2022年免疫細胞功能檢測技術(shù)概述

1、免疫細胞免疫細胞(xbo)(xbo)功能檢測技術(shù)功能檢測技術(shù)第一頁，共四十三頁。一一 淋巴細胞的功能淋巴細胞的功能(gngnng)(gngnng)檢測檢測 淋巴細胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗。淋巴細胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗。體內(nèi)實驗主要是間接了解體內(nèi)實驗主要是間接了解(lioji)(lioji)淋巴細胞對抗原、淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應答反應；體外實驗主要包半抗原或有絲分裂原的應答反應；體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應、括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定 第

2、二頁，共四十三頁。淋巴細胞淋巴細胞T T細胞細胞(xbo)(xbo)（負責細胞（負責細胞(xbo)(xbo)免疫功能）免疫功能）B B細胞（執(zhí)行體液免疫功能）細胞（執(zhí)行體液免疫功能）NKNK細胞（非特異性免疫作用）細胞（非特異性免疫作用） 第三頁，共四十三頁。一、一、T細胞細胞(xbo)功能的檢測功能的檢測T T細胞增殖細胞增殖(zngzh)(zngzh)試驗試驗T T細胞分泌功能測定細胞分泌功能測定T T細胞介導的細胞毒試細胞介導的細胞毒試驗驗體內(nèi)試驗體內(nèi)試驗第四頁，共四十三頁。（一）（一）T T淋巴細胞增殖淋巴細胞增殖(zngzh)(zngzh)試驗試驗1. 1. 原理原理(yunl)(y

3、unl)：淋巴細胞DNA合成(hchng)分化母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松第五頁，共四十三頁。 未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞淋巴母細胞 過渡型細胞大小(直徑m)1220121668核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、14個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無第六頁，共四十三頁。2. 2. 淋巴細胞轉(zhuǎn)化淋巴細胞轉(zhuǎn)化(zhunhu)(zhunhu)的刺激物的刺激物非特異性刺激物：非特異性刺激物： PHA -TPHA -T細胞細胞 ConA -TCon

4、A -T細胞細胞 PWM -TPWM -T、 B B細細胞胞 LPS -BLPS -B細胞細胞特異性刺激物：特異性刺激物： 異種異種(y zhn)(y zhn)抗原抗原 同種組織抗原同種組織抗原 第七頁，共四十三頁。3. 3. 檢測檢測(jin c)(jin c)方法方法 形態(tài)法：刺激物 淋巴細胞（4-6天） 母細胞化 同位素法：PHA 淋巴細胞（54h） DNA合成期 + 3HTdR摻入 收集細胞(xbo) 檢測射線 測定(cdng)細胞內(nèi)的3HTdR第八頁，共四十三頁。（1 1）形態(tài)學檢查法）形態(tài)學檢查法%100胞數(shù)轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的淋巴細轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)轉(zhuǎn)化率第九頁，共四十三頁。方法學評價方

5、法學評價(pngji)(pngji)：優(yōu)點：形態(tài)學方法簡便易行，優(yōu)點：形態(tài)學方法簡便易行，普通光學顯微鏡便能觀察普通光學顯微鏡便能觀察(gunch)(gunch)結(jié)結(jié)果，適于基層實驗室應用。果，適于基層實驗室應用。缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復性和準確性較差。響，重復性和準確性較差。 第十頁，共四十三頁。培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性（2）3H-TdR摻入法第十一頁，共四十三頁。優(yōu)點：優(yōu)點：3H-TdR3H-TdR摻入法敏感性高，客摻入法敏感性高，客觀性強，重復性好。觀性強，重復

6、性好。缺點：但需一定缺點：但需一定(ydng)(ydng)設備條件，同設備條件，同時還存在放射性核素污染問題。時還存在放射性核素污染問題。均值對照孔A均值試驗孔A570nm570nmSI 第十二頁，共四十三頁。培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性MTT測吸光度(gungd)(3) MTT 比色法第十三頁，共四十三頁。( (二二) T) T細胞分泌功能細胞分泌功能(gngnng)(gngnng)測定測定 體外培養(yǎng)的體外培養(yǎng)的T T細胞經(jīng)各種絲裂原或抗原細胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后刺激后, ,分泌各種細胞因子分泌各種細胞因子, ,可借助免疫學、可借助免疫學、細胞生物學及分子

7、生物學技術(shù)細胞生物學及分子生物學技術(shù)(jsh)(jsh)分別檢分別檢測細胞因子含量、生物學活性或基因表達測細胞因子含量、生物學活性或基因表達水平，以反映水平，以反映T T細胞功能。細胞功能。 第十四頁，共四十三頁。（三）（三）T T細胞細胞(xbo)(xbo)介導的細胞介導的細胞(xbo)(xbo)毒試驗毒試驗1.1.原理原理(yunl)(yunl)：靶細胞抗原(kngyun)T細胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細胞第十五頁，共四十三頁。形態(tài)學方法形態(tài)學方法(fngf)(fngf)：淋巴細胞：淋巴細胞+ +腫瘤細胞腫瘤細胞 計數(shù)計數(shù)殘留腫瘤細胞殘留腫瘤細胞2.2.方法方法(fngf)(fngf)意義

8、(yy)： 腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力 第十六頁，共四十三頁。圖15-2 T細胞細胞毒試驗示意圖第十七頁，共四十三頁。靶細胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應細胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時51Cr釋放(shfng)法第十八頁，共四十三頁。( (四四) ) 體內(nèi)體內(nèi)(t ni)(t ni)試驗試驗特異性抗原皮膚特異性抗原皮膚(p f)(p f)試試驗驗PHAPHA皮膚試驗皮膚試驗 第十九頁，共四十三頁。二、二、B細胞功能細胞功能(gngnng)檢測檢測B B細胞增殖能力的試驗細胞增殖能力的試驗(shyn)(shyn)溶血空斑試驗溶血空斑試驗B B細胞抗體形成功能的檢測細胞

9、抗體形成功能的檢測體內(nèi)試驗體內(nèi)試驗第二十頁，共四十三頁。( (一一)B)B細胞細胞(xbo)(xbo)增殖能力的試驗增殖能力的試驗抗抗IgMIgM細菌細菌(xjn)(xjn)脂多糖脂多糖SACSAC的的SPASPAB細胞(xbo)增殖形態(tài)學3HTdR摻入法第二十一頁，共四十三頁。( (二二) ) 溶血溶血(rn xu)(rn xu)空斑試驗空斑試驗1. 1. 原理原理(yunl)(yunl)：第二十二頁，共四十三頁。2. 2. 方法學：方法學：經(jīng)典經(jīng)典(jngdin)(jngdin)溶血空斑形成試驗溶血空斑形成試驗被動溶血空斑試驗被動溶血空斑試驗 第二十三頁，共四十三頁。3 3臨床應用臨床應用

10、(yngyng)(yngyng)與評價與評價溶血空斑試驗主要用于測定溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術(shù)等因素藥物和手術(shù)等因素(yn s)(yn s)對體液對體液免疫功能的影響免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后評價免疫治療或免疫重建后機體產(chǎn)生抗體的能力。機體產(chǎn)生抗體的能力。 第二十四頁，共四十三頁。( (三三) ) B B細胞細胞(xbo)(xbo)抗體形成功能的抗體形成功能的檢測檢測 酶聯(lián)免疫斑點法酶聯(lián)免疫斑點法ELISPOTELISPOT1.原理原理(yunl)(yunl)：第二十五頁，共四十三頁。2 2應用應用(yngyng)(yngyng)與方法學評價：與方法學評價：該方法既可檢測抗

11、體分泌該方法既可檢測抗體分泌(fnm)(fnm)細胞，細胞，又可檢測抗體分泌又可檢測抗體分泌(fnm)(fnm)量。量。優(yōu)點：優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。胞。第二十六頁，共四十三頁。( (四四) )體內(nèi)體內(nèi)(t ni)(t ni)試試驗驗體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原(kngyun)(kngyun)有白有白喉類毒素、破傷風類毒素、多價肺炎鏈喉類毒素、破傷風類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。球菌

12、菌苗等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后免疫前及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分別采血，周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應抗體分離血清，測定受檢者免疫前后相應抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)的效價，判斷受檢者體內(nèi)B B細胞的功能。細胞的功能。第二十七頁，共四十三頁。染色(rns)計數(shù)離心(lxn)取上清測LDH或AKP離心(lxn)取沉淀測活細胞熒光測發(fā)光強度測CPM值形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學發(fā)光法三、三、NK細胞活性測定細胞活性測定靶細胞溶解常用靶細胞: K562細胞株第二十八頁，共四十三頁。二二 吞噬細胞功能檢測吞噬細

13、胞功能檢測(jin c)(jin c)技術(shù)技術(shù) 按其形態(tài)大小分為兩類：按其形態(tài)大小分為兩類：大吞噬細胞大吞噬細胞(tn sh x bo)(tn sh x bo)單核單核- -吞噬細胞系統(tǒng)吞噬細胞系統(tǒng)小吞噬細胞小吞噬細胞中性粒細胞中性粒細胞第二十九頁，共四十三頁。一、中性粒細胞功能一、中性粒細胞功能(gngnng)的檢測的檢測 細胞趨化功能的檢測細胞趨化功能的檢測 吞噬吞噬(tnsh)(tnsh)和殺菌功能的檢測和殺菌功能的檢測第三十頁，共四十三頁。( (一一) ) 細胞運動功能細胞運動功能(gngnng)(gngnng)趨化功能檢趨化功能檢測測1.1.原理原理(yunl)(yunl)：第三十一

14、頁，共四十三頁。2. 2. 方法方法(fngf)(fngf)： 瓊脂糖平板瓊脂糖平板(pngbn)(pngbn)法法 濾膜滲透法（Boyden小室法）第三十二頁，共四十三頁。( (二二) )吞噬和殺菌吞噬和殺菌(sh jn)(sh jn)功能測定功能測定 1 1顯微鏡檢查法：顯微鏡檢查法：100(%)計數(shù)的白細胞數(shù)吞噬細菌的白細胞數(shù)吞噬率100(%)計數(shù)的白細胞數(shù)數(shù)胞內(nèi)含著染菌體的細胞殺菌率第三十三頁，共四十三頁。2. 2. 溶菌法溶菌法100min0min9060301(%)）菌落數(shù)菌落數(shù)或、作用（殺菌率第三十四頁，共四十三頁。NBTNBT還原還原(hun yun)(hun yun)試驗試驗

15、 原理(yunl)：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黃色）甲臜（紫黑色）3NBT還原(hun yun)試驗 第三十五頁，共四十三頁。中性(zhngxng)粒細胞NBT甲臜顆粒(kl)沉積于胞質(zhì)中第三十六頁，共四十三頁。二、巨噬細胞功能二、巨噬細胞功能(gngnng)檢測檢測( (一一) )炭粒廓清炭粒廓清(kuqng)(kuqng)試驗試驗 正常小鼠肝中枯否細胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細胞約吞噬清除10%炭粒。據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時間反復取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清(kuqng)的速度，判斷巨噬細胞的功能。第

16、三十七頁，共四十三頁。( (二二) )吞噬吞噬(tnsh)(tnsh)功能檢功能檢測測 巨噬細胞對顆粒性抗原巨噬細胞對顆粒性抗原(kngyun)(kngyun)物質(zhì)具有很強物質(zhì)具有很強的吞噬功能，常用雞紅細胞的吞噬功能，常用雞紅細胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠菌、白色念珠菌、酵母細胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人酵母細胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細胞。巨噬細胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細胞。 第三十八頁，共四十三頁。( (三三) )巨噬細胞溶酶體酶的測定巨噬細胞溶酶體酶的測定(cdng)(cdng)1 1酸性磷酸酶的測定酸性磷酸酶的測定 硝酸鉛法

17、硝酸鉛法 偶氮法偶氮法2 2非特異性酯酶的測定非特異性酯酶的測定 常用常用(chn yn)(chn yn)-萘醋酸萘醋酸法法第三十九頁，共四十三頁。( (四四) ) 細胞毒作用細胞毒作用(zuyng)(zuyng)測定測定 用用IFN-IFN-激活激活(j hu)(j hu)小鼠巨噬細胞，觀察其對小鼠巨噬細胞，觀察其對125125I-UdRI-UdR標記的標記的DBA/2DBA/2小鼠肥大細胞瘤小鼠肥大細胞瘤P815P815的殺的殺傷活性。傷活性。第四十頁，共四十三頁。( (五五) ) 巨噬細胞促凝血活性測定巨噬細胞促凝血活性測定(cdng)(cdng) 激活的巨噬細胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血激活的巨噬細胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子，加速正常血漿活性因子，加速正常血漿(xujing)(xujing)的凝固，為此取的凝固，為此取已經(jīng)已經(jīng)3737預溫的正常兔血漿和預溫的正常兔血漿和CaClCaCl2 2混合液，加混合液，加入經(jīng)粘附有單層巨噬細胞的試管中，移置入經(jīng)粘附有單層巨噬細胞的試管中，移置3737，