復(fù)方丹參片微生物限度檢查方法驗(yàn)證_張亞宇

1、收稿日期:20120917作者簡(jiǎn)介:張亞宇(1971,女,工程師,主要從事藥物檢驗(yàn)工作。復(fù)方丹參片微生物限度檢查方法驗(yàn)證張亞宇,孔劍鋒,周國(guó)璽(甘肅隴神戎發(fā)藥業(yè)股份有限公司,甘肅蘭州730101摘要:目的建立復(fù)方丹參片的微生物限度檢查方法。方法按照中國(guó)藥典2010版一部附錄微生物限度檢查法驗(yàn)證的要求對(duì)復(fù)方丹參片微生物限度檢查進(jìn)行了方法建立和驗(yàn)證研究。供試液制備采用離心沉淀法,制成110供試液。采用培養(yǎng)基稀釋法(1100供試液,每皿01mL 進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn),稀釋法(1100供試液,每皿1mL 進(jìn)行霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn),采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢查。結(jié)果5種驗(yàn)證菌株的回收率均高于70%;控制菌檢查經(jīng)

2、方法驗(yàn)證,可按常規(guī)法進(jìn)行大腸埃希菌和大腸菌群檢查。結(jié)論建立的方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好,適用于復(fù)方丹參片的微生物限度檢查。關(guān)鍵詞:復(fù)方丹參片(薄膜衣片;抑菌作用;微生物限度檢查;方法驗(yàn)證中圖分類號(hào):R2860文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B 文章編號(hào):10038450(201301005504復(fù)方丹參片具有活血化瘀、理氣止痛之功效,臨床應(yīng)用廣泛。復(fù)方丹參片含丹參、三七、冰片3種成分,因丹參對(duì)體外的葡萄球菌、變形桿菌有較強(qiáng)的抑制作用1,冰片對(duì)金黃色葡萄球菌、黑曲霉等真菌有較強(qiáng)的抑制作用23,所以復(fù)方丹參片可抑制微生物的生長(zhǎng),不能采用常規(guī)法進(jìn)行該藥品的微生物限度檢查,且不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片抑菌作用不同4。為了更有

3、效地控制其藥物質(zhì)量,本試驗(yàn)采用了多種方法以消除該藥物的抗菌活性,對(duì)其微生物污染進(jìn)行有效地檢測(cè),按要求5將5株代表試驗(yàn)菌(金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉加入復(fù)方丹參片中,對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率進(jìn)行逐一驗(yàn)證,并對(duì)控制菌檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證,建立復(fù)方丹參片的微生物限度檢查方法。1儀器與材料11儀器YY002790培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;082離心機(jī),常州國(guó)華電器有限公司;LDZX 50FB 立式蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;SW CJ IFD 超凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)安泰公司;HG3034生化培養(yǎng)箱,上海南京電器三廠。12供試品復(fù)方丹參片,甘肅隴神戎發(fā)藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)為

4、20101001,20101006,20101007,規(guī)格:薄膜衣小片,032g /片。13驗(yàn)證用菌種枯草芽孢桿菌CMCC (B 63501、大腸埃希菌CMCC (B 44102、金黃色葡萄球菌CMCC (B 26003、白色念珠菌CMCC (F 98001、黑曲霉CMCC (F 98003,均由甘肅省食品藥品檢驗(yàn)所提供,以上菌種均為第3代。14培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基,中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn),均按中國(guó)藥典2010版附錄配制。15稀釋劑pH 70無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液,按中國(guó)藥典2010版附錄配制。2方

5、法與結(jié)果21菌液的制備1取經(jīng)30 35培養(yǎng)18 24h 的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1mL ,取經(jīng)23 28培養(yǎng)24 48h 的白色念珠菌真菌肉湯液體培養(yǎng)物1mL ,分別加09%無(wú)菌氯化鈉溶液9mL ,10倍逐級(jí)地稀釋至107 105,制成每毫升含菌數(shù)為50 100cfu 的菌懸液,作活菌計(jì)數(shù)備用。2取經(jīng)25培養(yǎng)7d 的黑曲霉改良馬丁斜面培養(yǎng)物,加09%無(wú)菌氯化鈉溶液5mL 洗下霉菌孢子,吸取霉菌孢子液1mL 加09%無(wú)菌氯化鈉溶液9mL ,10倍逐級(jí)地稀釋為104,制成每毫升含孢子數(shù)約為50 100cfu 的孢子懸液,作活菌計(jì)數(shù)備用。22供試液的制備稱取本品10

6、g,加pH70無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100mL,45水浴振搖,使樣品完全分散均勻,分裝于10支離心管,以500r/min離心3min,取上清液合并,作為110供試液。23各試驗(yàn)菌的回收率試驗(yàn)組的加菌回收率(%=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)100%稀釋劑對(duì)照組的加菌回收率(%=稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)100%24細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證241驗(yàn)證試驗(yàn)一試驗(yàn)組(培養(yǎng)基稀釋法:分別取上述110供試液01mL及21項(xiàng)下5種試驗(yàn)菌液各1mL(菌數(shù)約為50 100cfu/mL注入平皿,每種試驗(yàn)菌株分別制備平行樣。菌液組:取上述5種試驗(yàn)菌液各1mL,分別

7、注入平皿,每株試驗(yàn)菌制備平行樣,測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。供試品對(duì)照組:將上述110供試液01mL分別注入平皿中,測(cè)定供試品本底菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組:用稀釋液替代供試品,加入試驗(yàn)菌,使最終菌濃度為每毫升含菌數(shù)為50 100cfu,按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。上述各組細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查項(xiàng)注入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查項(xiàng)注入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,按規(guī)定條件培養(yǎng)后,觀察結(jié)果,計(jì)算各試驗(yàn)菌的回收率。結(jié)果見表1。表1回收率試驗(yàn)一結(jié)果試驗(yàn)菌試驗(yàn)次數(shù)菌落計(jì)數(shù)/(cfu/mL菌液組試驗(yàn)組供試品對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組回收率/%試驗(yàn)組稀釋劑對(duì)照組182260763293金黃色葡萄球菌275220712

8、995 371200682896174220713096枯草芽孢桿菌280280733591 376250703392193850889195大腸埃希菌295910909695 394860889194194670867191白色念珠菌278550707190 382610777494171520657392黑曲霉菌274560647686 364460577289因供試液制備需要離心處理,故增加稀釋劑對(duì)照組,以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。表1結(jié)果表明,在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中,5種試驗(yàn)菌液的稀釋劑對(duì)照組回收率均高于70%,表明供試液制備方法可行;采用培養(yǎng)基稀釋法(110供試液,每皿

9、01mL進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn),供試品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑制作用,回收率未達(dá)到70%,方法不可行;按此方法進(jìn)行霉菌及酵母菌數(shù)測(cè)定,白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均高于70%。242驗(yàn)證試驗(yàn)二將22項(xiàng)下110供試液稀釋10倍,制成1100供試液。按以下方法進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)組:細(xì)菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn),分別將上述1100供試液01mL及50 100cfu/mL金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的菌懸液各1mL同時(shí)加入平皿中,每種試驗(yàn)菌株分別制備平行樣;霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn),分別將上述1100供試液1mL及50 100cfu/mL白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液各1mL同時(shí)加入平皿中,每種試驗(yàn)菌株分別制備平

10、行樣。菌液組:取上述5種試驗(yàn)菌液各1mL,分別注入平皿,每株試驗(yàn)菌制備平行樣,測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。供試品對(duì)照組:將上述1100供試液(細(xì)菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)每皿01mL,霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)每皿1mL分別注入平皿中,測(cè)定供試品本底菌數(shù)。上述各組細(xì)菌計(jì)數(shù)檢查項(xiàng)注入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查項(xiàng)注入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,按規(guī)定條件培養(yǎng)后,觀察結(jié)果,計(jì)算各試驗(yàn)菌的回收率。結(jié)果見表2。表2結(jié)果表明,培養(yǎng)基稀釋法(1100供試液,表2回收率試驗(yàn)二結(jié)果菌種試驗(yàn)次數(shù)菌落計(jì)數(shù)/(cfu/mL菌液組試驗(yàn)組供試品對(duì)照組回收率/% 17568091金黃色葡萄球菌26659089 3605308816456088枯草芽孢

11、桿菌26861090 3746809219796099大腸埃希菌29583087 3757009317668089白色念珠菌27969087 3837509017065093黑曲霉菌27762081 36151084每皿01mL進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)、稀釋法(1100供試液,每皿1mL進(jìn)行霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn),5種試驗(yàn)菌的回收率均高于70%,方法可行。25控制菌檢查方法的驗(yàn)證復(fù)方丹參片系含藥材原粉的口服制劑,根據(jù)微生物限度要求,控制菌應(yīng)進(jìn)行大腸埃希菌、大腸菌群的檢查。供試液的制備:稱取本品10g,加pH70無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100mL,45水浴振搖,使樣品完全分散均勻,作為110供試液。大腸埃

12、希菌:試驗(yàn)組取上述110供試液10mL及10 100cfu/mL大腸埃希菌的菌懸液1mL加至100mL膽鹽乳糖增菌液中,30 35培養(yǎng)18 24h后,按中國(guó)藥典2010版控制菌(大腸埃希菌檢查法檢查,同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)、陰性對(duì)照試驗(yàn)。大腸菌群:試驗(yàn)組取上述110供試液1mL及10 100cfu/mL大腸埃希菌的菌懸液1mL加至10mL乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 35培養(yǎng)18 24h后,按中國(guó)藥典2010版控制菌(大腸菌群檢查法檢查,同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)、陰性對(duì)照試驗(yàn)。結(jié)果見表3。結(jié)果表明,3批復(fù)方丹參片控制菌試驗(yàn)組結(jié)果均為陽(yáng)性,檢出大腸埃希菌、大腸菌群,陰性對(duì)照組均未檢出,表明復(fù)方丹參片可按常規(guī)

13、法進(jìn)行大腸埃希菌、大腸菌群檢查,經(jīng)方法驗(yàn)證成立。表3控制菌的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果樣品批號(hào)大腸埃希菌供試品試驗(yàn)組陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照大腸菌群供試品試驗(yàn)組陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照20101001+20101006+20101007+注:“+”代表結(jié)果呈陽(yáng)性,“”代表結(jié)果呈陰性。3討論筆者實(shí)際工作中對(duì)復(fù)方丹參片進(jìn)行微生物限度檢查時(shí),發(fā)現(xiàn)該藥品對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性,對(duì)白色念珠菌和黑曲霉等真菌有一定的抑制作用,對(duì)大腸埃希菌抑菌作用相對(duì)較弱,這與文獻(xiàn)報(bào)道的丹參、冰片的抑菌作用相吻合。處方中的丹參、冰片等抑菌藥物是復(fù)方丹參片具有抑菌作用的直接原因,不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片抑菌作用不同,可能與藥材品質(zhì)

14、和生產(chǎn)工藝有關(guān),實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示復(fù)方丹參片不同程度的抑菌作用與其藥品質(zhì)量有一定的相關(guān)性。中國(guó)藥典2010版一部附錄XIII C微生物限度檢查法規(guī)定,具抑菌活性的供試品,其供試液的制備可采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法或中和法以消除供試液的抑菌活性,再依法檢查。復(fù)方丹參片抑菌作用較強(qiáng),本方法采用一定量供試液經(jīng)離心沉淀法處理,取全部上清液混合,作為110供試液。采用培養(yǎng)基稀釋法(1100供試液,每皿01mL進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn),稀釋法(1100供試液,每皿1mL進(jìn)行霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn),常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢查,經(jīng)方法驗(yàn)證,能有效地消除藥品中抑菌物質(zhì)的干擾,控制該產(chǎn)品質(zhì)量,該方法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好,適

15、用于復(fù)方丹參片的微生物限度檢查。3批樣品按照上述方法進(jìn)行微生物限度檢查,結(jié)果均符合規(guī)定。參考文獻(xiàn):1周靜,李惠芬,王洪志,等丹參水溶性成分與脂溶性成分抑菌作用的考察J時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2008,19(9: 213021312吳壽榮,程剛,馮巖冰片藥理作用的研究進(jìn)展J中草藥,2001,32(12:114311453趙曉洋,葛榮明冰片抗真菌作用的超微結(jié)構(gòu)觀察J哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1992,26(4:2952974王海華不同廠家復(fù)方丹參片抑菌作用強(qiáng)弱的比較J中成藥,2011,33(3:4644675國(guó)家藥典委員會(huì)中國(guó)藥典(一部M北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄XIIIC7984Validatio

16、n of microbial limit test method of Compound Danshen tabletsZhang Yayu,Kong Jianfeng,Zhou Guoxi(Gansu Longshen Rongfa Pharmaceutical Co,LTD,Lanzhou730101,ChinaAbstract:Objective To establish a method for the microbial limit test of Compound Danshen tabletsMe-thods Established the method and validati

17、on test for the microbial limit test of Compound Danshen tablets accord-ing to China pharmacopoeia(2010edition,VolAppendixCThe method of centrifugal sedimentation was adopted to prepare the probational liquid(110of Compound Danshen tabletsCulture medium dilution method (1100probational liquid,01mL/d

18、ishwas used for bacterial count,dilution method(1100probational liquid,1mL/dishwas used for mold and yeast count,in validation test of bacterial,mold and yeast countResults The recovery rate of five validation strains were higher than70%The routine method were used for the control bacteria test,methodology validation of control