流式細胞儀及其應(yīng)用指南

1、會計學(xué)1流式細胞儀及其應(yīng)用指南流式細胞儀及其應(yīng)用指南在管道大約50倍直徑距離處，鞘液中心速度與邊緣速度達到穩(wěn)定，形成穩(wěn)定的層流。樣本與鞘液未入管道時，邊緣與中心速度一致。進入管道后，受管壁粘性阻力邊緣速度下降，中心速度不變。流體形成層流后，會產(chǎn)生流體聚焦效應(yīng)，所有顆粒均被推致流速最快的液流中。顆粒以衡定的速度作勻速運動。標本來源：標本來源：外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細胞、脫落細胞及其他。外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細胞、脫落細胞及其他。根據(jù)各種具體實驗，選用根據(jù)各種具體實驗，選用不同的抗凝劑。不同的抗凝劑。可用的抗凝劑如下：可用的抗凝劑如下：EDTA： 2mg/ml枸椽酸鈉：枸椽酸鈉：0.38%

2、肝素：肝素：15IU/ml標本處理時間：新鮮樣本分析時，樣本采集后應(yīng)立即分析樣本固定方法：樣本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分鐘。注：不同的實驗，所用的固定方法不完全相同。樣本處理標準試劑：樣本處理標準試劑：一、10%Bovine Serum Albumin BSA1. 溶解10g BSA至100ml蒸餾水中2. 4C，20000 g離心30分鐘3. 分裝后-20C保存二、0.1% BSA-PBS緩沖液 1. 準備500ml，PH7.3 PBS2. 加入5ml 10% BSA3. 使用0.45um濾網(wǎng)過濾三、氯化銨溶血劑 1. 在一升蒸餾水中溶解8.29g NH4CL,1g

3、KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 調(diào)節(jié)PH值至7.23. 在使用前配置該溶血劑，并用0.45um濾膜過濾方法一：溶血法方法一：溶血法1.取取100 ul抗凝全血；抗凝全血；2. 快速加入快速加入 2ml NH4CL溶血劑溶血劑,混勻；混勻；3. 室溫孵育室溫孵育10分鐘；分鐘；4. 4C，400g離心離心10分鐘。去上清，加入分鐘。去上清，加入2ml BSA-PBS；5. 4C，400g離心離心10分鐘。去上清，加入分鐘。去上清，加入2ml BSA-PBS；6. 4C，400g離心離心10分鐘。去上清，調(diào)整細胞濃度至分鐘。去上清，調(diào)整細胞濃度至5x106/ml。富集白細胞富集白細胞注

4、：注：化學(xué)試劑直接作用于紅細胞的溶血劑有：以草酸為主的溶血劑（化學(xué)試劑直接作用于紅細胞的溶血劑有：以草酸為主的溶血劑（Coulter Q-Prep），基于），基于NH4CL的的BD公司的公司的FACSLyse溶血劑。溶血劑。優(yōu)點：優(yōu)點：溶血時間快？，在流式細胞儀上可清楚地將淋巴、單核、溶血時間快？，在流式細胞儀上可清楚地將淋巴、單核、粒及紅細胞碎片相區(qū)分。粒及紅細胞碎片相區(qū)分。缺點：缺點：需嚴格掌握溶血時間，對白細胞表面抗原有影響，隨時間細胞形需嚴格掌握溶血時間，對白細胞表面抗原有影響，隨時間細胞形態(tài)變化大。態(tài)變化大。方法二：密度離心法提取單個核細胞方法二：密度離心法提取單個核細胞 Histo

5、paque 1077為為Ficoll與與Sodium diatrizoate(泛影酸鈉泛影酸鈉)混合物，其密混合物，其密度為度為1.1191.077。通過離心可將全血中的粒細胞與單個核細胞分離。粒細胞。通過離心可將全血中的粒細胞與單個核細胞分離。粒細胞沉積于沉積于1.1191.077的血漿層，而單個核細胞則在的血漿層，而單個核細胞則在1.077以下的血漿層中。以下的血漿層中。 1. 準備2ml抗凝血（根據(jù)實驗要求確定用血量）， 等量PBS稀釋；2. 準備1ml Histopaque 1077 (Sigma)；3. 室溫下700g離心30分鐘；4. 仔細將含有單個核細胞血漿層吸出；5. 加4ml

6、 BSA-PBS，400g離心10分鐘；6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。 淋巴節(jié)、扁桃體、脾、胸腺等淋巴組織淋巴節(jié)、扁桃體、脾、胸腺等淋巴組織由于結(jié)構(gòu)松散，由于結(jié)構(gòu)松散，容易分離成單個細胞。一般對樣本進行切剪、研磨、過濾便可。容易分離成單個細胞。一般對樣本進行切剪、研磨、過濾便可。3.將樣本經(jīng)濾網(wǎng)過濾，用密度法分離、提將樣本經(jīng)濾網(wǎng)過濾，用密度法分離、提純淋巴細胞。純淋巴細胞。方方 法法：其他標本：其他標本：通常在其他組織中分離淋巴細胞需用酶進行消化。對于通常在其他組織中分離淋巴細胞需用酶進行消化。對于不同標本，處理方法也各不相同。不同標本，處理方法也各不相同。制備大鼠腎臟浸潤細胞制備大

7、鼠腎臟浸潤細胞解剖刀、解剖刀、CO2孵育箱、濾網(wǎng)孵育箱、濾網(wǎng)以及含以及含1mg/ml膠原酶的細胞培養(yǎng)液（無血清）膠原酶的細胞培養(yǎng)液（無血清）材料：材料：1. 將樣本置于皮氏培養(yǎng)皿，用解培刀切成小塊；將樣本置于皮氏培養(yǎng)皿，用解培刀切成小塊；2. 加入加入10ml膠原酶溶液，膠原酶溶液，37C CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)箱孵育30分鐘；分鐘；3. 濾網(wǎng)過濾；濾網(wǎng)過濾；4. 密度梯度法離心提純淋巴細胞。密度梯度法離心提純淋巴細胞。1. 解剖刀解剖刀2. 0.15%胰蛋白酶胰蛋白酶3. Hankss緩沖鹽或緩沖鹽或PBS，pH7.34. 不含不含Ca、Mg離子的離子的HBSS5. II型膠原酶型膠原酶6.

8、1%BSA或或5%FBS7. 5ml的吸樣管的吸樣管8. 35um尼龍濾網(wǎng)尼龍濾網(wǎng)9. DNase1. 將樣本置于皮氏培養(yǎng)皿，加15ml BSA-PBS，將樣本切 成1mm3大小，用鑷子將其分離；2. HBSS或PBS洗清3. 加入10ml無Ca、Mg離子0.2% II型膠原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS；4. 37C搖床上孵育1560分鐘，視樣本類型而定；操操 作作8.、Mg的HBSS重懸， 37C孵育一段時間加入1%BSA或5%FBS，滅活酶活性。n其他樣本，計數(shù)后決定使用體積目標細胞數(shù)量及檢測終濃度：目標細胞數(shù)量及檢測終濃度：1106/mlSPECIFIC ANTIBODYN

9、ON-SPECIFIC ANTIBODYCONCENTRATIONAMOUNT BOUND抗體滴定原理抗體滴定原理33 gs/n = 2.51 gs/n = 2.10.3 gs/n = 2.40.1 gs/n = 4.10.03 gs/n = 4.80.01 gs/n = 4.60.003 gs/n = 3.50.001 gs/n = 3.2auto65432100102030405060DilutionSignal to NoiseTITER放置較長時間放置較長時間白細胞保護型溶血劑Cal-Lyse(其中已含細胞固定劑)：1，100ul外周血，加入100ul溶血劑2，混勻后，室溫下孵育10分

10、鐘3，加入2ml蒸餾水，混勻后室溫下孵育10分鐘4，根據(jù)實驗需要，免洗直接上機檢測或400g離心10分鐘后PBS重懸優(yōu)點：試劑為溫和型溶血劑，不影響細胞表面抗原及溶血時間無需精確把握各各溶溶血血劑劑性性能能比比較較能量級激發(fā)激發(fā)態(tài)發(fā)射激光能量損失Alexa Green具有更佳的能量轉(zhuǎn)移效率及更純的發(fā)射光譜為復(fù)合熒光素，熒光激發(fā)較率較高，信號強FTIC、PE、PE-Cy5三者為流式細胞最為常的熒光，并經(jīng)常將三者共同使用進行三色分析在配有雙激光的流式細胞儀上，此熒光染料與FITC、PE、PE-Cy5聯(lián)用做四色分析。但現(xiàn)在因單激光四色可實現(xiàn)，故使用該染料意義不大。染料激發(fā)光發(fā)射光光源Propidiu

11、m Iodide495342639488Ethidium biromide4933206374887-Aminoactinomycin D546647514488Acridine Orange503 530(DNA)488640(RNA)Chromomycin A3430580457Hoechst 33342395450UVDAPI372456UVPyronin Y545565514488Thiazole Orange509533488YO-PRO-1642661488TO-PRO-3642661630LDS 751543712488需要更高的精度：300MESF以內(nèi)nn如標本中無明顯特征細胞

12、群，可使用已建淋巴細胞檢測方案根據(jù)相對位置定位目標細胞群FL1FL2n多色熒光補償調(diào)節(jié)方法同雙色法ISHAGE方案去除這些影響。據(jù)其中的淋巴細胞的位置調(diào)節(jié)R4門確定R4 門在FS 和SS 軸上最小值的最低范圍線的左側(cè)然后根據(jù)此進的CD45 界線位置確定R1 門的最小值n下載：乳腺癌DNA異倍體患者生存率DNA倍體分析中，S期的含量也是評估疾病預(yù)后的重要指標檢測是結(jié)合腫瘤標記物，特異性地分析腫瘤細胞的檢測是結(jié)合腫瘤標記物，特異性地分析腫瘤細胞的DNADNA含量有助于提高診斷的準確率。含量有助于提高診斷的準確率。10101 110102 210103 310104 4Thi azol e O range -Thi azol e O range -