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文檔簡介

1、DNA通過復制將遺通過復制將遺傳信息由親代傳遞傳信息由親代傳遞給子代;通過轉錄給子代;通過轉錄和翻譯,將遺傳信和翻譯,將遺傳信息傳遞給蛋白質分息傳遞給蛋白質分子,從而決定生物子,從而決定生物的表現(xiàn)型。的表現(xiàn)型。DNA的的復制、轉錄和翻譯復制、轉錄和翻譯過程就構成了遺傳過程就構成了遺傳學的學的中心法則中心法則。DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis ( Replication )n本章主要內容:本章主要內容: 復制的基本規(guī)律復制的基本規(guī)律 DNA復制的酶學和拓撲學變化復制的酶學和拓撲學變化 復制的過程復制的過程 逆轉錄和其他復制方式逆轉錄和其他復制方式 DNA損傷(突變)與修

2、復損傷(突變)與修復復制復制(replication)(replication)是指遺傳物質的傳代,以母鏈是指遺傳物質的傳代,以母鏈DNADNA為模板為模板合成子鏈合成子鏈DNADNA的過程,將遺傳信息準確地從親的過程,將遺傳信息準確地從親代傳遞給子代。代傳遞給子代。復制復制親代親代DNA子代子代DNA復制的基本規(guī)律復制的基本規(guī)律Basic Rules of DNA Replicationn復制的基本規(guī)律復制的基本規(guī)律 n半保留復制半保留復制的概念的概念: :AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGAC

3、AGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈母鏈DNA復制過程中形成復制過程中形成的復制叉的復制叉子代子代DNAn子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 n密度梯度實驗密度梯度實驗: : 實驗結果支持實驗結果支持半保留復制半保留復制的設想。的設想。含重氮含重氮-DNA的細菌的細菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代梯度離心結果梯度離心結果按半保留復制

4、方式,子代按半保留復制方式,子代DNA與親代與親代DNA A的的堿基序列一致堿基序列一致,即子代保留了親代的全部遺,即子代保留了親代的全部遺傳信息,體現(xiàn)了遺傳的傳信息,體現(xiàn)了遺傳的保守性保守性。n半保留復制的意義半保留復制的意義: :遺傳的保守性,是物種穩(wěn)定性的分子基礎,遺傳的保守性,是物種穩(wěn)定性的分子基礎,但但不是絕對的不是絕對的。 DNA DNA分子中的遺傳信息通過轉錄和翻譯,即基因分子中的遺傳信息通過轉錄和翻譯,即基因表達,決定了細胞的蛋白質結構和功能,決定了生物的表達,決定了細胞的蛋白質結構和功能,決定了生物的特性和類型。體現(xiàn)了遺傳過程的相對保守性。特性和類型。體現(xiàn)了遺傳過程的相對保守

5、性。53oriorioriori53oriterA B C復制中的放射自顯影圖像復制中的放射自顯影圖像A. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點及復制起始點B. 復制中的兩個復制叉復制中的兩個復制叉C. 復制接近終止點復制接近終止點(termination, ter)oriterA B C53oriorioriori535533復制子復制子CCACTGGAGGTACTGTCCATGACGGTGACCCCACTGGAGGTACTGTCCATGACAGGTACTGGGTGACC三、三、DNA一股子鏈復制的方向與解鏈一股子鏈復制的方向與解鏈方向相反導致半不連續(xù)復制方向相反導致半不連續(xù)復制3 5 3 5

6、 解鏈方向解鏈方向3 5 3 3 5 領頭鏈領頭鏈(leading strand)隨從鏈隨從鏈(lagging strand) 順著解鏈方向生成的子鏈,復制是連續(xù)進行的,順著解鏈方向生成的子鏈,復制是連續(xù)進行的,這股鏈稱為這股鏈稱為領頭鏈領頭鏈(leading strand) 。 另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反,不另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反,不能順著解鏈方向連續(xù)延長,這股不連續(xù)復制的能順著解鏈方向連續(xù)延長,這股不連續(xù)復制的鏈稱為鏈稱為隨從鏈隨從鏈(lagging strand) 。 領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制,就是復領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制,就是復制的半不連續(xù)性。

7、制的半不連續(xù)性。 DNA復制的酶學和拓撲學變化復制的酶學和拓撲學變化第第 二二 節(jié)節(jié)The Enzymology and Topology of DNA Replicationn參與參與DNA復制的物質復制的物質: 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP; 聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶,聚合酶,簡寫為簡寫為 DNA-pol; 模板模板(template): 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈;母鏈; 引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次聚合;聚合; 其他的酶和蛋白質因

8、子。其他的酶和蛋白質因子。一、核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵一、核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復制的基本化學反應是復制的基本化學反應(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 活性:活性:1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除引物或突變的能切除引物或突變的 DNA片段。片段。能辨認錯配的堿基對,并將其水解。

9、能辨認錯配的堿基對,并將其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : (一)原核生物的(一)原核生物的DNA聚合酶分為三型聚合酶分為三型 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20?400分子數分子數/細胞細胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體?單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無

10、無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20?400分子數分子數/細胞細胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體?單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I DNA-pol (109kD):):AR共共18個個-螺旋肽段。螺旋肽段。323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實驗室合成片段是實驗室合成DNA,

11、進行,進行分子生物學研究中常用的工具酶。分子生物學研究中常用的工具酶。 功能:功能: 對復制中的錯誤進行校讀,對復制和修復對復制中的錯誤進行校讀,對復制和修復中出現(xiàn)的空隙進行填補。中出現(xiàn)的空隙進行填補。 DNA-pol (120kD) DNA-pol II基因發(fā)生突變,細菌依然能存活?;虬l(fā)生突變,細菌依然能存活。 DNA-pol 對模板的特異性不高,即使在已發(fā)生對模板的特異性不高,即使在已發(fā)生損傷的損傷的DNA模板上,它也能催化核苷酸聚合。因模板上,它也能催化核苷酸聚合。因此認為,它參與此認為,它參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復。損傷的應急狀態(tài)修復。n功能:功能: DNA-pol (250kD)

12、是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。(二)常見的真核細胞(二)常見的真核細胞DNA聚合酶有五種聚合酶有五種DNA-pol 起始引發(fā),有引物酶活性。起始引發(fā),有引物酶活性。延長子鏈的主要酶,有解螺旋酶活性。延長子鏈的主要酶,有解螺旋酶活性。參與低保真度的復制參與低保真度的復制 。在復制過程中起校讀、修復和填補缺在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用??诘淖饔?。在線粒體在線粒體DNA復制中起催化作用。復制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶填填補補引引物物空空隙隙,切切除除

13、修修復復,重重組組延延長長子子鏈鏈的的主主要要酶酶,解解螺螺旋旋酶酶活活性性線線粒粒體體DNA復復制制低低保保真真度度的的復復制制起起始始引引發(fā)發(fā),引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高?中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量(kD)DNA-pol填填補補引引物物空空隙隙,切切除除修修復復,重重組組延延長長子子鏈鏈的的主主要要酶酶,解解螺螺旋旋酶酶活活性性線線粒粒體體DNA復復制制低低保保真真度度的的復復制制起起始始引引發(fā)發(fā),引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高?中中5

14、 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量(kD)DNA-pol三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇功能是復制保真性的酶學依據功能是復制保真性的酶學依據 復制按照堿基配對規(guī)律進行,是遺傳信息能復制按照堿基配對規(guī)律進行,是遺傳信息能準確傳代的基本原理。準確傳代的基本原理。 此外還需酶學的機制來保證復制的保真性。此外還需酶學的機制來保證復制的保真性。A:DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基;并用其聚合活的外切酶活性切除錯配堿基;并用其聚合活性摻入正確配對的底物。性摻入正確配對的底物。B:堿基配對正確,:堿基配對正確, DNA-pol不

15、表現(xiàn)活性。不表現(xiàn)活性。DNA pol 的校讀功能的校讀功能遵守嚴格的堿基配對規(guī)律;遵守嚴格的堿基配對規(guī)律;聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能;聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能;復制出錯時復制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。的及時校讀功能。nDNA復制的保真性至少要依賴三種機制:復制的保真性至少要依賴三種機制:四、復制中的分子解鏈伴有四、復制中的分子解鏈伴有DNA 分子拓撲學變化分子拓撲學變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內部,只有把分子的堿基埋在雙螺旋內部,只有把DNA解成單鏈,它才能起模板作用。解成單鏈,它才能起模板作用。E. Coli 基因圖基因圖(一)多種酶參與(一)多種酶參與DNA解

16、鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)理理順順DNA鏈鏈拓拓撲撲異異構構酶酶 (gyrA, B)穩(wěn)穩(wěn)定定已已解解開開的的單單鏈鏈單單鏈鏈DNA結結合合蛋蛋白白SSB催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG (dnaG)運運送送和和協(xié)協(xié)同同DnaBDnaC (dnaC)解解開開DNA雙雙鏈鏈解解螺螺旋旋酶酶DnaB (dnaB)辨辨認認起起始始點點DnaA (dnaA)蛋蛋白白質質(基基因因)通通用用名名功功能能原原核核生生物物復復制制起起始始的的相相關關蛋蛋白白質質解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能,作用于供能,作用于氫鍵,使氫鍵,使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。雙鏈解

17、開成為兩條單鏈。DnaB引物酶引物酶(primase) 復制起始時催化生成復制起始時催化生成RNA引物的酶。引物的酶。單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復制中維持模板處于單鏈狀在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整態(tài)并保護單鏈的完整;單鏈有利于復制,但容易降解單鏈有利于復制,但容易降解 ; SSB通過不斷的結合、脫離來發(fā)揮作用;通過不斷的結合、脫離來發(fā)揮作用; 108局部解鏈后局部解鏈后(二)(二)DNA拓撲異構酶改變拓撲異構酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、超螺旋狀態(tài)、理順理順DNA鏈鏈n復制過程正超螺旋的形成:

18、復制過程正超螺旋的形成:解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成 既能水解既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵。、又能連接磷酸二酯鍵。 拓撲異構酶拓撲異構酶拓撲異構酶拓撲異構酶n拓撲異構酶分類:拓撲異構酶分類:n拓撲異構酶作用特點:拓撲異構酶作用特點:拓撲異拓撲異構酶構酶切斷切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股一股鏈,使鏈,使DNA解鏈旋轉不致打結;適當時候封解鏈旋轉不致打結;適當時候封閉切口,閉切口,DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應反應不需不需ATP。拓撲異拓撲異構酶構酶切斷切斷DNA分子分子兩股兩股鏈,斷端通過鏈,斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。切口旋轉使超螺旋松弛。利用利用ATP供能,連接斷端

19、,供能,連接斷端, DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。分子進入負超螺旋狀態(tài)。n作用機制:作用機制:n拓撲酶的作用方式:拓撲酶的作用方式:五、五、DNA連接酶連接連接酶連接DNA雙鏈中的雙鏈中的單鏈缺口單鏈缺口連接連接DNA鏈鏈3 -OH末端和相鄰末端和相鄰DNA鏈鏈5 -P末端,使二者生成磷酸二酯鍵,從而把兩段相末端,使二者生成磷酸二酯鍵,從而把兩段相鄰的鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。鏈連接成一條完整的鏈。n DNA連接酶連接酶(DNA ligase)作用方式:作用方式:POO-O-OHO5POO-O-O335DNA連接酶連接酶ATPADP5353nDNA連接酶的作用:連接酶的作用:連接雙鏈間的單

20、鏈缺口連接雙鏈間的單鏈缺口。 DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。作用。 在在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能:功能:提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -P結果結果DNA聚合酶聚合酶引物或延長中的引物或延長中的新鏈新鏈游離游離dNTP去去PPi(dNMP)n+1連接酶連接酶復制中不連續(xù)的兩條單鏈復制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)不連續(xù)連續(xù)鏈連續(xù)鏈拓撲酶拓撲酶切斷、整理后的兩鏈切斷、整理后的兩鏈改變拓撲狀態(tài)改變拓撲狀態(tài)DNA聚合酶,拓撲酶和連接酶催化

21、聚合酶,拓撲酶和連接酶催化3 ,5 -磷酸二酯鍵生成的比較磷酸二酯鍵生成的比較 參與參與DNA復制的主要成員復制的主要成員主要成員主要成員主要作用主要作用DnaA 識別復制起始位點識別復制起始位點解螺旋酶解螺旋酶 解開解開DNA雙鏈雙鏈SSB 維持已解開單鏈維持已解開單鏈DNA的穩(wěn)定的穩(wěn)定引物酶引物酶 合成合成RNA引物引物TOPO 使打結、纏繞、正超螺旋的使打結、纏繞、正超螺旋的DNA松馳松馳DNA-pol DNA復制復制DNA-pol 水解引物、填補空隙、修復作用水解引物、填補空隙、修復作用DNA連接酶連接酶 催化雙鏈催化雙鏈DNA中單鏈缺口的連接中單鏈缺口的連接27/62DNA生物合成過

22、程生物合成過程The Process of DNA Replication第第 三三 節(jié)節(jié)(一)復制起始:(一)復制起始:DNA解鏈形成引發(fā)體解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個問題:需要解決兩個問題:1. DNA解開成單鏈,提供模板。解開成單鏈,提供模板。2. 形成引發(fā)體,合成引物,提供形成引發(fā)體,合成引物,提供3 -OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成E.coli復制起始點復制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTAT

23、ACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復序列串聯(lián)重復序列 反向重復序列反向重復序列5 3 5 3 1. DNA解鏈:解鏈:oriC,245bp Dna A Dna B、 Dna CDNA拓撲異構酶拓撲異構酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引發(fā)體和引物引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短鏈引物是由引物

24、酶催化合成的短鏈RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶(二)復制的延長過程:領頭鏈連續(xù)復制,(二)復制的延長過程:領頭鏈連續(xù)復制,隨從鏈不連續(xù)復制隨從鏈不連續(xù)復制復制的延長指在復制的延長指在DNA-pol催化下,催化下,dNTP以以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上,的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上,其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-poln領頭鏈的合成:領頭鏈的合成:領頭鏈的子鏈沿著領頭鏈的子鏈沿著5 5 33 方向可以連續(xù)地延長。

25、方向可以連續(xù)地延長。n隨從鏈的合成隨從鏈的合成n同一復制叉上領頭鏈和隨從鏈由相同的同一復制叉上領頭鏈和隨從鏈由相同的DNA-pol催化延長催化延長 階段一階段一階段二階段二階段三階段三階段四階段四復復制制過過程程簡簡圖圖 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNA,雙向復制的復制片段,雙向復制的復制片段在復制的終止點在復制的終止點(ter)處匯合。處匯合。oriter E.coli8232 ori terSV40500(三)復制的終止過程:切除引物、填補(三)復制的終止過程:切除引物、填補空缺、連接切口空缺、連接切口5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP AD

26、P+Pi5 5 DNA連接酶連接酶n 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接:隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接:哺乳動物的哺乳動物的細胞周期細胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成(一)真核生物復制的起始與原核基本相似(一)真核生物復制的起始與原核基本相似CDK相匹配的周期蛋白相匹配的周期蛋白作用點作用點CDK2Cyclin D1, D2, D3G1期期Cyclin EG1S期期Cyclin AS期期CDK3和和CDK4Cyclin D1, D2, D3G2期期CDK1(CDC2)Cyclin A, BG2M期期哺乳類動物的周期蛋白和哺乳類動物的周期蛋白和CDK3

27、 5 5 3 領頭鏈領頭鏈3 5 3 5 親代親代DNA隨從鏈隨從鏈引物引物核小體核小體n真核生物復制叉的延長:真核生物復制叉的延長: 染色體染色體DNA呈線狀,復制在末端停止。呈線狀,復制在末端停止。復制中岡崎片段的連接,復制子之間的連接。復制中岡崎片段的連接,復制子之間的連接。染色體兩端染色體兩端DNA子鏈上最后復制的子鏈上最后復制的RNA引物,引物,去除后留下空隙。去除后留下空隙。(三)端粒酶參與解決染色體末端復制問題(三)端粒酶參與解決染色體末端復制問題5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 n線性線性DNA復復制的末端制的末端 端粒端粒(telomere) 指真

28、核生物染色體線性指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構。分子末端的結構。n端粒的功能:端粒的功能:維持染色體的穩(wěn)定性維持染色體的穩(wěn)定性維持維持DNA復制的完整性復制的完整性n端粒的結構特點:端粒的結構特點:由末端單鏈由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。序列和蛋白質構成。末端末端DNA序列是多次重復的富含序列是多次重復的富含G、T堿基堿基的短序列。的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein

29、 1, hTP1)端粒酶逆轉錄酶端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) n組成:組成:n端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型 端粒酶的催端粒酶的催化延長作用化延長作用爬爬行行模模型型目目 錄錄DNADNA聚合酶復制子鏈聚合酶復制子鏈進一步加工進一步加工目目 錄錄端粒酶的爬行模型(動畫演示)端粒酶的爬行模型(動畫演示)逆轉錄和其他復制方式逆轉錄和其他復制方式Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways第四節(jié)第四節(jié)逆轉錄酶逆轉錄酶(reverse tran

30、scriptase) 逆轉錄逆轉錄(reverse transcription) 逆轉錄逆轉錄酶酶一、逆轉錄病毒的基因組是一、逆轉錄病毒的基因組是RNA,其復制方式是逆轉錄其復制方式是逆轉錄n逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現(xiàn)象:RNA 模板模板逆轉錄酶逆轉錄酶DNA-RNA雜化雙鏈雜化雙鏈RNA酶酶單鏈單鏈DNA逆轉錄酶逆轉錄酶雙鏈雙鏈DNA分子生物學研究可應用逆分子生物學研究可應用逆轉錄酶,作為獲取基因工程目轉錄酶,作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一,此法的基因的重要方法之一,此法稱為稱為cDNA法。法。 以以mRNA為模板,經逆轉為模板,經逆轉錄合成的與錄合成的與

31、mRNA堿基序列互堿基序列互補的補的DNA鏈。鏈。 n試管內合成試管內合成cDNA:cDNA complementary DNA 逆轉錄酶逆轉錄酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T二、逆轉錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則二、逆轉錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象,是分子生物學研究逆轉錄酶和逆轉錄現(xiàn)象,是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。中的重大發(fā)現(xiàn)。 逆轉錄現(xiàn)象說明:至少在某些生物,逆轉錄現(xiàn)象說明:至少在某些生物,RNA同同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉錄病毒的研究,拓寬了對逆轉錄病毒的研究,拓

32、寬了20世紀初已注世紀初已注意到的病毒致癌理論。意到的病毒致癌理論。 n 滾環(huán)復制滾環(huán)復制(rolling circle replication)三、噬菌體三、噬菌體DNA按滾環(huán)方式復制和按滾環(huán)方式復制和線粒體線粒體DNA按按D環(huán)方式復制環(huán)方式復制是某些低等生物的復制形式,如是某些低等生物的復制形式,如 X174和和M13噬菌體等。噬菌體等。3 -OH5 -P5 5 5 3 3 3 3 5滾環(huán)復制滾環(huán)復制5 5 3 3 5 具有內切酶活性的具有內切酶活性的A A蛋白蛋白dNTPDNA-pol n D環(huán)復制環(huán)復制(D-loop replication) 是線粒體是線粒體DNA (mitochon

33、drial DNA,mtDNA)的復制形式。的復制形式。 DNA損傷(突變)與修復損傷(突變)與修復DNA Damage (Mutation) & Repair第五節(jié)第五節(jié) DNA突變具體指個別突變具體指個別dNMP殘基以至片段殘基以至片段DNA在構成、復制或表型功能的異常變化,在構成、復制或表型功能的異常變化,也稱為也稱為DNA損傷損傷(DNA damage)。 從分子水平來看,突變就是從分子水平來看,突變就是DNA分子上堿基分子上堿基的改變。的改變。 一、突變在生物界普遍存在一、突變在生物界普遍存在(一)突變是進化、分化的分子基礎(一)突變是進化、分化的分子基礎 從長遠的生物史看,

34、進化過程是突變的不斷從長遠的生物史看,進化過程是突變的不斷發(fā)生所造成的。發(fā)生所造成的。 大量的突變都是屬于這種類型,只是目前還大量的突變都是屬于這種類型,只是目前還未能認識其發(fā)生的真正原因,因而名為自發(fā)未能認識其發(fā)生的真正原因,因而名為自發(fā)突變或自然突變突變或自然突變(spontaneous mutation)。(二)只有基因型改變的突變形成(二)只有基因型改變的突變形成DNA的多態(tài)性的多態(tài)性 這種突變沒有可察覺的表型改變,例如在簡這種突變沒有可察覺的表型改變,例如在簡并密碼子上第三位堿基的改變,蛋白質非功并密碼子上第三位堿基的改變,蛋白質非功能區(qū)段上編碼序列的改變等。這些現(xiàn)象也相能區(qū)段上編碼

35、序列的改變等。這些現(xiàn)象也相當普遍。當普遍。 多態(tài)性多態(tài)性(polymorphism)一詞用來描述個體之一詞用來描述個體之間的基因型差別現(xiàn)象。間的基因型差別現(xiàn)象。 (三)致死性的突變可導致個體、細胞的死亡(三)致死性的突變可導致個體、細胞的死亡(四)突變是某些疾病的發(fā)病基礎(四)突變是某些疾病的發(fā)病基礎n物理因素:物理因素:紫外線紫外線(ultra violet, UV)、各種輻射、各種輻射 UVn化學因素:化學因素:常見的化學誘變劑常見的化學誘變劑化合物類別化合物類別作作 用用 點點分子改變分子改變堿基類似物堿基類似物如:如:5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羥胺類(羥

36、胺類(NH2OH)T C- T - A - C - G -亞硝酸鹽(亞硝酸鹽(NO2)C U- G - C - A - T -烷化劑烷化劑如:氮芥類,如:氮芥類,NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G三、引起突變的分子改變類型有多種三、引起突變的分子改變類型有多種錯配錯配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement) 框移框移(frame-shift) DNA分子上的堿基錯配稱點突變分子上的堿基錯配稱點突變(point mutation)。 自發(fā)突變和不少化學誘變都能引起自發(fā)突變和不少化學誘變都能引起DN

37、A上某一堿基上某一堿基的置換。的置換。 點突變發(fā)生在基因的編碼區(qū),可導致氨基酸改變。點突變發(fā)生在基因的編碼區(qū),可導致氨基酸改變。 (一)錯配可導致編碼氨基酸的改變(一)錯配可導致編碼氨基酸的改變鐮形紅細胞貧血病人鐮形紅細胞貧血病人Hb (HbS) 亞基亞基N-val his leu thr pro val glu C 肽鏈肽鏈CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亞基亞基N-val his leu thr pro glu glu C 肽鏈肽鏈CTC GAG基因基因n鐮形紅細胞貧血病人鐮形紅細胞貧血病人(二)缺失、插入和框移突變造成蛋白質氨基酸(二)缺失、插入和框移突變造成蛋白質氨基酸排列順序發(fā)生改變排列順序發(fā)生改變 缺失:缺失:一個堿基或一段核苷酸鏈從一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子大分子上消失。上消失。 插入:插入:原來沒

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