核磁共振在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

1、核磁共振在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、一、核磁共振譜的基本內(nèi)容三、三、核磁共振在多糖結(jié)構(gòu)的應(yīng)用二、 單糖的基礎(chǔ)知識第1頁/共39頁核磁共振的基本內(nèi)容核磁共振的基本內(nèi)容第2頁/共39頁核磁共振的基本知識核磁共振的基本知識： 它表示的是在所有的帶電荷的原子核中，核電荷繞軸自旋，我們就把這種自旋電荷運動的狀態(tài)稱之為自旋量子數(shù)。 在原子核中，I 是每個質(zhì)子和中子各自的自旋的合量。 若自旋量子數(shù)總和為偶數(shù)時，I為零或整數(shù)；若總和為奇數(shù)時，I 為半整數(shù)；如質(zhì)子和中子的總和均為偶數(shù)時，則I為零。 I為零時，原子核不具有磁性，所以在核磁共振中不能給出NMR信號。(如:12C 160 等）I0時，原

2、子核在自旋中會產(chǎn)生磁偶矩而具有磁性。第3頁/共39頁同位素I天然豐度（%）u絕對靈敏度共振頻率（MHz)/B=7.0463T1H1/299.982.791.003002H10.0150.861.45*10-646.0513C1/21.110.701.76*10-475.4314N199.630.401.01*10-321.6715N1/20.37-0.283.85*10-630.4019F1/21002.630.83282.2331P1/21001.136.63*10-2121.40一些磁核的性質(zhì)一些磁核的性質(zhì)第4頁/共39頁核磁共振的基本概念核磁共振的基本概念1、是一種吸收光譜2、樣品（溶液

3、狀態(tài)）置于強磁場中（1-12 Tesler)3、射頻電子波（波長=110Mum）照射4、具有磁性原子核產(chǎn)生核能級躍遷而引起電子波的吸收核磁共振第5頁/共39頁核磁共振儀核磁共振儀 一個能產(chǎn)生均勻磁場的強磁鐵，并用繞在磁鐵上的掃描線圈使磁場強度在一個相當(dāng)窄的范圍內(nèi)連續(xù)地、精確的改變。 射頻振蕩器 目前常采用400MHz 或500MHz的電磁波，還有更高的600MHz、900MHz。 射頻接受器 核磁產(chǎn)生共振時，能檢出被吸收的電磁波能量。 記錄儀和積分器 能把弱信號累加并記錄下來。 樣品管座：它規(guī)定了樣品相對于外加磁場、發(fā)射線圈和接收線圈之間的位置。它能夠一定的速度旋轉(zhuǎn)，使樣品受到均勻磁場作用。

4、另外還有去偶儀、計算機、溫度可變裝置和異核射頻振蕩器等第6頁/共39頁核磁共振的常用術(shù)語核磁共振的常用術(shù)語第7頁/共39頁化學(xué)位移概念：表示不同質(zhì)子的信號差別的物理量。它是以某種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的共振峰（如：TMS)為原點，測出各峰與原點的距離，此距離就稱化學(xué)位移。左邊的峰為正，右邊的峰為負。 （原因：分子中處于不同化學(xué)環(huán)境中的核，由于其外圍電子云分布情況各不相同，因而產(chǎn)生不同程度的屏蔽效應(yīng)，因此就會存在略有區(qū)別的共振頻率。） 2 2、表示方法： 單位（ppm)由于化學(xué)位移的大小與核所處的化學(xué)環(huán)境有密切關(guān)系，因此就有可能根據(jù)化學(xué)位移的大小來了解核所處的化學(xué)環(huán)境，即了解有機化合物的分子結(jié)構(gòu)。 同一個物質(zhì)

5、在不同規(guī)格型號的儀器上所測得的數(shù)值是相同的。第8頁/共39頁內(nèi)標(biāo)物在化學(xué)位移測定時，常用的標(biāo)準(zhǔn)物是四甲基硅烷（CH3)4Si，簡稱 TMS。TMS 用作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的優(yōu)點是：1.TMS 化學(xué)性質(zhì)不活潑，與樣品之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)和分子間締合；2.TMS 是一個對稱結(jié)構(gòu)，四個甲基有相同的化學(xué)環(huán)境，因此無論在氫譜還是在碳譜中都只有一個吸收峰；3.因為 Si的電負性（1.9）比 C 的電負性（2.5）小，TMS 中的氫核和碳核處在高電子密度區(qū)，產(chǎn)生大的屏蔽效應(yīng)，它產(chǎn)生 NMR 信號所需的磁場強度比一般有機物中的氫核和碳核產(chǎn)生 NMR 信號所需的磁場強度都大得多，與絕大部分樣品信號之間不會互相重疊干擾；4.

6、TMS 沸點很低（27度），容易去除，有利于回收樣品。5.但 TMS 是非極性溶劑，不溶于水。對于那些強極性試樣，必須用重水為溶劑測譜時要用其它標(biāo)準(zhǔn)物。第9頁/共39頁自旋-自旋偶合：耦合是裂分的原因，裂分是耦合的結(jié)果。：CHCH21 偕偶：間隔兩個單鍵的偶合稱偕偶,即：同碳原子上的H之間偶合。表示為： 其范圍為1016 Hz 2 鄰偶：間隔三個鍵的偶合，稱鄰偶， 3J其范圍為59 Hz 3 遠程偶合：通常大于三個鍵間隔時，J值小于1，常?？床灰娕己献饔?，但是在 體系中存在。第10頁/共39頁測試NMR的溶劑 NMR溶劑的選擇：不產(chǎn)生干擾信號、溶解性能好、沸點低、與被測樣品不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。N

7、M R s o l v e n t s i g n a l s S o l v e n t (1H ) (1 3C ) ( H O D o r D2O ) A c e t o n e 2 .0 5 ( 5 ) 2 0 6 .7 ( 1 3 ) , 2 9 .9 ( 7 ) 2 .8 A c e t o n i t r i l e 1 .9 4 ( 5 ) 1 1 8 .7 ( 1 ) , 1 .3 9 ( 7 ) 2 .1 B e n z e n e 7 .1 6 ( 1 ) 1 2 8 .4 ( 3 ) 0 .4 C h l o r o f o r m 7 .2 6 ( 1 ) 7 7 .2

8、 ( 3 ) 1 .6 D M S O 2 .5 0 ( 5 ) 3 9 .5 ( 7 ) 3 .3 M e t h a n o l 3 .3 1 ( 5 ) 4 9 .1 ( 7 ) 4 .8 C D2C l2 5 .3 2 ( 3 ) 5 4 .0 0 ( 5 ) 1 .5 P y r i d i n e 8 .7 4 ( 1 ) , 7 .5 8 ( 1 ) , 7 .2 2 ( 1 ) 1 5 0 .3 ( 1 ) , 1 3 5 .9 ( 3 ) , 1 2 3 .9 ( 5 ) 4 .9 W a t e r ( D2O ) 4 .8 4 .8 第11頁/共39頁單糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知識

9、糖的表示式CH2OHCHOCHOCH3CHOCH2OHOCHOCH2OHD-木糖L-鼠李糖D-葡萄糖D-果糖五碳醛糖甲基五碳醛糖六碳醛糖六碳酮糖 單糖是多羥基醛或酮。從三碳糖至八碳糖天然界都有存在。每個糖都有兩個以上的手性碳原子，它們的命名規(guī)則是：碳原子的排列順序是從醛基或者酮基基團為C-1開始的。CHOCH2OHOD-葡萄糖單糖在水溶液中形成半縮醛環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即成呋喃糖和吡喃糖。具有六元環(huán)結(jié)構(gòu)的糖吡喃糖（pyranose）具有五元環(huán)結(jié)構(gòu)的糖呋喃糖（furanose）糖處游離狀態(tài)時用Fischer式表示，苷化后成環(huán)用Haworth式表示第12頁/共39頁單糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知識 醛糖和酮糖甘油醛和二羥

10、基丙酮有相同的化學(xué)組成，C3H6O3，但是不同的結(jié)構(gòu)，它們屬于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。CCHOHCH2OHOHG ly c e r a ld e h y d e(a n a ld o s e )C3H6O3CH2OHCCH2OHD ih y d r o x y a c e to n e(a n k e to s e )C3H6O3OCCC H2O HHOO HHCCC H2O HHOHH Om irror planL - glyceraldehydeD - glyceraldehyde甘油醛有一個不對成碳原子（手性碳原子），所以它有兩個立體異構(gòu)體，即D-和L-型。并且互為鏡像異構(gòu)體。第13頁/共39頁單糖

11、的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知識 Fischer與Haworth的轉(zhuǎn)換及其相對構(gòu)型 C H OC H2O HOOCC H2O HHOHOCC H2O HO HHOD - 葡 萄 糖異 側(cè)同 側(cè)異 側(cè)同 側(cè) 單糖成環(huán)后新形成的一個不對稱碳原子稱為端基碳（anomeric carbon）。生成的一對差向異構(gòu)體（anomer）有、二種構(gòu)型。從Fischer式看（C1與C5的相對構(gòu)型）：C1-OH與原C5（六碳糖）或C4（五碳糖）-OH，順式為，反式為。從Haworth式看：C1-OH與C5（或C4）上取代基之間的關(guān)系：同側(cè)為，異側(cè)為。第14頁/共39頁單糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知識糖的絕對構(gòu)型（D、L） 絕對構(gòu)型D-和L-的判斷

12、是從醛基或者酮基開始最遠的手性碳原子。 OCC H2O HO HHC H OC H OC H2O HC H OC H3C H3O - O H 甘 油 醛D 型D - 葡 萄 糖L - 鼠 李 糖 - D - 葡 萄 糖 - L - 鼠 李 糖Fischer式中最后第二個碳原子上-OH向右的為D型，向左的為L型。Haworth式中C5向上為D型，向下為L型。第15頁/共39頁單糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)知識 環(huán)的構(gòu)象 OOO1234(2)(3)(4)(5) 呋喃糖五元環(huán)接近在同一平面上。唯醛糖的C3、酮糖的C4超出平面0.5A，幾乎是固定的結(jié)構(gòu)。 六元環(huán)有船式和椅式構(gòu)象，在溶液或固體狀態(tài)是都是椅式構(gòu)象，不是C

13、1便是1C。C表示椅式（chair form）。OOC 1 式1 C 式1234512345 以C2、C3、C5、O四個原子構(gòu)成的平面為準(zhǔn)，C4處面上，C1處面下的標(biāo)為4C1，簡稱C1，反之1C4簡稱1C。Angyal用總自由能來分析構(gòu)象式的穩(wěn)定性，比較二種構(gòu)象式的總自由能差值，能量低的是優(yōu)勢構(gòu)象。第16頁/共39頁核磁共振在多糖結(jié)構(gòu)的應(yīng)用1 1H NMRH NMR譜）譜）1 1H-H-1 1H H 2 2、TOCSY(TOCSY(全相關(guān)全相關(guān)) )譜譜 3 3、1 1H-H-1313C COSYC COSY譜（譜（HMQCHMQC） 4 4、遠程、遠程1 1H-H-1313C COSYC C

14、OSY譜（譜（HMBCHMBC） 5 5、NOESYNOESY譜譜 6 6、INADEQUATEINADEQUATE譜譜第17頁/共39頁核磁共振氫譜（1H NMR譜） 核磁共振氫譜（ 1H NMR），也稱為質(zhì)子磁共振譜（proton magnetic resonance，pmr），是發(fā)展最早，研究得最多，應(yīng)用最為廣泛的核磁共振波譜。在較長一段時間里核磁共振氫譜幾乎是核磁共振譜的代名詞。原因:一：質(zhì)子的天然豐度接近 100%,核磁共振測定的絕對靈敏度是所有磁核中最大的。在 PFT NMR（脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀）出現(xiàn)之前，天然豐度低的同位素，如13C等的測定很困難。二：1H是有機化合物中最

15、常見的同位素， 1H NMR 譜是有機物結(jié)構(gòu)解析中最有用的核磁共振譜之一。 在多糖中的應(yīng)用 可給出的信號有在4.3-5.9ppm的異頭質(zhì)子.可以判斷異頭碳的構(gòu)型(5.00為-型, 5.00 為-型). 在1.1-1.3ppm處的6-位脫氧糖的甲基雙峰. 在2.0-2.2ppm處的乙酰氨基的甲基峰. 在3.0-4.2ppm的非常小的區(qū)域中,結(jié)果嚴(yán)重重疊不能給出結(jié)構(gòu)信息. 第18頁/共39頁碳核磁共振譜（1313C NMR C NMR 譜）1 BB譜(Proton broad band decoupling): 最常見的碳譜是寬帶全去偶譜(BB)，又稱質(zhì)子噪聲去耦譜，質(zhì)子噪聲去耦譜可以使碳譜簡化，

16、它損失了13C 和1H 之間的耦合信息，每一種化學(xué)等價的碳原子只有一條譜線。碳譜的化學(xué)位移對核所受的化學(xué)環(huán)境是很敏感的，它的范圍比氫譜寬得多，一般在 0-250ppm。對于分子量在 300-500 的化合物，碳譜幾乎可以分辨每一個不同化學(xué)環(huán)境的碳原子，而氫譜有時卻嚴(yán)重重迭。2 DEPT譜(Distortionless enhencement by polarization transfer): DEPT譜即無畸變極化轉(zhuǎn)移增益法?？稍谫|(zhì)子去偶,又可在質(zhì)子不去偶的條件下測定, 由于BB譜無法確定譜線所屬的碳原子的級數(shù)，所以可以通過改變照射1H的第三脈沖寬度()，使作45，90 ，135 變化并測定

17、其13C NMR譜。 = 45時，CH1和CH2和CH3均為正號。 = 90時，只有CH1有正信號，而CH2和CH3信號均為0。 = 135時，只有CH1和 CH3有正信號，而CH2有負信號。 在多糖中的應(yīng)用 確定異頭碳的數(shù)目確定異頭碳的數(shù)目: :異頭碳的共振一般出現(xiàn)在90-112ppm. 確定構(gòu)型確定構(gòu)型 : :一般來說-型連接的C1化學(xué)位移比-型低1.5-3.0, -型的化學(xué)位移為97-101， -型103-105，來確定確定構(gòu)型。 預(yù)言多糖的聚合程度預(yù)言多糖的聚合程度: : 一般還原末端的C-1出現(xiàn)在90-98ppm間,而取代碳水化合物的C-1(非還原單糖)出現(xiàn)在98-112ppm),因

18、而可預(yù)言多糖的聚合程度. 其他化學(xué)位移的信號: 52-57ppm間的共振信號一般為氨基取代碳的信號.170-176ppm范圍的低場信號反映有己糖醛酸的羧基或乙?；拇嬖?在60-70ppm間醛糖只有一個共振峰,而酮糖有兩個.第19頁/共39頁-型-型異頭氫區(qū)異頭碳區(qū)-型-型第20頁/共39頁2 D H-H相關(guān)譜-H-H COSY COSY 譜本身為正方形，當(dāng) F1和 F2譜寬不等時則為矩形。正方形中有一條對角線（一般為左下右上）。對角線上的峰稱為對角峰（ diagonal peak）。對角線外的峰稱為交叉峰（ cross peaks）或相關(guān)峰（correlated peaks）。每個相關(guān)峰或交

19、叉峰反映兩個峰組間的耦合關(guān)系。COSY 主要反映3J耦合關(guān)系。 它的解譜方法是：取任一交叉峰作為出發(fā)點，通過它作垂線，會與某對角線峰及上方的氫譜中的某峰組相交，它們即是構(gòu)成此交叉峰的一個峰組。再通過該交叉峰作水平線，與另一對角線峰相交，再通過該對角線峰作垂線，又會與氫譜中的另一峰組相交，此即構(gòu)成該交叉峰的另一峰組。第21頁/共39頁2 D H-H相關(guān)譜-H-H COSY第22頁/共39頁全相關(guān)譜 TOCSYTOCSY、 HOHAHAHOHAHA TOCSY（Total Correlation Spectroscopy）與 HOHAHA（Homonuclear Hartmann Hahn spe

20、ctscopy）稱為總相關(guān)譜?？蓮哪骋粋€氫核的譜峰出發(fā)，找到與它處于同一耦合體系的所有氫核譜峰的相關(guān)峰。TOCSY 和 HOHAHA 的用途及譜圖的外觀是一樣的，只是實驗時所用的脈沖序列不同。TOCSY 和 HOHAHA 譜目前正被越來越廣泛的使用。第23頁/共39頁第24頁/共39頁1H- 13C COSY譜（HMQC） HMQC 異核多重量子相干（Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) C-H COSY 是13C 和1H 核之間的位移相關(guān)譜。它反映了13C 和1H核之間的關(guān)系。它又分為直接相關(guān)譜和遠程相關(guān)譜，直接相關(guān)譜是把直接相連的13C 和1H

21、核關(guān)聯(lián)起來，矩形的二維譜中間的峰稱為交叉峰（ cross peak）或相關(guān)峰（correlated peak），反映了直接相連的13C 和1H核，在此圖譜中季碳無相關(guān)峰。第25頁/共39頁第26頁/共39頁遠程1H-13C COSY譜（HMBC）HMBCHMBC（1H 檢測的異核多鍵相關(guān)實驗，1H Detected Heteronuclear Multiple Bond Correlation或 Long Range Heteronuclear Multiple Quantum Coherecel）。遠程相關(guān)譜則是將相隔兩至四根化學(xué)鍵的13C 和1H 核關(guān)聯(lián)起來，甚至能跨越季碳、雜原子等，交叉

22、峰或相關(guān)峰比直接相關(guān)譜中多得多，因而對于幫助推測和確定化合物的結(jié)構(gòu)非常有用。 第27頁/共39頁NOESYNOESY譜譜 和和ROESYROESY譜譜 二維 NOE 譜簡稱為 NOESY，它反映了有機化合物結(jié)構(gòu)中核與核之間空間距離的關(guān)系，而與二者間相距多少根化學(xué)鍵無關(guān)。因此對確定有機化合物結(jié)構(gòu)、構(gòu)型和構(gòu)象以及生物大分子有著重要意義。 NOESY 的譜圖與H-H COSY 非常相似，它的 F2維和 F1維上的投影均是氫譜，也有對角峰和交叉峰，圖譜解析的方法也和 COSY 相同，唯一不同的是圖中的交叉峰并非表示兩個氫核之間有耦合關(guān)系，而是表示兩個氫核之間的空間位置接近。 由于 NOESY 實驗是由

23、 COSY 實驗發(fā)展而來為的，因此在圖譜中往往出現(xiàn) COSY 峰，即 J偶合交叉峰，故在解析時需對照它的H-H COSY 譜將J 偶合交叉峰扣除，對多糖譜可以用此來判斷多糖的構(gòu)型。 當(dāng)遇到中等大小的分子時（分子量約為 1000-3000），由于此時 NOE 的增益約為零，無法測到NOESY 譜中的相關(guān)峰（交叉峰），此時測定旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系中的 NOESY 則是一種理想的解決方法，這種方法稱為 ROESY（ Rotating frame Overhause Effect Spectroscopy），由此測得的圖譜稱為 ROESY譜。ROESY 譜的解析方法與 NOESY 相似，同樣 ROESY 譜中的

24、交叉峰并不全都表示空間相鄰的關(guān)系，有一部分則是反映了耦合關(guān)系，因此在解譜時需注意。第28頁/共39頁突出表現(xiàn)NOE效應(yīng)的NOESY譜CHOHOOCH3abcdCHOHOOCH3abcde第29頁/共39頁二維NMR7 7、INADEQUATEINADEQUATE譜 確定1313C- C- 1313C C的連接?？梢愿鶕?jù)已知確鑿的信號開始，根據(jù)相互之間的偶合進行判斷。第30頁/共39頁核磁共振譜圖綜合解析 識別氫譜與碳譜中的溶劑峰與雜質(zhì)峰。 初步分析譜圖，找出特征峰并確定各譜線的大致歸屬。 分析一維1H 譜，根據(jù)譜圖中化學(xué)位移值、耦合常數(shù)值、峰形和峰面積找出一些特征峰，獲得一些最明顯的結(jié)論。 對

25、照13C 質(zhì)子噪聲去偶譜以及各個 DEPT 碳譜，確定各碳原子的級數(shù)。 按照化學(xué)位移分區(qū)的規(guī)律，大致確定各譜線所屬的區(qū)域，如在飽和區(qū)還是在不飽和區(qū)，是否含雜原子、羰基以及活潑氫等。 借助二維核磁共振譜對圖譜作進一步的指認。 解析H -H COSY 譜，從一維譜中已經(jīng)確定的氫譜線出發(fā)找到與之相關(guān)的其它譜線。 解析13C -1H COSY（或 HMQC、HSQC）譜，同樣從已知的氫譜線出發(fā)找到各相關(guān)的碳譜線，以此推斷出這些碳譜線的歸屬。 解析13C -1H 遠程相關(guān)譜（COLOC 或 HMBC），從已確定的碳譜線出發(fā)，找到與之相關(guān)的各氫譜線或從已知的氫譜線出發(fā)找到各相關(guān)的碳譜線，由此完成對一些未知

26、譜線的指認。在二維譜中由于一些相關(guān)峰的強度較弱，在實驗中常常未被檢測到，另外在圖譜中還常常會出現(xiàn)假峰，這些在二維譜的解析中應(yīng)特別注意。第31頁/共39頁第32頁/共39頁核磁共振的基本內(nèi)容核磁共振的基本內(nèi)容第33頁/共39頁核磁共振的基本概念核磁共振的基本概念1、是一種吸收光譜2、樣品（溶液狀態(tài)）置于強磁場中（1-12 Tesler)3、射頻電子波（波長=110Mum）照射4、具有磁性原子核產(chǎn)生核能級躍遷而引起電子波的吸收核磁共振第34頁/共39頁測試NMR的溶劑 NMR溶劑的選擇：不產(chǎn)生干擾信號、溶解性能好、沸點低、與被測樣品不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。N M R s o l v e n t s i g n a l s S o l v e n t