猴頭菇多糖的提取與脫蛋白工藝生物技術及應用

1、【最新卓越管理方案您可自由編輯】（生物科技行業(yè)）猴頭菇多糖的提取與脫蛋白工藝生物技術及應用2020年5月多年的企業(yè)咨洵顧問屋儂,經過實戰(zhàn)驗證可以落地執(zhí)i亍的卓越管理方窠，值得您下我擁有江蘇農林職業(yè)技術學院畢業(yè)設計（論文）SNL/QR7.5.4-3猴頭菇多糖的提取與脫蛋白工藝專業(yè)生物技術及應用學生姓名沙媛媛班級06生物技術及應用（2）學號061401214指導教師謝春芹完成日期2009-6-5成績評議學號061401214姓名沙媛媛題目猴頭菇多糖的提取與脫蛋白工藝指導教師建議成績：評閱教師建議成績：答辯小組建議成績：院答辯委員會評閱意見及評定成績：答辯委員會主任簽字（蓋章）：年月日畢業(yè)設計（論文

2、）任務書姓名沙媛媛學號061401214班級06生物技術及用應（2）題目猴頭菇多糖的提取與脫蛋白工藝設討論我主要內容猴頭菇的重要作用猴頭菇多糖的結構和生物活性猴頭菇多糖的提?。崴岬姆椒ê筒襟E，實驗結果的討論）猴頭菇多糖白脫蛋白（sevag法除蛋白的方法步驟和實驗結果的分析討論）重點研究問題猴頭菇多糖的熱水浸提的方法和sevag法脫蛋白的方法。主要技術指標使用熱水浸提方法提取猴頭菇多糖更有效，使用sevag法脫蛋白方法更方便我們使用。其它要說明的廠問題猴頭菇多糖的提取量不高，脫蛋白不徹底，總的提取純化工藝流程復雜等。指導老師意見指導教師簽字：年月日指導教師意見對論文的簡短評價：1 .指出論

3、文存在的問題及錯誤2 .對創(chuàng)造性工作評價3 .建議成績優(yōu)良中及格不及格指導教師簽字年月日評閱教師意見對論文的簡短評價：1 .指出論文存在的問題及錯誤2 .對創(chuàng)造性工作評價3 .建議成績優(yōu)良中及格不及格評閱教師簽字年月日答辯小組評議意見學號061401214姓名沙媛媛題目猴頭菇多糖的提取與脫蛋白工藝答辯小組意見：1、對論文的評價2 .建議成績等級優(yōu)良中及格不及格3 .需要說明的問題答辯小組長簽字年月日7摘要：猴頭菇是藥用兼用菌而且具有很好的保健效果，采取熱水浸提和sevag法是提取和除蛋白的最優(yōu)工藝，多糖生物活性的作用和重要性，可作為藥用保健等工廠化生產，廣闊的前景。關鍵詞：作用；熱水浸提；se

4、vag法；生物活性；前景。Abstract:acombinationofmedicinalfungiHericiumisgoodhealthandhastheeffectofhotwaterextractionandsevagtakenisinadditiontoproteinextractionandtheoptimalprocess,theroleofbiologicallyactivepolysaccharidesandimportance,canbeusedasmedicinalhealth,suchasfactoryproduction,andbroadprospects.Keywo

5、rds:role;hotwaterextraction;sevaglaw;biologicalactivity;prospects.目錄1猴頭菇的作用介紹1-2猴頭菇多糖結構和生物活性12.1 猴頭菇多糖的結構1-2.2 猴頭菇多糖的生物活性13猴頭菇多糖的提取23.1 熱水浸提猴頭菇實驗的步驟和方法23.1.1 材料和設備23.1.2 實驗的原理23.1.3 熱水浸提操作步驟24猴頭菇多糖的分離純化34.1sevag法除蛋白的方法步驟45小結46參考文獻67致謝7猴頭菇多糖的提取與脫蛋白工藝猴頭菇又名猴頭菌、花菜菌等，屬擔子菌綱，齒菌科、多孔菌目。猴頭菇富含蛋白質、各種氨基酸、維生素B1、維

6、生素C、尼克酸等各種營養(yǎng)成分，同時它具有多種生物活性，所以它具有提高免疫力，提高機體耐氧力，提高心血輸出和加速血液循環(huán)等作用。還具有抗癌、抗衰老、增強免疫力、降低血糖、血脂等功效。其中猴頭菇的多糖作為一類重要的生物活性物質，在對一些人類疑難病癥的治療方面已顯示出很好的療效1。經過臨床使用表明它無毒副作用，所以一般它又可以用來制藥和做一些保健滋補品的生產，是人類良好的健康營養(yǎng)食品。對于猴頭菇多糖的這些重要功效人們已經逐漸開始重視，因此對于猴頭菇多糖的研究也不斷的加深，不斷的進步。本文對猴頭菇多糖的提取純化技術以及它的脫蛋白工藝進行探索性試驗。1猴頭菇多糖結構和活性1.1 猴頭菇多糖的結構經研究直

7、到現在為止，猴頭菇里含有十幾種多糖，絕大多數報道多糖中都含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖，猴頭菇也含有這三種多糖，其中以葡萄糖為主5。猴頭菇的多糖是最主要的活性部分，而且它是主要的治療成分，有重要的保健治療價值。目前的研究結果一致認為多糖的活性部分為B-(1-3)糖昔鍵連接的主鏈和伊(16)糖昔鍵連接的支鏈構成的葡聚糖。1.2 猴頭菇多糖的活性猴頭菇的多糖是重要的生物活性物質，因為它具有重要的生物學功能，所以猴頭菇的多糖受到越來越多的重視，也就促進學者進一步深入研究。猴頭菇的多糖有抗月中瘤、提高免疫力、抗突變、抗衰老的作用，而且能夠降低血糖活性。猴頭菇多糖是一個免疫增強劑，因而可用于抗月中瘤治療中。

8、猴頭菇多糖可促進IL22分泌和IL22受體表達。在體內注入一定劑量的猴頭菇多糖，可增強LAK細胞對月中瘤細胞的殺傷活性，并增加IL22誘導的淋巴細胞的增殖。另外不同劑量藥物對LAK活性誘導有不同的影響，而且是在一定劑量下才有得作用，這說明猴頭菇多糖是一種免疫調節(jié)劑。在體內注入一定劑量的猴頭菇多糖可增加LAK細胞的活性，提高LAK細胞抗月中瘤療效，這在LAK細胞臨床應用方面非常有意義6。我們都了解自由基能引起細胞衰老與死亡，而眾多真菌和中藥的多糖研究表明，多糖能增強免疫功能，清除自由基而達到抗衰老的作用。相關研究表明猴頭多糖可增加小鼠江蘇農林職業(yè)技術學院論文（設計）腦和肝臟中SOD活力，明顯降低

9、果蠅和小鼠心肌脂褐質含量，增強果蠅飛翔能力,具有抗衰老、抗疲勞作用。所以猴頭菇的多糖對于我們有良好的作用，也將會在我們的生活中占有重要的地位。2猴頭菇多糖的提取生物分離一般包括原料的選取、預處理、細胞破碎、固液分離、初步純化（分離）、精制（高度純化）和成品加工等過程2。猴頭菇多糖主要可以從它的子實體、菌絲體以及菌絲發(fā)酵液中提取。據相關研究表明，猴頭菇子實體的多糖提取率和多糖的含量比菌絲體要多網。它的提取方法也有很多種，如熱水提取、堿提取、酸提取和鹽提取等方法。一般猴頭菇的提取多采取熱水提取的方法，因為在酸、堿法的提取過程中，容易使多糖發(fā)生糖甘鍵的斷裂，而且部分多糖會發(fā)生水解而造成多糖提取量的下

10、降，雜質較多。但這些情況在熱水提醇沉法中就比較少3,因此此次實驗采取熱水浸提方法。2.1 熱水浸提猴頭菇實驗的步驟和方法2.1.1 材料和設備干猴頭菇子實體（鮮猴頭菇剪去菌柄，放于烤篩上，用40-50C溫度烘至六、七成干，再升溫到60C,烘烤至含水量12%以下就可以了）11、胰蛋白酶：（酶活:2500U/g）、碘液、糖化酶，乙醇、硫酸、葡萄糖等。離心機，紫外可見分光光度，電子天平，燒杯等。2.1.2 實驗的原理利用葡萄糖標準曲線，根據單因素的實驗方法，改變水的倍數、提取的時間和乙醇的濃度，從實驗結果得出提取猴頭菇多糖的最優(yōu)工藝。2.1.3 熱水浸提操作步驟2.1.3.1 稱取6.0g猴頭菇倒入

11、圓底燒瓶中，加入表一中對應的蒸儲水的倍數搖勻，置于恒溫水浴鍋內，按表二中對應的時間浸提。浸提后將混合物進行抽濾，將濾液放入旋轉蒸發(fā)儀中蒸儲濃縮至20mL左右。濃縮液轉入小錐形瓶中，加入下表三中對應濃度的乙醇（20倍于濃縮液）進行醇析24h使其完全沉淀。再將混合物以3500r/min的轉速離心得多糖粗品。2.1.3.2 多糖粗品轉入小燒杯并加蒸儲水20mL使其溶解在90C下水浴30min將多糖糊化，降溫至60C,用糖化酶0.005g處理10min，用碘液檢驗至碘液不變色1002.1.3.3 稱取0.0012g胰蛋白酶，在常溫下處理50min,在280nm下紫外檢測無明顯吸收峰，說明蛋白質已經除盡

12、。#2.1.3.4 把透析袋放入大燒杯中煮沸10min,待其完全分離后撈出待用。將處理液裝入已用線綁好一端的透析袋，然后在離液面23cm處綁好另一端并進行流動透。透析24h,直至透析袋中的溶液從淡黃色變?yōu)闊o色。2.1.3.5 在透析后的多糖溶液中加入40mL無水乙醇放置24h沉淀。將沉淀后的混合物離心，沉淀轉入小燒杯中（記錄燒杯的重量），在40c下真空干燥。完全干燥后再次稱重，前后的質量差即為提取的粗多糖的量。2.1.3.6 猴頭菇的多糖根據加水倍數、浸提時間和乙醇濃度的不同提取量也不同：表1浸提時間和乙醇濃度相同情況下，加水倍數對多糖提取量的影響瓶號1234加水的倍數5101520浸提時間/

13、h2222乙醇濃度%100100100100表2加水倍數和乙醇濃度相同情況下，浸提時間對多糖提取量的影響瓶號abcd加水的倍數20202020浸提時間/h2468乙醇濃度%100100100100表3加水倍數和浸提時間相同情況下，乙醇濃度對多糖提取量的影響瓶號ABCD加水的倍數20202020浸提時間/h2222乙醇濃度%708090100從以上三個表中可以看出：加水倍數從5倍體積到15倍體積水的過程中，猴頭菇多糖提取率有明顯的提高。從15倍體積到20倍體積水的過程中，多糖提取率的提高雖然沒有前面的明顯，但是也有較大提高；浸提時間從2h到6h,提取率有明顯的提高，6h后提取率變化很微小；乙醇的

14、濃度從60%90%中猴頭菇的多糖提取率都有明顯的增長，但90%以后趨勢變得比較平緩，說明90%的乙醇濃度已經能夠把多糖完全沉淀下來。根據以上結果表明猴頭菇子實體的多糖提取的最優(yōu)條件分別為浸提6h,加水20倍，90%濃度的乙醇。據相關研究表明，在熱水抽提的過程中加入一定量的Nacl、Na2CO3等均可以提高多糖的所得量9。3猴頭菇多糖的分離純化猴頭菇提取的多糖多為粗多糖，要想它發(fā)揮重要作用還需要進一步的純化。猴頭菌屬真菌多糖的分離純化，它的過程包括分離、純化和純度鑒定這幾個關鍵江蘇農林職業(yè)技術學院論文（設計）步驟。它的粗提物中混有蛋白質、低聚糖、色素等雜質需要除去。低聚糖等小分子雜質可通過透析法

15、除去，除色素一般采用活性炭或DEAE一纖維素法脫色50其中除蛋白是關鍵的一步，主要有sevag法和TCA法除蛋白等。一般實驗室多采取sevag法除蛋白，這種方法是經典的脫蛋白方法。3.1sevag法除蛋白的方法步驟步驟：配制質量濃度為1%的粗多糖溶液，向粗多糖溶液中加入該溶液1/4體積的sevag試劑（V氯仿：V正丁醇=4：1）,振搖20min后靜置30min,然后離心除去沉淀，測定上精液中多糖和蛋白質的含量（以濃度計）。上精液重復以上脫蛋白步驟，直至離心無沉淀產生，如表4。表4sevag法脫蛋白的實驗數據次數12345蛋白脫除率11%14.5%18.5%9%5%多糖損失率4.3%3.7%4.

16、1%4.5%3.9%實驗結果表明隨著sevag法脫蛋白次數的增加，糖液中蛋白質總的脫除率逐漸增加，但經過3次脫蛋白處理之后增加趨勢越來越弱。再進行了5次脫蛋白處理后，蛋白質總的脫除率為58%。隨著脫蛋白質次數的增加，糖液中多糖的損失也不斷的增加，5次脫蛋白處理后糖液中多糖損失率達20.5%o因此雖然sevag法是常用方法，但此方法中有機溶劑消耗大，費時而且蛋白的脫除率低，并且多次脫蛋白容易造成多糖的損失變大，所以sevag法對于猴頭菇多糖脫蛋白的效果并不理想。TCA法脫蛋白時的反應比較劇烈，猴頭菇多糖的脫蛋白受TCA濃度的影響。當TCA法的濃度過高時會引起多糖結構的破壞，產生不好的結果。而當T

17、CA的用量為0.1%時，只需要一次脫蛋白就可以把蛋白去除80%以上了。所以只要把握好TCA的濃度就可以有效的去除蛋白了。還有一種需要蛋白酶的除蛋白的方法，不過此方法多不被采用，因為蛋白酶水解除蛋白時蛋白對酶有較高的專一性要求，而找到完全適合的蛋白酶比較困難4。雖然三種方法都不理想，但我們可以根據自己的需要和現存的條件采取不同的方法。4小結猴頭菇多糖的提取方法具有很多種，但它們存在缺點也很多種。如在酸提取多糖時選用三氯乙酸，這種方法多不被采用，因為它的提取率不高比較浪費。鹽提取多糖在氯化鈉不同濃度下的效果也不同，當氯化鈉的濃度超過最適濃度時多糖的提取量反倒下降，因為有一部分多糖會結合蛋白從而發(fā)生

18、鹽析現象，所以我們一般也不采用這種方法。根據吳金龍等人的實驗，用蒸儲水、叫草酸按溶液、#氫氧化鈉溶液三種提取劑分別提取猴頭粗多糖，并用蔥酮比色定搪法測定多糖含量結果表明，氫氧化鈉溶液提取的粗多糖量最高，因此它其中的多糖含量也是最高7。從研究了料液比、乙醇濃度、時間對多糖提取率實驗結果顯示：乙醇濃度和料液比是影響多糖提取率的主要因素，最佳工藝為料液比1:20，乙醇濃度為95%,浸提時間4h,此時猴頭菇多糖提取率為7.29%9。在研究猴頭菇的多糖提取方法方面，我們可以嘗試新的提取工藝，如超聲波輔助萃取、微波輔助萃取、超臨界萃取、超濾以及膜分離等。根據張樹海的研究表明聯合采用熱水浸提和超聲波處理的方

19、法可以提高猴頭菇多糖的提取率。在90C、加水20倍、pH=7.5、浸提8h、超聲波處理50s的條件下浸提率最高10。猴頭菇的分離純化方法有很多種，比如離心分離，萃取分離，層析分離，膜分離和沉淀分離等。它們主要是依據離心力、分子大小、濃度差、壓力差、吸附作用、親和作用、疏水作用和溶解度等原理對原料或產物進行分離純化。不同的分離對象需要不同的分離方法才能有效的被分離2o因為猴頭菇多糖內是含有像蛋白質這樣的生物大分子物質較多，所以猴頭菇的多糖分離純化主要采用乙醇分級、柱層析等方法。目前多糖分離最廣泛利用的方法是超濾法，但對于猴頭菇的多糖分離研究中還沒人提到用此方法。猴頭菇多糖的純度鑒定方法有比旋度法

20、、超離心法、高壓電泳法及凝膠過濾法等，一般我們得需要2種以上的方法才能確定其均一性5。同時多糖的提取率會隨著菌種、生長條件、提取的部位、提取工藝的不同而不同。其中子實體的多糖含量是菌絲體的三倍，而且影響多糖含量的因素也有很多3。又因為猴頭菇多糖的生產適合工廠化生產，所以在工藝方面我們就得要求更高，盡量減少多糖的損失。而現在猴頭菇多糖的研究中存在的主要問題就是傳統(tǒng)提取工藝提取率低，耗時久等。因此未來我們的研究就要求要更深入，往更精細得方面發(fā)展。參考文獻1朱美靜，童群義.猴頭多糖脫蛋白方法的研究.江南大學食品學院，江蘇無錫214036.2005.04.04。2楊昌鵬，張愛華.生物分離純化.中國農業(yè)出版社，2007.6。3樊偉偉，黃惠華.猴頭菇多糖研究進展華南理工大學車5工與食品學院，廣東廣州510640。食品科學，2008,Vol29No.01355。4于宙、鐘潔和吳克.猴頭多糖的提取和分析.1）合肥聯合大學，合肥230022;2）安徽省水產學校