ACCC-微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程

1、國(guó)家自然科技資源平臺(tái) 微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程（試行） 甘然科技資源收集、整理、保存技術(shù)規(guī)程研究與制定 項(xiàng)目組 二0。四年十二月十日前言2 引言3 1范圍4 2定義4 3基本原則5 4方法5 附錄A定期移植保藏法6 附錄B液體石蠟保藏法9 附錄C沙土管保藏法11 參考文獻(xiàn)13本規(guī)范由國(guó)家自然科技資源平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目提出。 本規(guī)范起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所、中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所、中國(guó)藥品生物制品檢定所、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。 本規(guī)范主要起草人：程池、李金霞、胡海蓉、姜瑞波、顧金剛、周宇光、樸春根

2、、葉強(qiáng)、 張?jiān)虑?、陳敏等。微生物菌種常規(guī)保藏是一類重要的基本操作技術(shù)，廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究、教學(xué)及生物技 術(shù)產(chǎn)業(yè)，是保護(hù)微生物菌種資源的重要手段，是科研教學(xué)及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的重要保 障。本規(guī)程包括定期移植保藏法、液體石蠟保藏法和沙土管保藏法三種常用微生物菌種保藏 方法。 制定本規(guī)程是為了規(guī)范微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)操作，加強(qiáng)管理，以達(dá)到保護(hù)微生物菌 種資源，利用微生物菌種資源及實(shí)現(xiàn)資源共享的目的。微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程 1范圍 本規(guī)程規(guī)定了微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)的基本原則和方法。 本規(guī)程適用于微生物菌種的常規(guī)保藏工作。 2定義 本規(guī)程采用下列定義。2.1 微生物菌種資源microorga

3、nismresources 指可培養(yǎng)的有一定科學(xué)意義、 具有實(shí)際或潛在實(shí)用價(jià)值的古菌、細(xì)菌、真菌、病毒、細(xì)胞株等及其相關(guān)信息數(shù)據(jù)。 2.2 菌種保藏culturepreservation 是指將微生物菌種用各種適宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性狀基本 穩(wěn)定。 2.3 定期移植保藏法subculturing 亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指將菌種接種于適宜 的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長(zhǎng)充分后，于4C-6c進(jìn)行保存并間隔一定時(shí)間進(jìn)行移植培養(yǎng)的菌種保藏方法。 2.4 液體石蠟保藏法preservationunderliquidparaffin 亦稱礦物

4、油保藏法，定期移植保藏法的輔助方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至菌種長(zhǎng)出健壯菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個(gè)斜面，再直 立放置于4C15c進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。 2.5 沙土管保藏法sandpreservation 亦稱載體保藏法。是指將培養(yǎng)好的微生物細(xì)胞或抱子用無菌水制成懸浮液，注入滅菌的 沙土管中混合均勻，或直接將成熟抱子刮下接種于滅菌的沙土管中，使微生物細(xì)胞或抱子吸 附在載體上，將管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于 藏方法。 3基本原則 3.1應(yīng)針對(duì)菌種特性選擇適宜方法進(jìn)行保藏。 3.3應(yīng)保證菌種保藏的安全性，不能對(duì)周圍環(huán)境造成污染和危害。 4方法

5、定期移植保藏法 見附錄Ao 液體石蠟保藏法 見附錄Bo 4.3沙土管保藏法 見附錄Co4C-15C進(jìn)行保存的一種菌種保 定期移植保藏法 A.1適用范圍 本方法適用于大多數(shù)細(xì)菌和真菌。 A.2原理 低溫條件下保藏可減緩微生物菌種的代謝活動(dòng)， 抑制其繁殖速度， 達(dá)到減少菌株突變， 延長(zhǎng)菌種保藏時(shí)間的目的。 保藏培養(yǎng)基一般含較多有機(jī)氮，糖分總量不超過2%,既能滿足菌種培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)繁殖的 需要，又可防止因產(chǎn)酸過多而影響菌株的保藏。 A.3技術(shù)要求 A.3.1不同菌種應(yīng)根據(jù)要求選擇合適的培養(yǎng)基。 A.3.2接種時(shí)要求無菌操作，避免染菌。 A.3.3保藏期間要定期檢查菌種存放的房間、冷庫(kù)、冰箱等的溫度、濕度

6、，各試管的棉塞 有無污染現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)異常應(yīng)取出該管，重新移植培養(yǎng)后補(bǔ)上空缺。 A.3.4大量菌種同時(shí)移植時(shí)，各菌株的菌號(hào)、所用培養(yǎng)基要進(jìn)行核對(duì)，避免發(fā)生錯(cuò)誤。 A.3.5每次移植培養(yǎng)后，應(yīng)與原保藏菌株和菌株的登記卡片逐個(gè)對(duì)照，檢查無誤后再存放。 A.3.6斜面菌種應(yīng)保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對(duì)照，防止因意外和污染造成損失。 A.4方法與步驟 A.4.1培養(yǎng)基制備 A.4.1.1器皿準(zhǔn)備 培養(yǎng)基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，根 據(jù)不同情況洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。 A.4.1.2溶解培養(yǎng)基配料 先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項(xiàng)材料，依次將緩沖化合物、

7、主要元素、微 量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。 配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求加稀酸或稀堿調(diào)pH直。加酸或堿液時(shí)要緩慢、 少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導(dǎo)致測(cè)量不準(zhǔn)確和營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。 A.4.1.4加凝固劑 配制固體培養(yǎng)基時(shí)需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并 不斷攪拌至融解，再補(bǔ)足所蒸發(fā)水分。 A.4.1.5過濾分裝 在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝，斜面培養(yǎng)基不宜超過試 管高度的四分之一。分裝過程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。 A.4.1.6包扎標(biāo)記 將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)

8、基名稱及配制日期。 A.4.1.7滅菌 根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅菌。滅菌后擺放斜面時(shí)，斜面長(zhǎng)度不超過試管管長(zhǎng)的二分之一為宜。 A.4.1.8無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無菌檢驗(yàn)。 A.4.2接種 A.4.2.1斜面接種 A.4.2.1.1點(diǎn)接 把菌種點(diǎn)接在斜面中部偏下方處。適用于擴(kuò)散型生長(zhǎng)及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、 根霉等）。 A.4.2.1.2中央劃線 從斜面中部自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等。 A.4.2.1.3稀波狀蜿蜒劃線法 從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴(kuò)散的細(xì)菌，也適用于部分真菌。 A.4.2.1.4密波狀蜿蜒劃線法 從斜面底部自下而上劃密“之”字形線

9、。能充分利用斜面獲得大量菌體細(xì)胞，適用于細(xì) 菌和酵母菌等。 A.4.2.1.5挖塊接種法 挖取菌絲體連同少量瓊脂培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類真菌。 A.4.2.2穿刺接種 用直接種針從原菌種斜面上挑取少量菌苔，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近 管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細(xì)菌和酵母菌等。 A.4.2.3液體接種 挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。 A.4.3培養(yǎng) 將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定期或得到成熟抱子。 A.4.4保藏 A.4.4.1保藏溫度和時(shí)間 培養(yǎng)好的菌種于4C6c保

10、存，根據(jù)要求每36個(gè)月移植一次。對(duì)于某些菌種，如芽 裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須13個(gè)月移植一次。 A.4.4.2保藏濕度 用相對(duì)濕度表示，通常為50%-70%。測(cè)量?jī)x表采用毛發(fā)濕度計(jì)或干濕球濕度計(jì)。 A.4.5移植培養(yǎng) 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到另一新鮮培養(yǎng)基中，再在適宜條件下培養(yǎng)。 A.4.6菌種復(fù)壯 菌種如有退化，應(yīng)將退化的菌種引入原來的生活環(huán)境中令其生長(zhǎng)繁殖，通過純種分離， 在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)等方法進(jìn)行復(fù)壯。附錄B 液體石蠟保藏法 B.1適用范圍 本方法適用于不能分解液體石蠟的酵母菌、某些細(xì)菌（如芽抱桿菌屬，醋酸桿菌屬等） 和某些絲狀真菌（如青霉屬，曲霉屬等）。 原理 液體石蠟保藏法可作為定期

11、移植保藏法的輔助方法。在液體石蠟覆蓋下，菌種的生物代 謝受到抑制，細(xì)胞老化被推遲。此方法可阻止氧氣進(jìn)入，使好氣菌不能繼續(xù)生長(zhǎng)，也可防止因培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)而引起的菌體死亡，達(dá)到延長(zhǎng)菌種保藏時(shí)間的目的。 技術(shù)要求 菌種培養(yǎng)參照附錄A。 應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟。 液體石蠟易燃，在對(duì)液體石蠟保藏菌種進(jìn)行操作時(shí)注意防止火災(zāi)。 保藏場(chǎng)所應(yīng)保持干燥，防止棉塞污染。 保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充滅菌的液體石蠟。 方法與步驟 液體石蠟 將液體石蠟分裝加棉塞，用牛皮紙包好，0.1MPa滅菌30分鐘取出，置40c恒溫箱蒸發(fā) 水分，經(jīng)無菌檢查后備用。 斜面培養(yǎng)物的制備 參照附錄A,斜面宜短，不超

12、過試管三分之一為宜。 灌注石蠟 無菌條件下將滅菌的液體石蠟注入剛培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1厘米 左右，使菌體與空氣隔絕。 保藏 將注入石蠟油的菌種斜面直立存放于低溫（4C-15C）干燥處，保藏時(shí)間為2-10年不等。 恢復(fù)培養(yǎng) 恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)繁殖后,再重新轉(zhuǎn)接一次。 附錄C 沙土管保藏法 C.1適用范圍 本方法適用于產(chǎn)抱類放線菌、芽抱桿菌、曲霉屬、青霉屬以及少數(shù)酵母如隱球酵母和紅酵母等。不適用于病原性真菌的保藏，特別是不適于以菌絲發(fā)育為主的真菌的保藏。 C.2原理 干燥條件下微生物菌種代謝活動(dòng)減緩，繁殖速度受到抑制。此方法可減少菌株突變，延

13、長(zhǎng)存活時(shí)間。 C.3方法與步驟 C.3.1沙土管制備 將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質(zhì)，再用80目過篩，去掉細(xì)沙。用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機(jī)物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時(shí)后倒去鹽酸， 用水洗泡數(shù)次至中性，將沙子烘干或曬干。另取瘦紅土100目過篩，水洗至中性，烘干，按沙：士=2：1混合。把混勻的沙土分裝入安甑管或小試管中，高度為1厘米左右。塞好棉塞，0.1MPa 滅菌30分鐘，或常壓間歇滅菌3次，每天每次1小時(shí)。滅菌后在不同部位抽出若干管，分別加營(yíng)養(yǎng)肉汁、麥芽汁、豆芽汁等培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)檢查后無微生物生長(zhǎng)方可使用。 C.3.2斜面培養(yǎng)物的制備 參照附錄Ao

14、C.3.3制備菌懸液 向培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物中注入3mL-5mL無菌水，洗下細(xì)胞或抱子制成菌懸液。用無菌 吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2mL-0.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取抱子拌入沙土管中。 C.3.4干燥 用真空泵抽去安甑管中水分并放置于干燥器內(nèi)。 C.3.5純培養(yǎng)檢查 從做好的沙土管中，按10:1比例抽查。無菌條件下用接種環(huán)取出少量沙土粒，接種于適宜的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察其生長(zhǎng)情況和有無雜菌生長(zhǎng)。如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少，或根本不長(zhǎng)，則須進(jìn)一步抽樣檢查。 C.3.6保藏 將純培養(yǎng)檢查合格的沙土管用火焰熔封管口。制好的沙土管存放于低溫（4C-15C）干燥 處，半年檢查一次活力及雜菌情況。也可將純培養(yǎng)檢查合格的沙土管直接用牛皮紙或塑料紙 包好，置干燥器內(nèi)保存。用此方法保藏時(shí)間為2-10年不等。 C.3.7復(fù)活 復(fù)活時(shí)在無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培