現(xiàn)代生物實驗原理與技術(shù)考試整理

1、蛋白質(zhì)表達技術(shù)DNA重組表達：在合適表達元件（如轉(zhuǎn)錄啟動子、終止子、翻譯調(diào)控序列、轉(zhuǎn)錄酶、翻譯因子等）調(diào)控下，目的基因表達成目的蛋白質(zhì)的技術(shù)。外源基因在大腸桿菌中的表達：大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢：1、全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架2、基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善3、繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 4、被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達外源基因的劣勢： 1、缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 2、 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 3、 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 4、 細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素大腸桿菌表達載體分類：按蛋白質(zhì)類型分： 單純表達

2、: pJLA系列, 用NcoI/NdeI導(dǎo)入AUG的載體 融合表達: 融合各種tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表達: pel/ompT分泌肽按啟動子分：lac及衍生的tac , trc, pac, rac等啟動子 IPTG誘導(dǎo)lamda phage PL和PR 啟動子 熱誘導(dǎo)T7 啟動子 IPTG誘導(dǎo)T5 啟動子 IPTG誘導(dǎo)ara啟動子 阿拉伯糖誘導(dǎo)選擇表達系統(tǒng)：1. 蛋白質(zhì)的大?。盒〉陌|(zhì)蛋白和多肽最好能與運載序列連接，以融合蛋白的形式在大腸桿菌中表達。運載序列能起到穩(wěn)定靶蛋白的作用，使其免受胞內(nèi)蛋白酶的降解，并能提供用于親和純化的配基結(jié)合位點。用蛋白酶在融合

3、蛋白的適當(dāng)位置進行切割，可以回收有活性的靶蛋白。2. 蛋白質(zhì)的需要量：如果需要少量的靶蛋白、酶的活性可以用粗提物來分析，一般不需要進行優(yōu)化表達。3. 蛋白質(zhì)是否需要保留活性：（1）若只用于生產(chǎn)抗體，包涵體有利于分離。（2）若靶蛋白用于生物化學(xué)或細胞生物學(xué)研究，就要考慮活性，其次考慮純化問題。（3）若要用于結(jié)構(gòu)研究，最好能以可溶性狀態(tài)表達。外源基因在大腸桿菌中的表達：外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理： 轉(zhuǎn)錄： 啟動子、 終止子、核糖體結(jié)合位點 翻譯： 密碼子、質(zhì)?？截悢?shù)啟動子：Lac 表達系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理： 具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因

4、排列次序為：啟動子（lacP）- 操縱基因（lacO）- 結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA）、正調(diào)節(jié)因子 CAP、 負調(diào)節(jié)因子 lac I 正調(diào)節(jié)因子 CAP ： cAMP激活CAP，CAPcAMP復(fù)合物與 lac 操縱子上專一位點結(jié)合后，能促進 RNA 聚合酶與 35、10 序列的結(jié)合，進而促進 Plac 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。基因工程中使用的 lac 啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即 Plac UV5 lac UV5 突變體： Plac UV5 突變體能夠在沒有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 轉(zhuǎn)錄，受它控制的基因在轉(zhuǎn)錄水平上只受 lacI 的調(diào)控，因此用它 構(gòu)建的表達載體在使用時比

5、野生型 Plac 更易操作。負調(diào)節(jié)因子 lac I ： 在無誘導(dǎo)物情形下， lacI 基因產(chǎn)物形成四聚體阻遏蛋白，與啟動子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始。Trp 表達系統(tǒng)： 以大腸桿菌 trp 操縱子調(diào)控機理為基礎(chǔ)設(shè)計、構(gòu)建的表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理： 色氨酸啟動子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加 IAA 誘導(dǎo) Ptrp 介導(dǎo)的目的基因表達Tac 表達系統(tǒng)：tac 啟動子是由 trp 的 35 序列和 lacUV

6、5 的 10 序列拼接而成的雜合啟動子調(diào)控模式與 lacUV5 相似，但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平更高于 trp 和 lacUV5啟動子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有較高基因表達水平的情況下，選用 tac 啟動子比用 lacUV5 啟動子更優(yōu)越。lac、tac 啟動子對宿主菌的要求： 在普通大腸桿菌中， LacI 阻遏蛋白僅能滿足細胞染色體上 lac 操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的需要。當(dāng)多拷貝的 lacO 隨著帶有 lacUV5、tac 啟動子的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌后，LacI 阻遏蛋白與 lacO 的比例顯著下降，無法保證每一個 lacO 都能獲得足夠的 LacI

7、阻遏蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。表現(xiàn)為在無誘導(dǎo)物存在的情形下， lacUV5、tac 啟動子有較高的本底轉(zhuǎn)錄。為了使以 Lac、Tac 表達系統(tǒng)具有嚴緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的能力，一種能產(chǎn)生過量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突變體 lacIq 被應(yīng)用于表 達系統(tǒng)。大腸桿菌 JM109 等菌株的基因型均為 lacIq ，常被選用為 Lac、Tac表達系統(tǒng)的宿主菌。但是這些菌株也只能對低拷貝的表達載體實現(xiàn)嚴緊調(diào)控，在使用高拷貝復(fù)制子構(gòu)建表達載體時，仍能觀察到較高水平的本底轉(zhuǎn)錄。需在表達載體中插入 lacIq 基因以保證有較多的 LacI 阻遏蛋白產(chǎn)生。 lac、tac 表達系統(tǒng)存在的問題 ：IPTG

8、 用于誘導(dǎo) lac、tac 啟動子的轉(zhuǎn)錄，但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性。從安全角度，對表達和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。 一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用 IPTG 解決方法： lac 和 tac 啟動子的轉(zhuǎn)錄受溫度嚴緊調(diào)控 乳糖替代 IPTG 誘導(dǎo) lac 和 tac 啟動子的轉(zhuǎn)錄PL 和 PR 表達系統(tǒng)： 以 l 噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子 PL 、 PR 為核心構(gòu)建的表達系統(tǒng)在野生型 l 噬菌體中， PL 、 PR 啟動子轉(zhuǎn)錄與否決定了 l 噬菌體進入 裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理： 由 l 噬菌體 PE 啟動子控制的 cI 基因的產(chǎn)物是 PL 、

9、 PR 啟動子轉(zhuǎn)錄阻遏物。cI 基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子之間的錯綜復(fù)雜的平衡關(guān)系。由于通過細胞因子來控制cI基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當(dāng)困難的。因此 PL 、 PR 表達系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體 cI 857(ts) 的基因產(chǎn)物 來調(diào)控 PL 、 PR 啟動子的轉(zhuǎn)錄。 在較低溫度（30）時以活性形式存在 在較高溫度（42）時失活脫落宿主菌中沒有 cI 基因產(chǎn)物，PL、PR 啟動子的高強度直接轉(zhuǎn)錄，帶有PL 或 PR 啟動子的表達載體在普通大腸桿菌中相當(dāng)不穩(wěn)定。 對宿主菌的要求： 用溶源化 l 噬菌體的大腸桿菌作 PL、PR 啟動子表達載體的宿主菌N4830-1

10、，POP2136 等菌株已經(jīng)溶源化 cI 857(ts) l 噬菌體，可用作表達外源基因時的宿主菌。把 cI 857(ts) 基因組裝在表達載體上宿主菌選擇范圍更大PL 和 PR 表達系統(tǒng)存在的問題： 由于 PL 和 PR 表達系統(tǒng)誘導(dǎo)時不加化學(xué)誘導(dǎo)劑，成本又低廉，最初幾個在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用 PL 或 PR 表達系統(tǒng)。 缺陷： 在熱脈沖誘導(dǎo)過程中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達也會被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達的重組蛋白。在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時，通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30提高到 42 需要較長的時間，這種緩慢的升溫方式影響誘導(dǎo)效果，對重組蛋白表達量有一定的

11、影響。T7 表達系統(tǒng)： 大腸桿菌 T7 噬菌體具有一套專一性非常強的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達系統(tǒng)稱為 T7 表達系統(tǒng)。含T7噬菌體啟動子的表達載體：在pET系列載體中，外源基因的表達受T7噬菌體RNA聚合酶調(diào)控：帶有pBR322的大腸菌素E1（colE1）復(fù)制區(qū)，從而使宿主菌有氨芐青霉素或卡那霉素抗性。外源基因插入多克隆位點，置于天然T7RNA聚合酶啟動子或T7 lac啟動子的控制之下。T7 噬菌體基因 1 編碼的 T7 RNA 聚合酶選擇性的激活 T7 噬菌體啟 動子的轉(zhuǎn)錄。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大腸桿菌 RNA 聚合酶快 5倍左右。并可

12、以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌 RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列 在細胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過 T7 噬菌體轉(zhuǎn)錄體系，最終受 T7噬菌體啟動子控制的基因的轉(zhuǎn)錄達到很高的水平。轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理： T7 噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達系統(tǒng)的調(diào)控方式。 化學(xué)誘導(dǎo)型 溫度誘導(dǎo)型 雙質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理： 化學(xué)誘導(dǎo)型： 噬菌體 DE3 是 l 噬菌體的衍生株，一段含有 lacI、lacUV5 啟動子和 T7 RNA 聚合酶基因 DNA 片段被插入其 int 基因中用噬菌體 D

13、E3 的溶源菌作為表達載體的宿主菌，調(diào)控方式為 化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于 Lac 表達 系統(tǒng)。溫度誘導(dǎo)型： PL 啟動子控制 T7 RNA 聚合酶基因，通過熱誘導(dǎo)方式激發(fā)T7 噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到很低的水平，尤其適用于表達對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì)。雙質(zhì)粒系統(tǒng)： 一個質(zhì)粒帶有 T7 RNA 聚合酶基因，另一個質(zhì)粒帶有 T7 啟動子和目的基因兩個質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標記不能相同調(diào)控方式為控制 T7 RNA 聚合酶的啟動子調(diào)控類型T7 表達系統(tǒng)存在的問題： T7 表達系統(tǒng)表達目的基因的水平是目前所有表達系統(tǒng)中最高的，但也不可避免出現(xiàn)在相對較高的本底轉(zhuǎn)錄，如果目的基因產(chǎn)物對大

14、腸桿 菌宿主有毒性，會影響細胞的生長。 解決辦法之一： 在表達系統(tǒng)中低水平表達 T7 溶菌酶基因。因為 T7 溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上肽聚糖外，還能與T7 RNA 聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。目前 T7 溶菌酶基因都通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)拉導(dǎo)入表達系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉(zhuǎn)錄，但對誘導(dǎo)后目的基因的表達水平無明顯影響。 其他表達系統(tǒng)：營養(yǎng)調(diào)控型： 采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因 phoA 啟動子或甘油 3-磷酸轉(zhuǎn)移系 統(tǒng) ugp 啟動子構(gòu)建表達載體。這兩個啟動子受在培養(yǎng)基中的無機磷（Pi）濃度調(diào)控（Pi5mmol/L時抑制，Pi1mmol/L 時激活)，具有較高的轉(zhuǎn)錄水平。糖原調(diào)控型： 采用的有大腸桿

15、菌半乳糖轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（mglBAEC) mgl 啟動子或沙門氏菌阿拉伯糖基因 araB 啟動子構(gòu)建表達載體。這兩個啟動子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的誘導(dǎo)物。其調(diào)控機理類似于 Lac 表達系統(tǒng).pH調(diào)控型： 采用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因 cadA 啟動子構(gòu)建表達載體。 cadA 啟動子受培養(yǎng)基中 H+ 濃度，即 pH 值調(diào)控。（在pH8 時抑制，pH 6時激活，pH = 6時轉(zhuǎn)錄活力最高）。 該表達系統(tǒng)要求菌體發(fā)酵溫度控制在 27 30 之間才能使目的基因得到穩(wěn)定的表達.溶氧調(diào)控型： 采用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 啟動子，硝基還原酶基因nirB 啟動子或透明顫菌血紅蛋白基因 v

16、gb 啟動子構(gòu)建表達載體。這些啟動子中都含有對氧響應(yīng)的調(diào)節(jié)因子 fnr 的作用位點。在富氧條件下轉(zhuǎn)錄被抑制，在貧氧或微氧條件下轉(zhuǎn)錄被激活。大腸桿菌 GJ100 有透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）啟動子控制下的 T7 RNA 聚合酶基因表達質(zhì)粒， vgb 基因的轉(zhuǎn)錄是受環(huán)境溶氧濃度調(diào)控的，在貧氧條件下 vgb 基因的啟動子被激活。 因此，用大腸桿菌GJ100 作為宿主時，表達系統(tǒng)調(diào)控方式為貧氧誘導(dǎo)型， 菌體發(fā)酵時的溶氧濃度可以通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量加以調(diào)節(jié)，與其他調(diào)控模式相比更適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程。生物素調(diào)控型： 用大腸桿菌生物素操縱子及其調(diào)控區(qū)構(gòu)建表達載體，菌體生長過程中生物素會不斷消耗，當(dāng)濃

17、度到達 2ng/ml 以下時啟動子被激活。能夠在沒有外界的物理，化學(xué)信號的介入條件下自動誘導(dǎo)表達目的基因是這類表達載體的特點，其缺陷是不容易精確控制自動誘導(dǎo)的時刻。終止子：強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性： 外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即 RNA 聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA 序列，形成長短不一的 mRNA 混合物，過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA 所需的時間就相應(yīng)增加，外源基 因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域，如選擇性標記基因和復(fù)

18、制子結(jié)構(gòu)等，則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過長的 mRNA 往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗； 更為嚴重的是，過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)， 從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率強終止子的選擇與使用： 目前外源基因表達質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌 rRNA 操縱子上的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌體 DNA 上的 Tf。 對于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用核糖體結(jié)合位點：核糖體結(jié)合位點： 外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟

19、動的頻 率，而且在很大程度上還與 mRNA 的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS） 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 68 個核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的 16S rRNA 3 端區(qū)域 3 AUUCCUCC 5 并與之專一性結(jié)合將mRNA 定位于核糖體上，從而啟動翻譯； 翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以

20、 AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5 端若干密碼子的堿基序列核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響 SD 序列的影響 一般來說，mRNA 與核糖體的結(jié)合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于 SD （ UAAGGAGG）序列與16S rRNA 的堿基互補性，其中以 GGAG 四個堿基序列尤為重要。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成 C 或 T，均會導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低SD 序列與起始密碼子之間的距離的影響 SD 序列與起始密碼子 AUG 之間的精確距離保證了

21、mRNA 在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子 AUG 正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的 P 位，這是翻譯啟動的前提條件。在很多情況下，SD 序列位于 AUG 之前大約七個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基， 均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響 大腸桿菌中的起始 tRNA 分子可以同時識別 AUG、GUG 和 UUG 三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常 GUG 為 AUG 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。除此之外，從 AUG 開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與 mRNA 的 5 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會嚴重干擾

22、 mRNA 在核糖體上的準確定位目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質(zhì)粒上，均含有與 啟動子來源相同的核糖體結(jié)合位點序列，序列和間隔是最佳的。密碼子：生物體對密碼子的偏愛性不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量 在富含 AT 的生物（如單鏈 DNA噬菌體X174）基因組中，密碼子 第三位上的 U 和 A 出現(xiàn)的頻率較高；在 GC 豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有 G 或 C 的簡并密碼子占 90% 以上的絕對優(yōu)勢密碼子與反密碼子相互作用的自由能中等強度規(guī)律 如GGG、CCC、GCG、GG

23、C、AAA、UUU、AUA、UAU 等使用少 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG 等使用多細胞內(nèi) tRNA 的含量密碼子偏愛性對外源基因表達的影響： 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。 一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達： 外源基因全合成同步表達相關(guān) tRNA 編碼基因質(zhì)粒拷貝數(shù)：質(zhì)?？截悢?shù)對細菌生長代謝的影響 目前實驗室里廣泛使用的表達型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)

24、生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴增納入可控制的軌道外源基因在大腸桿菌中的表達：目標蛋白在細胞質(zhì)中表達的主要優(yōu)點是： 表達質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單； 能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細胞總蛋白的20%40%。 目標蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達的形式有二種： 在細胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒（存在于大腸桿菌細胞質(zhì)） 在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)（存在于細胞質(zhì)中外，還可分泌到周質(zhì)空間）包涵體型異源蛋

25、白的表達：包涵體及其性質(zhì) 在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）由高效表達質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內(nèi)。包涵體表達形式的優(yōu)點 在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能夠避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來能夠表達

26、對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標蛋白包涵體表達形式的缺點 以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標蛋白 經(jīng)過復(fù)性處理的目標蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白蛋 復(fù)性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。分泌型異源蛋白的表達在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 目標蛋白以可溶性蛋白質(zhì)形式表達雖然可以避免包涵體復(fù)性帶來的問題，但是也有一定的缺陷，主要表現(xiàn)為大腸桿菌本身存在于細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)往往只含有少量的，甚至沒有半胱氨酸殘基。富含半胱氨酸殘基，需要形成二硫鍵的蛋白質(zhì)大部份被轉(zhuǎn)運到

27、細胞的其他部位。這是因為大腸桿菌細胞質(zhì)微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢不利于蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系。一些需要通過二硫鍵的形成來維持其構(gòu)象的目標蛋白在大腸桿菌的細胞質(zhì)中往往不能正確折疊。 解決這一問題的途徑之一是用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因 trxB 缺陷株作為宿主菌表達目標蛋白。研究表明trxB 缺陷株細胞質(zhì)的氧化還原態(tài)勢發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)在 trxB 缺陷株的細胞質(zhì)中能夠形成二硫鍵。這一菌株對于表達結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)而言是一·個相當(dāng)重要的工具。在細胞質(zhì)中直接表達不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì) 在細胞質(zhì)中直接表達不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)需要起始密碼，通常為編碼甲硫氨

28、酸的ATG。 在多數(shù)情況下，N端附加的甲硫氨酸對蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒有特別的影響，但是也有附加的甲硫氨酸嚴重影響蛋白質(zhì)生物學(xué)活力的報道。 另外，附加的甲硫氨酸也可能改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì)。從制備用于醫(yī)療目的的蛋白質(zhì)的角度來看，這是一個需要引起重視的問題。去除附加的甲硫氨酸有二種方法： 在表達系統(tǒng)中共表達甲硫氨酸氨肽酶基因。 在分離純化后在體外用外肽酶處理。 但它們都對與甲硫氨酸相鄰的氨基酸殘基類型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。目標蛋白與有親合配基的序列融合表達 與純化包涵體相比，細胞質(zhì)中以可溶性形式表達蛋白質(zhì)的分離純化過程比較復(fù)雜，一般要通過親合層析才能達到比較高的純度。 目標蛋白與

29、有親合配基的序列融合表達既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標蛋白。 金黃色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白，His-tag 等是目前常用的與目標基因融合表達的序列。目標蛋白在周質(zhì)空間中表達目標蛋白在周質(zhì)空間中表達的優(yōu)點 大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的數(shù)量約為 100 種，只占菌體總蛋白數(shù)量的4%。蛋白水解酶的含量與在細胞質(zhì)中相比也少得多，因此目標蛋白在周質(zhì)空間中表達有利于分離純化和減少蛋白水解酶的降解。 目標蛋白從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)空間過程中信號肽被加工切除，有效地避免了N 端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。 周質(zhì)

30、空間中呈氧化型的氧化還原態(tài)勢使目標蛋白能夠較好折疊，維持正確的構(gòu)象。高效表達目標基因的戰(zhàn)略和技術(shù)：表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計共表達大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因提高目標基因 mRNA 和目標基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞表達質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計： 在各種表達載體中，啟動子和 SD序列的下游都設(shè)計了一段含有各種限制性酶切位點的序列，用于目標基因的插入。這一插入位點附近的序列將成為核糖體結(jié)合位點的一部分，因此它對于構(gòu)建高效表達質(zhì)粒是至關(guān)重要的。 由于每一個基因都具有各自獨特的 5 端結(jié)構(gòu)，最終構(gòu)建成的各種表達質(zhì)粒所具有的核糖體結(jié)合位點是一個變量。構(gòu)建表達質(zhì)粒時首先要考慮使目標基因的翻譯起始密

31、碼 ATG 與 SD 序列之間的距離和堿基組成處于一個適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。 核糖體結(jié)合位點序列的變化對 mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為： SD 序列 UAAGGAGG 的翻譯效率要比 AAGGA 高36倍翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是 68 個堿基長度，與 AAGAA 的最適距離是57 個堿基長度 ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3 4個堿基，與 AAGAA 至少相隔 5 個堿基； mRNA 的翻譯才能進行ATG 與 SD 序列之間的堿基組成為 A，T 堿基豐富時，mRNA 翻譯效率較高。共表達大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 表達水平高的基因呈現(xiàn)的密碼

32、子偏愛性高于表達水平低的基因。共表達大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因由于同義密碼子的使用頻率與細胞內(nèi)對應(yīng)的 tRNA 的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對應(yīng)的 tRNA 的豐度很低，有可能在翻譯過程中發(fā)生中止和移碼突變。 解決這一問題的辦法： 通過基因突變把稀有密碼子改變?yōu)槠渌褂妙l率高的同義密碼子。在表達系統(tǒng)中共表達稀有密碼子 tRNA 基因，以提高大腸桿菌細胞內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度提高目標基因 mRNA 和目標基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性 由于大腸桿菌防御體系的自身保護作用，大腸桿菌中的核酸酶和蛋白水解酶能夠降解目標基因 mRNA 和目標基因產(chǎn)物，這種降解作用程度對不同的基因或蛋白質(zhì)而言是不同的，具

33、有一定的專一性和選擇性。蛋白水解酶的特點 細胞質(zhì)是蛋白水解酶含量最多的區(qū)域，目標蛋白在細胞質(zhì)中最容易受到蛋白水解酶的作用。通過對已知大腸桿菌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的半衰期進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn) N末端為Arg 、 Lys 、 Leu 、 Phe 、 Tyr 、 Trp 殘基的蛋白質(zhì)，含有Pro、Glu 、Ser 、Thr 豐富區(qū)的蛋白質(zhì)容易降解，穩(wěn)定性較 差在細胞內(nèi)有多肽碎片、突變的異常蛋白和外界物理因素的刺激的條件下，大腸桿菌細胞內(nèi)的蛋白水解酶活力往往能達到比較高的水平。提高目標蛋白的穩(wěn)定性的措施主要有： 利用蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)把目標蛋白最終累積在周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)基中 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株

34、作為宿主菌。 對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯(lián)聚合表達。 共表達能提高特定目標蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因。 對蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造。 在較低的溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。大腸桿菌對分子量較大的目標蛋白的較運和分泌效率一般比較低，不能滿足大規(guī)饃制備的需要。 蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛，生長速率慢，使高密度發(fā)酵比較困難。 融合表達使目標蛋白的構(gòu)象與天然狀態(tài)不一樣，導(dǎo)致生物比活力降低，甚至沒有活性。 融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)的方法切割出單體目標蛋白。酶法成本比較高且加入的酶蛋白還必須分離去除。化學(xué)法比酶法成本低，但不少裂解試劑有

35、毒性。 對蛋白質(zhì)序列進行改造需要有基本的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，而目前這方面的數(shù)據(jù)庫還不完整。高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞 大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過程中不可缺少的工藝步驟。其目的是在單個菌體對目標基因的表達水平基本不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的成倍增加來實現(xiàn)總表達量的提高。 目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌： 高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長密度較高，培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低，氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長速率降低和乙酸的累積，乙酸的存在對目標基因的高效表達有明顯的阻抑作用。這是高密度發(fā)酵工藝研究中最迫切需要解決的問題。 雖然

36、在發(fā)酵過程中可采取通氧氣，提高攪拌速度，控制補料速度等措施來控制溶氧飽和度，減少乙酸的產(chǎn)生。但從實際應(yīng)用上看，這些措施都有一定的滯后效應(yīng)，難以做到比較精確的控制。因此構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌，是從恨本上解決問題的途徑之一。利用透明顫菌血紅蛋白能提高大腸桿菌在貧氧條件下對氧的利用率的生物學(xué)性質(zhì)，把透明顫菌血紅蛋白基因 vgb 導(dǎo)入大腸桿菌細胞內(nèi)以增加其對溶氧的寬容度。從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值。 用基因敲除技術(shù)缺失大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使從丙酮酸到乙酸的合成途徑被阻斷。 改變代謝流的方向，通過共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌、釀酒酵母的乙酰乳酸合成

37、酶基因 alsS，單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大腸桿菌，使丙酮酸的代謝有選擇地向生成3-羥基丁酮或乙醇的方向進行。對于以可溶性或分泌形式表達的目標蛋日而言，隨著發(fā)酵后期各種蛋白水解酶的累積，目標蛋白會遭到蛋白水解酶的作用而被降解。為了使對蛋白水解酶比較敏感的目標蛋白也能獲得較高水平的表達，需要構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌。 rpoH 基因編碼大腸桿菌 RNA 聚合酶的 r32 亞基， r32 亞基對大腸桿菌中多種蛋白水解酶的活力有正調(diào)控作用。 rpoH 基因缺陷的突變株己經(jīng)被構(gòu)建，研究結(jié)果表明它能明顯提高目標基因的表達水平。到目前為止，已知的大腸桿

38、菌蛋白水解酶基因缺陷的突變株都巳被獲得，其中一部分具有實際應(yīng)用的潛力。甲醇酵母表達系統(tǒng)：甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作單一碳源的一類酵母。畢赤酵母（Pichia pastoris)漢森酵母（Hansenula ploymorpha)假絲酵母（Candia boidinii) 甲醇氧化酶：A、甲醇代謝關(guān)鍵酶，占可溶蛋白的30%以上。B、名稱和拷貝數(shù)不同畢赤酵母/假絲酵母 漢森酵母 醇氧化酶 甲醇氧化酶alcohol oxidase, AOX methanol oxidase, MOXAOX1、AOX2 MOX 甲醇氧化酶啟動子A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強的真核啟動

39、子B、嚴謹調(diào)控型啟動子AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo)。MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo) 甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點A、表達水平高（最高水平的系統(tǒng)）B、產(chǎn)物可翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、酰脂化C、過糖基化程度比釀酒酵母少（8-15個vs100-150個甘露糖）D、產(chǎn)物可正確折疊和高效分泌（最高分泌表達系統(tǒng)）E、可利用簡單無機鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵，生物量大。F、實驗室和工業(yè)操作簡單G、不能滿足結(jié)構(gòu)要求嚴格的糖基化甲醇酵母表達系統(tǒng)操作原理：宿主株與標記基因、甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件、胞內(nèi)表達與分泌表達甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件：YRp型載體：漢森系統(tǒng) 傳代不穩(wěn)定，傳代過程同源或非同源重組，高選

40、擇壓力迫使高拷貝數(shù)整合，可達100拷貝。YIp型載體：A、在靶序列處線性化載體DNA，誘導(dǎo)同源重組B、有“插入”和“取代”二類整合模式C、主要為單拷貝整合，1-10%為多拷貝整合 甲醇酵母系統(tǒng)高效表達影響因素與對策：1、載體穩(wěn)定性同拷貝數(shù)時，整合型的比自主復(fù)制型的表達水平高YRp型載體的穩(wěn)定化：選擇非選擇培養(yǎng)交替數(shù)十代可得穩(wěn)定的整合子，但費時，整合位點不確定。采用YIp型載體: 更易實現(xiàn)整合、整合位點清楚2、基因劑量外源基因表達存在基因劑量效應(yīng)3、篩選多拷貝整合子1. 載體引入G418/Zeocin抗性標記，整合子拷貝數(shù)與抗性成正相關(guān)，采用高G418/Zeocin抗性轉(zhuǎn)化子。2. 體外串聯(lián)多個

41、表達盒，直接獲多拷貝整合子3. 采用YRp型載體穩(wěn)定化技術(shù)獲高拷貝整合子4. 構(gòu)建高拷貝整合型表達載體4、整合位點外源基因表達盒整合于AOX/MOX或標記基因處，均可高效表達畢赤酵母中個別情況整合于His4位點的比AOX1位點的低5、甲醇利用表型在分泌表達情況下，甲醇慢生長型更利于表達6、mRNA5端mRNA5端非翻譯區(qū)（UTR）的組成與長度應(yīng)盡量與AOX1/MOX的一致應(yīng)盡量避免在UTR區(qū)出現(xiàn)AUG和次級結(jié)構(gòu)7、AT含量分泌信號AT含量越高、越容易出現(xiàn)類似于終止子的結(jié)構(gòu)；分泌表達效率與所用分泌信號高度相關(guān)可采用釀酒酵母來源的MF、PHO或SUC等的信號肽，或野生型信號肽，但適用性要比較分析。

42、表達蛋白的檢測：酶活力測定、SDS-PAGE、Western blottingRNA技術(shù)RNA分子特征：A/U/C/G構(gòu)成，核糖的2¢ 位子為-OH，在堿性條件下不穩(wěn)定； 為單鏈分子，內(nèi)部易形成二級結(jié)構(gòu)，普通電泳不能顯示其真實大小，應(yīng)使用甲醛變性電泳檢測； 胞內(nèi)外存在有多量RNA酶，該酶極穩(wěn)定，RNA易受其降解。RNA處理：RNA酶無處不在： RNA酶穩(wěn)定性極高，僅SDS或苯酚不能使其完全失活；酶活性也不依賴于金屬離子，EDTA無作用；RNA酶熱穩(wěn)定好，煮沸不能失活。避免RNA酶降解：創(chuàng)造不利于酶活性發(fā)揮的環(huán)境！使用專用試劑、器械；使用專用環(huán)境/臺柜；使用RNA酶活抑制劑。常用RNA

43、酶活抑制劑：焦碳酸二乙酯(DEPC)：高活性的烷化劑，可不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA,用于滅活緩沖液和玻璃器皿中的RNA酶。分離和純化RNA過程不用。易揮發(fā)致癌，通風(fēng)櫥操作。酶的蛋白質(zhì)抑制劑(RNasiin)：從人胎盤組織分離的蛋白質(zhì)，分子量約50KD，單一多肽，可與多種RNA酶緊密結(jié)合形成非共價等摩爾復(fù)合物使其失活。使用時至少需要1mM DTT存在才有抑制活性，最適pH5-8。常-20 °C保存于5mM DTT的50%甘油中。不同公司產(chǎn)品商品名不同，易變性失活。氧釩核糖核苷復(fù)合物(VRC)：與多種RNA酶活性位點結(jié)合，幾乎全部抑制酶活性。不能共價修飾RNA酶，故在提取純化RNA的全

44、過程都需添加，濃度10mM。器皿和試劑的處理：干熱滅菌：玻璃、金屬及耐熱品，用RNA酶去除劑洗滌后鋁箔包裹，180-200 °C 4小時以上；濕熱滅菌：一次性塑料品等，滅1-2小時；無菌水也用此法滅，盛水器皿先干熱滅菌； DEPC處理水：用滅菌水配成0.1%濃度，室溫或37 °C 12h處理，后打開瓶口，高溫高壓20min滅菌處理2次；RNA酶去除劑：玻璃、塑料品用2% Absolve（Dupout公司）浸泡過夜，再無菌水漂洗、干燥。RNA質(zhì)量檢測：吸光度檢測：A260/A280在1.8-2.0范圍內(nèi)；電泳檢測：28S和18S條帶清晰，兩者亮度比值在2倍以上；保溫檢測：70

45、 °C保溫1h，電泳檢測沒有新降解RNA制備（一）AGPC法（acid-guanidine-phenol-chloroform）：原理：核酸在酸性水溶液中親水性低，酸性酚抽提時，DNA溶于酚相，RNA溶于水相，據(jù)此用于少量RNA制備。RNA制備（二）NP-40法（Nonidet P-40）：原理：細胞置于低滲壓下，吸水膨脹處于易裂解狀態(tài)，用表面活性劑(乙基苯基聚乙二醇)可提出胞質(zhì)RNA。適用于RNA少量制備，不易被RNA酶降解，也不易被基因組DNA污染。RNA制備（三）試劑盒法：QIAGEN Co. RNeasy 試劑盒RNA純化：前述提取的RNA為總RNA，rRNA占80-85%,

46、 tRNA占10-20%, mRNA僅2-5%，甚至更少;真核生物mRNA在被轉(zhuǎn)錄時，其3¢-端總是被添加一些腺苷酸，形成聚腺苷酸尾，而rRNA與tRNA不具有Poly(A)尾。oligo(T) 磁珠法：poly(A) 與poly(U) 或poly(T)能退火配對，將后者固定，可用于吸附純化poly(A) +mRNA。oligo(dT)×纖維素法純化poly(A)+ mRNA復(fù)習(xí)思考題1. 有哪些RNA提取方法？其主要原理是什么？RNA提取過程中如何防止RNase污染？2. 如何進行RNA的電泳檢測？如何通過電泳圖譜判定RNA質(zhì)量？3. 簡述純化poly(A)+RNA的基本

47、原理？4. 為何要純化poly(A)+RNA？操作過程中需要注意哪些問題？1 cDNA文庫 通過一系列酶催化使總poly(A) mRNA制劑轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體，并重組于適當(dāng)?shù)妮d體分子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞，便構(gòu)成了包含所有基因編碼序列的cDNA文庫。2 cDNA克隆法 運用cDNA文庫技術(shù)，以mRNA為模板合成雙鏈DNA，并對真核生物基因進行克隆的技術(shù)。3 cDNA文庫構(gòu)建 （1）細胞總RNA的制備及mRNA的純化 是進行cDNA文庫構(gòu)建的第一步。從供體細胞制備總RNA相對容易，但總RNA中含有大量的tRNA和rRNA，mRNA含量相對較少(一般占2-5%)，文庫構(gòu)建時一般需用純化的mRNA分

48、子。mRNA純化方法：真核基因mRNA分子的3-末端都有一段poly(A)尾巴，可用一段偶聯(lián)于惰性物質(zhì)(纖維素/瓊脂糖)的寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸oligo (dT)通過吸附層析進行純化。 純化程序： 制備oligo(dT)×纖維素層析柱，使總RNA流過纖維素柱，mRNA的Poly(A)尾巴與oligo(dT)序列雜交而吸附于柱上，rRNA和tRNA流過柱子，用100mM NaCl充分洗脫rRNA和tRNA分子，再用10mM Tris/1mM EDTA洗下含有目的mRNA的部分。2）合成第一鏈cDNA 通常有兩種方法： 一種是oligo(dT)引導(dǎo)法； 另一為隨機引物引導(dǎo)法 (rand

49、omly primed cDNA synthesis) 目前普遍采用后一方法。 oligo(dT)引導(dǎo)法: 利用真核生物mRNA分子具有poly(A)尾巴的特性，先用12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，與上述制備的mRNA分子混合(雜交)，并以其作為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，以mRNA分子為模板合成cDNA第一鏈。 該反應(yīng)產(chǎn)物為DNA/RNA雜交分子，此法有一定局限性，即：對于大分子的mRNA第一鏈cDNA合成效率低。因為這種方法進行cDNA合成時，必須從3-末端開始，而逆轉(zhuǎn)錄酶較難有效到達長的mRNA分子的5-末端。隨機引物引導(dǎo)cDNA合成法 能克服上述方法不足。 使用

50、根據(jù)許多可能序列合成的寡聚核苷酸片段混合物(6-10 bp)，作為合成第一鏈的引物，cDNA的合成可從mRNA模板的許多位點同時進行，對于長的mRNA分子也比較有效。 （3）雙鏈cDNA分子的生成 從mRNA/DNA雜交分子合成雙鏈cDNA分子也有多種方法： 自我引導(dǎo)法 RNaseH 酶解取代法，等， 其中自我引導(dǎo)法是最經(jīng)典方法，現(xiàn)仍常用。自我引導(dǎo)法實驗程序：先用堿處理，將mRNA模板水解，使第一鏈cDNA游離出來，并在其末端自發(fā)形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu) (hairpin loop)；再以此結(jié)構(gòu)為引物，引導(dǎo)cDNA第二鏈合成，產(chǎn)生含有一個完整發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈cDNA；之后用S1 核酸酶切割處理，去除單鏈

51、部分，得到雙鏈的cDNA分子。但該方法受S1核酸酶純度影響，往往會使得到的雙鏈 cDNA丟失原有mRNA 的5-端的許多序列，目前已被下述方法所取代。 RNaseH 酶解取代法 RNaseH 酶能識別 mRNA/DNA中的mRNA組分，并將其降解成許多短碎片，這些片段仍能與第一鏈cDNA分子雜交，故可作為DNA聚合酶 I 活性的引物。因此，可利用原來的cDNA第一鏈合成第二鏈cDNA。當(dāng)然，此情況下合成的第二鏈 cDNA分子是處于間斷不連續(xù)的狀態(tài)(存在有許多切口)，但通過DNA連接酶連接后，即可轉(zhuǎn)化為連續(xù)完整的雙鏈cDNA分子。 RNaseH 降解取代法合成雙鏈cDNA，基本上不丟失從 mRN

52、A分子5-端開始的全部核苷酸序列。（4）全長cDNA合成的方法 oligo(dG)引導(dǎo)合成法在第一鏈cDNA分子未與mRNA模板分離前, 先在其3-端加上一段oligo(dC), 堿性蔗糖梯度離心處理，使mRNA分子發(fā)生水解，收回cDNA第一鏈，再以互補的oligo(dG)作引物，引導(dǎo)第二鏈cDNA合成，可避免發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)和使用S1核酸酶引起的克隆序列部分缺失。 載體引導(dǎo)合成法因第一鏈cDNA由參入到載體分子的oligo (dT)作引物引導(dǎo)合成而得名。 制備3-末端具有oligo(dT)質(zhì)粒引物, 進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈, 并在3-端生成oligo(dG)；降解mRNA，富集全長DNA分子，變性；另制備3-末端具有oligo(dC)質(zhì)粒DNA，變性后與前者混合退火，經(jīng)聚合酶作用后轉(zhuǎn)化 E.coli 細胞。 置換合成法是有效的全長cDNA合成法， 分三步： 第一步：制備質(zhì)粒引物(plasmid primer)和具有oligo(dG)尾巴的接頭DNA (adaptor DNA) 第二步：構(gòu)建質(zhì)粒cDNA重組體分子 第三步：去除mRNA分子，合成第二鏈cDNA （5）cDNA文庫生成 用載體(質(zhì)粒/噬菌體)將雙鏈cDNA重組，將重組體DNA轉(zhuǎn)入寄主細胞，獲得重組體細胞群體。 cDNA片段與載體DNA