞成螺旋管狀的30nm纖維粗絲，通稱螺線管(

13、solenoid)。螺線管的每一螺旋包含6個核小體，其壓縮比為6。這種螺線管是分裂間期染色質(zhì)和分裂中期染色體的基本組分。(3)上述螺線管可進一步壓縮形成超螺旋。由30nm螺線管纏繞而成一細長、中空的圓筒，直徑為4000nm,壓縮比是40。(4)超螺旋進一步壓縮1/5便成為染色體單體，總壓縮比是7X6X40X5,將近一萬倍。原核生物基因組特點：1 、結構簡練2、存在轉(zhuǎn)錄單元多順反子mRNA3、有重疊基因Sanger1977在Nature上發(fā)表了X174DNA的全部核苷酸序列，正式發(fā)現(xiàn)了重疊基因。第二節(jié)DNA的結構一、DNA的一級結構所謂DNA的一級結構，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了

14、該DNA分子的化學構成?；咎攸c DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的。 DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)。兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結合，形成堿基對，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌呤與嘧啶配對，而且腺嘌呤(A)只能與胸腺嘧啶(T)配對，鳥嘌呤(G)只能與胞嘧啶(C)配對。2、 DNA的二級結構DNA的二級結構是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結構。通常情況下，DNA的二級結構分兩大類：一類是右手螺旋，如A-DNA和B-DNA；另一類是左手螺旋，即Z-DNA。3、 DNA的高級結構DNA的高級結構是指DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞

15、所形成的特定空間結構。超螺旋結構是DNA高級結構的主要形式，可分為正超螺旋與負超螺旋兩大類。DNA分子的超螺旋化可以用一個數(shù)學公式來表示：L=T+W其中L為連接數(shù)(linkingnumber)，是指環(huán)形DNA分子兩條鏈間交叉的次數(shù)。只要不發(fā)生鏈的斷裂，L是個常量。T為雙螺旋的盤繞數(shù)(twistingnumber)，W為超螺旋數(shù)(writhingnumber)，它們是變量。2 3DNA的復制2.1.1 DNA的半保留復制機理2.1.2 復制的起點、方向和速度2.1.3 復制的幾種主要方式一、DNA的復制1、DNA的半保留復制每個子代分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，所以這種復制方

16、式被稱為DNA的半保留復制(semiconservativereplication)。DNA的這種半保留復制保證了DNA在代謝上的穩(wěn)定性。2、復制的起點與方向一般把生物體的復制單位稱為復制子(replicon)。一個復制子只含一個復制起點。多復制子：DNA復制時，原核生物一般只有一個起始位點，而真核生物則有多個起始位點，因而在復制時呈現(xiàn)多復制泡，也稱為多復制子。DNA的復制主要是從固定的起始點以雙向等速復制方式進行的(圖2-18)。復制叉以DNA分子上某一特定順序為起點，向兩個方向等速生長前進。拓撲異構酶I：拓撲異構酶I解開負超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復制起點處解開雙鏈。參與解鏈的除一組解

17、鏈酶外，還有Dna蛋白等。DNA解鏈酶(DNAhelicase)：DNA解鏈酶能通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。單鏈結合蛋白(SSB蛋白)：SSB蛋白的作用是保證被解鏈酶解開的單鏈在復制完成前能保持單鏈結構，它以四聚體形式存在于復制叉處，待單鏈復制后才掉下，重新循環(huán)。所以，SSB蛋白只保持單鏈的存在，并不能起解鏈的作用。3、 DNA的半不連續(xù)復制與岡崎片段DNA復制時，短時間內(nèi)合成的約1000個核苷酸左右的小片段，稱之為岡崎片段(Okazakifragment)DNA復制過程中至少有一條鏈首先合成較短的片段，然后再由連接酶連成大分子DNA?，F(xiàn)在已知一般原核生物的岡崎片段要長些，真核生物

18、中的要短些。進一步研究還證明，這種前導鏈的連續(xù)復制和滯后鏈的不連續(xù)復制在生物界是有普遍性的，因而稱之為雙螺旋的半不連續(xù)復制。DNA鏈的延伸：DNA復制體(replisome):在復制叉附近，形成了以兩套DNA聚合酶出全酶分子、引發(fā)體和解鏈酶構成的類似核糖體大小的復合體，稱為DNA復制體。4、滯后鏈的引發(fā)DNA復制時，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物3'端開始合成新的DNA鏈。滯后鏈的引發(fā)過程往往由引發(fā)體(primosome)來完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n、n'、n"、DnaB、C和I共同組成，只有當引發(fā)前體(prepri

19、mosome)把這6種蛋白質(zhì)合在一起并與引發(fā)酶(primase)進一步組裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功效。5、鏈的終止當復制叉前移，遇到20bp重復性終止子序列(Ter)時，Ter-Tus復合物能阻擋復制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復制叉到達后在DNA拓撲異構酶IV的作用下使復制叉解體，釋放子鏈DNA。6、復制的幾種方式(1)環(huán)狀DNA雙鏈的復制：環(huán)狀雙鏈DNA的復制可分為0型、滾環(huán)型和D-環(huán)型幾種類型。(a) 0型復制的起始點涉及到DNA雙鏈的解旋和松開，形成兩個方向相反的復制叉。前導鏈DNA開始復制前，復制原點的核酸序列被轉(zhuǎn)錄生成短RNA鏈，作為起始DNA復制的引物。(b) 滾環(huán)型(roll

20、ingcircle)這是單向復制的特殊方式。如X174的雙鏈環(huán)狀DNA復制型(RF)就是以這種方式復制的。DNA的合成由對正鏈原點的專一性切割開始，所形成的自由5端被從雙鏈環(huán)中置換出來并為單鏈DNA結合蛋白所覆蓋，使其3OH端在DNA聚合酶的作用下不斷延伸。在這個過程中，單鏈尾巴的延伸與雙鏈DNA的繞軸旋轉(zhuǎn)同步。(c) D-環(huán)型(D-loop)這也是一種單向復制的特殊方式。這種方式首先在動物線粒體DNA的復制中被發(fā)現(xiàn)。雙鏈環(huán)在固定點解開進行復制。但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈上迅速合成出互補鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)(即D-環(huán))。(2)線性DNA雙鏈的復制線性DNA復制中RNA引物被

21、切除后，留下5'端部分單鏈DNA，不能為DNA聚合酶所作用，使子鏈短于母鏈。T4和T7噬菌體DNA通過其末端的簡并性使不同鏈的3'端因互補而結合，其缺口被聚合酶作用填滿，再經(jīng)DNA連接酶作用生成二聯(lián)體。這個過程可重復進行直到生成原長20多倍的多聯(lián)體，并由噬菌體DNA編碼的核酸酶特異切割形成單位長度的DNA分子。二、原核和真核生物DNA的復制特點1、原核生物DNA的復制特點大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的性質(zhì)比較原核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶I:有3'-5'外切酶活性和5'f3'外切酶活性。保證DNA復制的準確性。DNA聚合酶H:活性低，

22、其3'f5'核酸外切酶活性可起校正作用。主要起修復DNA的作用。DNA聚合酶出：7種亞單位9個亞基。只具3'-5'外切酶活性，主導聚合酶。Klenowfragment：用枯草桿菌蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶，獲得兩個片段，大片段分子量76000U，稱為Klenow片段。它保留著聚合酶和3'-5'外切酶的活性，廣泛使用于DNA序列分析中。三、真核生物DNA的復制特點真核生物DNA復制的起始需要起始原點識別復合物（ORC）參與。真核生物DNA復制叉的移動速度大約只有50bp秒，還不到大腸桿菌的120。真核生物的染色體在全部完成復制之前，各個起始點上

23、DNA的復制不能再開始。真核生物DNA聚合酶的特性比較2.4.3DNA復制的調(diào)控原核細胞DNA的復制調(diào)控：復制叉的多少決定了復制頻率的高低。真核細胞DNA的復制調(diào)控：1 .細胞生活周期水平調(diào)控2 .染色體水平調(diào)控3 .復制子水平調(diào)控真核和原核生物DNA復制的比較相同：1 .半保留復制2 .都有引發(fā)、延長、終止三個階段3 .都必須有相應功能的蛋白質(zhì)和DNA聚合酶參與區(qū)別：1 .真：多個復制起始點；原：一個復制起始點2 .真：所有復制受一種調(diào)控；原：一個復制子上有多個復制叉2.5 DNA的修復DNA修復系統(tǒng)錯配修復堿基切除修復核苷酸切除修復功能恢復錯配切除突變的堿基修復被破壞的DNADNA直接修復

24、修復嘧啶二體或甲基化DNA2.6 DNA的轉(zhuǎn)座2.6.1 轉(zhuǎn)座子的分類和結構特征2.6.2 轉(zhuǎn)座作用的機制2.6.3 轉(zhuǎn)座作用的遺傳學效應2.6.4 真核生物中的轉(zhuǎn)座子移動基因（Movablegene）：又稱為轉(zhuǎn)位因子（Transposableelements），是存在于染色體DNA上可自主復制和位移的基本單位。由于它可以從染色體基因組上的一個位置轉(zhuǎn)移到另一位置，甚至在不同染色體之間躍遷，因此有時也稱為跳躍基因（Jumpinggene）。原核生物的轉(zhuǎn)座因子可分為：插入序列（insertionsequence,IS）：最簡單的不含有任何宿主基因的轉(zhuǎn)位因子。片段長度7002500bp。復合轉(zhuǎn)座子（

25、transposon,Tn）：是一類攜帶某些與轉(zhuǎn)座無關的抗性基因（或其它宿主基因）的轉(zhuǎn)座子。分子量2000bp。轉(zhuǎn)座噬菌體（Mu,D108）：具有轉(zhuǎn)座功能的一類可引起突變的溶源性噬菌體。插入序列的結構特點：1 .在IS兩端含有長度為1040bp反向重疊序列2 .含有一個編碼轉(zhuǎn)座酶的長編碼區(qū)。3 .插入時在DNA位點產(chǎn)生一個短的（39bp）正向重復序列。復合轉(zhuǎn)座子的結構特點：1 .兩翼為兩個相同或相似的IS序列。2 .中部為某種抗性基因。3 .IS序列一般不能單獨移動。Conclusiona） 轉(zhuǎn)座過程是由Donor提供Tncopy到targetsite，涉及酶切、復制、重組的遺傳學過程。b）

26、轉(zhuǎn)座完成后，在Tn的兩端出現(xiàn)targetsite序列的正向重復，其長度取決于staggeredcutting的長度。c） 轉(zhuǎn)座因子的IR序列是轉(zhuǎn)座酶的重要識別位點，與轉(zhuǎn)座，切除有關d） Cointegrater是轉(zhuǎn)座過程的中間體（具有兩個Tn和兩個replicon）,其穩(wěn)定性依Tn不同而異，或resolution完成轉(zhuǎn)座過程.e） Cointegrater可能導致Tn和抗性的積累。轉(zhuǎn)座作用的遺傳學效應1. 誘變效應（提高重組頻率、形成易變基因）2. 切除效應（倒位、缺失、重復、footprinting）3. 雙轉(zhuǎn)座效應（外顯子改組exonshuffling）4. 位置效應（啟動表達、增強表達）

27、5. 轉(zhuǎn)座爆炸（激活表達、基因內(nèi)重排突變基因形成）轉(zhuǎn)位作用的機制：靶序列的復制。轉(zhuǎn)位作用的遺傳學效應：引起插入突變；產(chǎn)生新基因；產(chǎn)生染色體畸變；引起生物進化。轉(zhuǎn)座因子的應用：利用轉(zhuǎn)座子分離、克隆基因；利用Tn進行基因定位；作為基因轉(zhuǎn)移載體。真核生物中的轉(zhuǎn)座子1、玉米中的控制因子自主性因子：具有自主剪接和轉(zhuǎn)座的功能；非自主性因子：單獨存在時是穩(wěn)定的，不能轉(zhuǎn)座，當基因組中存在與非自主性因子同家族的自主性因子時，它才具備轉(zhuǎn)座功能，成為與自主性因子相同的轉(zhuǎn)座子。AcDs體系、Spm,En轉(zhuǎn)座子。2、果蠅中的車t座子Copia類、P轉(zhuǎn)座子等。本章重點染色體及DNA結構DNA復制習題1 .DNA以半保留方

28、式進行復制，若一完全被標記的DNA分子,置于無放射標記的溶液中復制兩代，所產(chǎn)生的4個DNA分子中放射性狀況如何A.兩個分子有放射性，兩個分子無放射性B.均有放射性C.兩條鏈中的半條具有放射性D.兩條鏈中的一條具有放射性E.均無放射性2 .DNA復制時哪種酶不需要A.DNA指導的DNA聚合酶B.DNA指導的RNA聚合酶C.連接酶D.RNA指導的DNA聚合酶E.拓撲異構酶3 .原核生物的DNA聚合酶A.DNA聚合酶I有7種、9個亞單位B.DNA聚合酶H有最強的外切核酸酶的活性C.DNA聚合酶出是真正的起復制作用的酶D.催化過程產(chǎn)生的焦磷酸是主要底物E.用4種脫氧核昔作底物生物信息的傳遞(上)一從D

29、NA到RNA基因表達：是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的整個過程。轉(zhuǎn)錄(transcription):以DNA為模板，按照堿基互補原則合成一條單鏈RNA,從而將DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)移到RNA中去的過程稱為轉(zhuǎn)錄。編碼鏈(codingstrand尸有意義鏈模板鏈(templatestrand尸反義鏈不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription):轉(zhuǎn)錄僅發(fā)生在DNA的一條鏈上。啟動子(promoter)：是DNA轉(zhuǎn)錄起始信號的一段序列，它能指導全酶與模板正確的結合，并活化酶使之具有起始特異性轉(zhuǎn)錄形式。終止子(terminator):轉(zhuǎn)錄終止的信號，其作用是在DNA模板特異位

30、置處終止RNA的合成。轉(zhuǎn)錄單位：DNA鏈上從啟動子直到終止子為止的長度稱為一個轉(zhuǎn)錄單位。3.1 RNA的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的基本過程都包括：模板識別、轉(zhuǎn)錄起始、通過啟動子及轉(zhuǎn)錄的延伸和終止。1、模板識別階段主要指RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結合的過程。轉(zhuǎn)錄起始前，啟動子附近的DNA雙鏈分開形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核甘酸與模板DNA的堿基配對。2、轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個核甘酸鍵的產(chǎn)生。3、轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個核甘酸短鏈是通過啟動子階段，通過啟動子的時間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率越高。4、RNA聚合酶離開啟動子，沿DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。5、當RN

31、A鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。3.1.1 轉(zhuǎn)錄的基本過程RNA合成的基本特點：1 .底物是：ATP、GTP、CTP、UTP2 .在聚合酶作用下形成磷酸酯鍵3 .RNA的堿基順序由DNA的順序決定4 .僅以一條DNA鏈作為模板5 .合成方向為5'一3'6 .合成中不需要引物3.1.2 轉(zhuǎn)錄機器的主要成分亞基基因相對分子量皿基數(shù)組分功能arpoA3.65X1042核心酶核心酶組裝，啟動子識別rpoB1.51X1051核心酶3和3'共同形成RNA合成的活性中心B，rpoC1.55X5101核心酶?11

32、X1041核心酶*(TrpoD7.0X1041(T因子存在多種b因子，用于識別不同的啟動子原核生物RNA聚合酶：1、RNA聚合酶：大多數(shù)原核生物RNA聚合酶的組成是相同的，大腸桿菌RNA聚合酶由2個a亞基、一個3亞基、一個3'亞基和一個3亞基組成，稱為核74心酶。加上一,個(T亞基后則成為聚合酶全酶(holoenzyme),相對分子質(zhì)量為4.65X105。研究發(fā)現(xiàn)，由3和3'亞基組成了聚合酶的催化中心，它們在序列上與真核生物RNA聚合酶的兩個大亞基有同源性。3亞基能與模板DNA、新生RNA鏈及核甘酸底物相結合。d因子可以極大地提高RNA聚合酶對啟動子區(qū)DNA序列的親和力，加入b

33、因子以后，RNA聚合酶全酶識別啟動子序列的特異性總共提高了107倍。b因子的作用是負責模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，轉(zhuǎn)錄的起始從化學過程來看是單個核甘酸與開鏈啟動子-酶復合物相結合構成新生RNA的5'端，再以磷酸二酯鍵的形式與第二個核甘酸相結合，起始的終止反映在b因子的釋放。過去認為二核甘酸的形成就是轉(zhuǎn)錄起始的終止，實際上，只有當新生RNA鏈達到6-9個核甘酸時才能形成穩(wěn)定的酶-DNA-RNA三元復合物，才釋放b因子，轉(zhuǎn)錄進入延伸期。真核生物RNA聚合酶真核生物中共有3類RNA聚合酶。真核生物RNA聚合酶一般有8-14個亞基所組成，相對分子質(zhì)量超過5X105。除了細胞核中的RNA聚合酶之外

34、，真核生物線粒體和葉綠體中還存在著不同的RNA聚合酶。線粒體RNA聚合酶只有一條多肽鏈，相分子質(zhì)量小于7X104,是已知最小的RNA聚合酶之一，與T7噬菌體RNA聚合酶有同源性。葉綠體RNA聚合酶比較大，結構上與細菌中的聚合酶相似，由多個亞基組成，部分亞基由葉綠體基因組編碼。線粒體和葉綠體RNA聚合酶活性不受a-鵝膏覃堿所抑制。常用的轉(zhuǎn)錄抑制劑及其作用：抑制劑靶酶抑制作用利福霉素細菌的全酶與3亞基結合，阻止起始鏈莓溶菌素細菌的核心酶與3業(yè)基結合，阻止延長放線苗素D真核RNA聚合酶I與DNA結合，并阻止延長a-鵝膏蕈堿真核RNA聚合酶n與RNA聚合酶n結合，起始復合物的形成轉(zhuǎn)錄可被分為4個階段，

35、即啟動子的選擇、轉(zhuǎn)錄起始、RNA鏈的延伸和終止。原核生物中：啟動子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對啟動子的識別，聚合酶與啟動子可逆性結合形成封閉復合物(closedcomplex)。真核生物RNA聚合酶n所形成的轉(zhuǎn)錄起始復合物：除了RNA聚合酶之外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始過程中至少還需要7種輔助因子參與。一般情況下，該復合物可以進入兩條不同的反應途徑，一是合成并釋放2-9個核甘酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物，即所謂的流產(chǎn)式起始；二是盡快釋放b亞基，轉(zhuǎn)錄起始復合物通過上游啟動子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復合物。RNA聚合酶的核心酶雖可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位點。只有帶6因

36、子的全酶才能專一地與DNA的啟動子結合，選擇其中一條鏈作為模板，合成均一的產(chǎn)物。6因子的作用只在起始，一旦轉(zhuǎn)錄開始，它就脫離了起始復合物，而由核心酶負責RNA鏈的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是啟動子的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，而核心酶的作用是鏈的延伸。真核生物RNAPolII的轉(zhuǎn)錄起始復合物真核生物轉(zhuǎn)錄起始除RNA聚合酶外，至少還需要7種輔助因子參與，如TBP,TFIIA,TFIIB,TFIID,TFIIE,TFIIF和TFIIH。3.2 啟動子與轉(zhuǎn)錄起始2、啟動子與轉(zhuǎn)錄起始啟動子是一段位于結構基因5'端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與范本DNA準確地相結合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性

37、。轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達的關鍵階段，而這一階段的重要問題是RNA聚合酶與啟動子的相互作用。3.2.1 啟動子區(qū)的基本結構轉(zhuǎn)錄單元(transcriptionunit):是一段從啟動子開始至終止子結束的DNA序列，RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄起點開始沿著模板前進，直到終止子為止，轉(zhuǎn)錄出一條RNA鏈。轉(zhuǎn)錄起點是指與新生RNA鏈第一個核甘酸相對應DNA鏈上的堿基，研究證實通常為一個喋吟。常把起點前面，即5'末端的序列稱為上游(upstream),而把其后面即3'末端的序列稱為下游(downstream)。在啟動子區(qū)內(nèi)有一個由5個核甘酸組成的共同序列，是RNA聚合酶的緊密結合點，現(xiàn)稱為Pribno

38、w區(qū)(Pribnowbox),該區(qū)的中央約位于起點上游10bp處，故又稱-10區(qū)。絕大部分啟動子都存在位于-10bp處的TATA區(qū)和-35bp處的TTGACA區(qū)。這兩段共同序列是RNA聚合酶與啟動子的結合位點，能與b因子相互識別而具有很高的親和力。Pribnow區(qū)(Pribnowbox)這個區(qū)的中央大約位于起點上游10bp處，所以又稱為-10區(qū)。TTGACA。這個區(qū)的中央大約位于起點上游35bp處，所以又稱為-35區(qū)。-10位的TATA區(qū)和-35位的TTGACA區(qū)是RNA聚合酶與啟動子的結合位點，能與b因子相互識別而具有很高的親和力。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中發(fā)現(xiàn)了類似

39、Pribnow區(qū)的Hogness區(qū)(Hognessbox),這是位于轉(zhuǎn)錄起始點上游-25-30bp處的共同序列TATAAA,也稱為TATA區(qū)(圖3-7)。另外，在起始位點上游-70-78bp處還有另一段共同序列CCAAT,這是與原核生物中-35bp區(qū)相對應的序列，稱為CAAT區(qū)(CAATbox)。在-70-80區(qū)含有CCAAT序歹U(CAATbox),在-80-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序歹U(GCbox)。3.2.2 啟動子區(qū)的識別氫鍵互補學說：RNA聚合酶并不直接識別堿基對本身，而是通過氫鍵互補的方式加以識別。這種氫鍵互補學說較為圓滿地解釋了啟動子功能既受DNA序列影響，

40、又受其構象影響這一事實。3.2.3 酶與啟動子區(qū)的結合在RNA聚合酶與啟動子相互作用的過程中，聚合酶首先與啟動子區(qū)閉合雙鏈DNA相結合，形成二元閉合復合物，然后經(jīng)過解鏈得到二元開鏈復合物。DNA開鏈是按照DNA模板序列正確引入核甘酸底物的必要條件。RNA聚合酶既是雙鏈DNA結合蛋白，又是單鏈DNA結合蛋白。3.2.4 -10區(qū)和-35區(qū)的最佳間距在原核生物中，-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離大約是1679bp,小于15bp或大于20bp者B會降低啟動子的活性。在細菌中常見兩種啟動子突變，一種叫下降突變(downmutation),如果把Pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT就會大大降低其結

41、構基因的轉(zhuǎn)錄水平；另一類突變叫上升突變(upmutation),即增加Pribnow區(qū)共同序列的同一性。3.2.5 增強子及其功能能強化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強子或強化子(enhancer)。增強子很可能通過影響染色質(zhì)DNA-蛋白質(zhì)結構或改變超螺旋的密度而改變模板的整體結構，從而使得RNA聚合酶更容易與范本DNA相結合，起始基因轉(zhuǎn)錄。增強子與啟動子的區(qū)別：1 .增強子對于啟動子的位置不固定，而能有很大的變動；2 .它能在兩個方向產(chǎn)生作用。一個增強子并不限于促進某一特殊啟動子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激在它附近的任一啟動子。3.2.6真核生物啟動子對轉(zhuǎn)錄的影響習慣上，將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動子元件

42、（upstreampromoterelement，UPE）或稱上游激活序列（upstreamactivatingsequence，UAS）。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中發(fā)現(xiàn)了類似Pribnow區(qū)的Hogness區(qū)（Hognessbox）,這是位于轉(zhuǎn)錄起始點上游-25-30bp處的共同序列TATAAA,也稱為TATA區(qū)。另外，在起始位點上游-70-78bp處還有另一段共同序列CCAAT,這是與原核生物中-35bp區(qū)相對應的序列，稱為CAAT區(qū)（CAATbox）。在-70-80區(qū)含有CCAAT序列（CAATbox）,在-80-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序歹U

43、（GCbox）。TATA區(qū)的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始；CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點的確定。轉(zhuǎn)錄實際上是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結果。轉(zhuǎn)錄的終止RNA聚合酶起始基因轉(zhuǎn)錄后，它就會沿著范本5'-3'方向不停地移動，合成RNA鏈，直到碰上終止信號時才與模板DNA相脫離并釋放新生RNA鏈。終止發(fā)生時，所有參與形成RNA-DNA雜合體的氫鍵都必須被破壞，范本DNA鏈才能與有意義鏈重新組合成DNA雙鏈。3.4終止和抗終止不依賴于p因子的終止終止位點上游一般存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成

44、發(fā)卡式結構。在終止位點前面有一段由4-8個A組成的序列，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3端為寡聚U，這種結構特征的存在決定了轉(zhuǎn)錄的終止。終止效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關，隨著發(fā)卡式結構（至少6bp）和寡聚U序列（至少4個U）長度的增加，終止效率逐步提高。依賴于p因子的終止P因子是一個相對分子質(zhì)量為2.0X105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷酸三磷酸，實際上是一種NTP酶，它通過催化NTP的水解促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。3.4.3抗終止抗轉(zhuǎn)錄終止主要有兩種方式：1 .破壞終止位點RNA的莖環(huán)結構2 .依賴于蛋白質(zhì)因子的轉(zhuǎn)錄抗終止3.3原核生物與真核生物mRNA的特征比較原

45、核生物mRNA的特征mRNA在大腸桿菌細胞內(nèi)占總RNA的2%左右（tRNA占16%，而rRNA則占80%以上）。原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個細胞空間里，而且這兩個過程幾乎是同步進行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時就被引發(fā)了。一個原核細胞的mRNA（包括病毒）有時可以編碼幾個多肽。3.3.1 原核生物mRNA的特征1 .原核生物mRNA的半衰期短2 .許多原核生物mRNA以多順反子的形式存在3 .原核生物mRNA的5端無帽子結構，3端沒有或只有較短的poly（A）結構4 .原核生物起始密碼子AUG上游7-12個核苷酸處有一被稱為SD序列（Shine-Dalgarnos

46、equence）的保守區(qū)，因為該序列與16S-rRNA3端反向互補，所以被認為在核糖體-mRNA的結合過程中起作用。只編碼一個蛋白質(zhì)的mRNA稱為單順反子mRNA（monocistronicmRNA），把編碼多個蛋白質(zhì)的mRNA稱為多順反子mRNA（polycistronicmRNA）。多順反子mRNA是一組相鄰或相互重迭基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這樣的一組基因可被稱為一個操縱子（operon），是生物體內(nèi)的重要遺傳單位。如大腸桿菌乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄成編碼3條多肽的多順反子mRNA,經(jīng)過翻譯生成3半乳糖昔酶、透過酶及乙?；D(zhuǎn)移酶。真核生物mRNA的特征前體RNA成熟mRNA“基因”的分子生物學定義是：產(chǎn)生一

47、條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列！3.3.2真核生物mRNA的特征1. 真核生物mRNA的5端存在“帽子”結構：pppApNpNp。2. 絕大多數(shù)真核生物mRNA具有多聚（A）尾巴。帽子結構帽子被扣在了mRNA的5端，并可能在幾個位置發(fā)生甲基化。mRNA5'端加“G”的反應是由鳥甘酸轉(zhuǎn)移酶完成的。帽子甲基化作用帽子0：出現(xiàn)在所有真核生物中。尿苷酸一7一甲基轉(zhuǎn)移酶在G的7N位甲基化帽子1：除單細胞生物以外所有其他真核生物中都有的最主要的帽子。2一甲基一轉(zhuǎn)移酶第2個堿基的2OH位置上（實際上在任何修飾反應進行前，它是轉(zhuǎn)錄物中原來的第1個堿基）帽子2：甲基基團可以添加到戴帽mRNA

48、的第3堿基上。這個反應的底物是已經(jīng)具有兩個甲基基團的帽子mRNA。2一甲基一轉(zhuǎn)移酶催化2OH位置上甲基化這種帽子通常低于戴帽群體總量的1015。二、mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾帽子1、 帽子的種類帽子0（Cap-0）m7GpppXpYp（共有）帽子1（Cap-1）m7GpppXmpYp第一個核苷酸的2 O位上產(chǎn)生甲基化（AN6位甲基化）帽子2（Cap-2）m7GpppXmpYm第二個核苷酸的2-O位上產(chǎn)生甲基化（A、G、C、U）其中:單細胞真核生物只有Cap0 Cap1是其余真核生物的主要帽子形式 Cap2存在于某些真核生物中2、 帽子結構的生成 甲基供體都為S一腺昔甲硫氨酸（SAM） RNA鳥苷酸轉(zhuǎn)

49、移酶戴帽酶(cappingenzyme)3、 帽子結構的功能1) 對翻譯起識別作用為核糖體識別RNA提供信號Cap0的全部都是識別的重要信號Cap1,2的甲基化能增進識別2)增加mRNA穩(wěn)定性，使5端免遭外切核酸酶的攻擊3)與某些RNA病毒的正鏈合成有關(Cap1、Cap2)除帽子結構外的Euk.mRNA內(nèi)部甲基化m6A形式PolyA尾巴3、 poly(A)的功能1) 可能與核質(zhì)轉(zhuǎn)運有關2) 與mRNA的壽命有關3) 與翻譯有關a、 缺失可抑制體外翻譯的起始b、 胚胎發(fā)育中，poly(A)對其mRNA的翻譯有影響(非poly(A)化的為儲藏形式)c、 對含poly(A)的mRNA失去poly(

50、A)可減弱其翻譯4) poly(A)在分子生物學實驗中有很大應用價值a.也可將oligo(dT)與載體相連，從總體RNA中分離純化mRNAb.用寡聚dT(oligo(dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA若干基本概念基因表達的第一步以D.S.DNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板，在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下，按A=U,C=G配對的原則，合成RNA分子模板單鏈DNA的極性方向為3'-5',而非模板單鏈DNA的極性方向與RNA鏈相同，均為5'f3'。5) 5內(nèi)含子的剪接、編輯及化學修飾一、概述割裂基因(splitgene)：指編碼某一RNA的基因中有些序列并不出現(xiàn)在成熟

51、的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其他的序列隔開內(nèi)含子(intron)：原初轉(zhuǎn)錄物中經(jīng)RNA拼接反應而被去除的RNA序列或基因中與這些RNA序列相應的DNA序列外顯子(excon)：RNA拼接(RNAsplicing)：一個基因的外顯子和內(nèi)含子共同轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，將內(nèi)含子去除而把外顯子連接起來形成成熟RNA分子的過程。拼接點：5拼接點或左拼接點(內(nèi)含子上游)3拼接點或右拼接點(下游)3.5.1RNA中的內(nèi)含子真核生物mRNA前體的加工：1. 5端形成特殊的帽子結構2. 在3端切斷并加上一個poly(A)的尾巴3. 通過剪接除去轉(zhuǎn)錄來的IVS(非翻譯區(qū))4. 鏈內(nèi)部核酸的甲基化內(nèi)含

52、子的分類中部核心結構(centralcorestructure):在有些內(nèi)含子中，含有4個重復的保守序列，長度為1020bp，4個保守序列構成一種二級結構，在拼接中起重要作用。由于并非所有的內(nèi)含子都有中部核心結構，所以有了內(nèi)含子的分類I類(groupI):含有中部核心結構的細胞器基因核基因n類(groupn):不含有中部核心結構細胞器線粒體基因內(nèi)核基因出類(groupm):具有GU-AG特征的邊界序列核基因mRNA前體RNA基因的內(nèi)元均位于tRNA的反密碼環(huán)上3、拼接方式方式一：由拼接裝置完成(核mRNA內(nèi)含子)可供識別的特異序列拼接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白組成方式二：自我拼接(兩類內(nèi)含子I、

53、n)形成特定的二級結構RNA具有催化拼接的能力方式三：需要蛋白質(zhì)酶參與的拼接(酵母tRNA)前兩種拼接都屬于轉(zhuǎn)酯反應3.5.2 RNA的剪接RNA的剪接實質(zhì)：就是要把斷裂基因的內(nèi)含子除去，連接外顯子。剪切方式：mRNA前體的剪接；自我剪接；蛋白質(zhì)剪接(tRNA)。剪接體(spliceosome):各種參與剪接的成分形成的一個體系。Ribozyme:有酶活性的RNA。拼接機制(Splicingmehanism)SnRNA(orScRNA)與拼接點序列間存在互補區(qū)域并參與剪接,形成拼接體(spliceosome)。Spliceosome逐級組裝，SnRNA(U1、U2、U5和U4U6)分步替代。U

54、1通過5拼接點互補而結合，U2識別并結合分支點A,U1和U2作用使內(nèi)元的5端和3端帶到一起(U1與3拼接點配對)，U1、U2、mRNA與U4U5U6復合物形成一個完整的拼接體。3.5.3 RNA的編輯和化學修飾RNA的編輯：是在mRNA水平上改變遺傳信息的過程。種類：單堿基突變；尿苷酸的缺失和添加化學修飾：甲基化；硫代；二價鍵的飽和化；去氨基化；堿基的同分異構化；核苷酸的替代。習題1. 真核生物的TATA盒是:A.轉(zhuǎn)錄的起始點B.翻譯的起始點C.RNA聚合酶與DNA模板穩(wěn)定結合處D.DNA聚合酶的活性中心E.DNA合成起始位點2 .關于RNA的敘述,錯誤的是:A.主要有mRNA、tRNA、rRNA三大類B.胞質(zhì)中只有一種RNA,即mRNAC.最小的一種RNA是tRNAD.原核生物沒有hnRNAE.原核生物沒有snRNA3 .真核細胞中mRNA的加工修飾不包括:A.在mRNA3'末端加polyA尾B.mRNA的前體是核內(nèi)hnRNAC.在mRNA5'端形成7甲基鳥甘酸帽子結構D.除去非結構信息部分E.不同RNA片段之間的拼接4 .絕大多數(shù)真核生物mRNA5端有:A.帽式結構B.polyAC.起始密碼子D.啟動子E.SD序列5 .snRNA的功能是:BA.參與DNA復制B.參與RNA剪接C.激活