強力腦心康膠囊分析方法驗證方案

1、采用薄層色譜分析法對強力腦心康膠囊的主要成分進行分析方法的研究密環(huán)菌提取物中的肽進行鑒別分析實驗，實驗結果表明此方法專屬性高、重現(xiàn)性、耐用性好，實驗結果準確。強力腦心康膠囊分析方法驗證方案通化吉通藥業(yè)有限公司一、藥材標準1、丹參：本品為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。本品應符合中國藥典2010年版一部70頁“丹參”項下的有關規(guī)定，并以此作為鑒定依據(jù)。2、密環(huán)菌（提取物）：本品為白蘑科真菌蜜環(huán)菌Armillariamellea（vane.ex.Fr.）Quel.經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)分離提取制得的干燥菌粉。本品含多糖以無水葡萄

2、糖（C6H2Q）計，不得低于5.0%,含肽不得低于5.0%。本品應符合化學藥品地方標準上升國家標準（第十三冊）WS-10001-（HD-1224）-2002密環(huán)菌”項下的有關規(guī)定，并以此作為鑒定依據(jù)。3、蜂王漿（凍干粉）：本品工蜂咽下腺和上腭腺分泌的，主要用于飼喂蜂王和蜂已為幼蟲的乳白色、淡黃色或淺橙色漿狀物質。本品應符合中華人民共和國國家標準GB96972008蜂王漿Royaljelly”和中華人民共和國國家標準GB215322008蜂王漿凍干粉Lyophilizedroyaljellypowder”項下的有關規(guī)定，并以此作為鑒定依據(jù)。第1頁共15頁二、強力腦心康膠囊藥品質量標準草案強力腦心

3、康膠囊QiangliNaoxinkangJiaonang本品每粒內(nèi)容物中含丹參以原兒茶醛（C7H6o3）計，不得少于90閨；【處方】丹參1500g蜜環(huán)菌提取液1500g蜂王漿125g制成1000?！局品ā恳陨先?，取丹參75g,粉碎成細粉；剩余丹參粉碎成粗粉，加水煎煮三次，第一、二次各2小時，第三次3小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.30-1.32（70C）的稠膏，減壓干燥，粉碎成細粉；蜜環(huán)菌提取液減壓濃縮至相對密度為1.301.32（70C）的稠膏，減壓干燥，粉碎成細粉，與上述細粉混勻，制成顆粒，干燥；蜂王漿冷凍干燥成細粉后，與上述顆粒混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得?！?/p>

4、性狀】本品為膠囊劑，內(nèi)容物為棕色或棕褐色的顆粒及粉末；味微苦澀?！捐b別】（1）取本品內(nèi)容物1g,加水30ml,超聲處理20分鐘，濾過，濾液加醋酸乙酯20ml、乙醇20ml,振搖提取20分鐘，靜置,分取上清液，濃縮至2ml,作為供試品溶液。另取10-羥基-2-葵烯酸對照品，加無水乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VIB）試驗，吸取上供試品溶液5M、對照品溶液2M,分別點于同一硅膠H薄層板上，以三氯甲烷一甲醇（8:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.2%高鈕酸鉀溶液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。（2）取本品

5、內(nèi)容物1.2g,加乙醴20ml,冷浸1小時，時時振搖，濾過，濾液揮干，殘渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1g,同法制成對照藥材溶液。再取丹參酮HA對照品，加乙酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作為對照第2頁共15頁品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VIB）試驗，吸取上述三種溶液各5仙J分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯一乙酸乙酯（19：1）為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，分別在與對照品及對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。（3）取本品1.5g,加石油醴（60c90C）10ml,密塞，時時振搖，浸漬1小時，濾過，濾液濃縮至約1ml,照薄層

6、色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VIB）試驗，吸取上述溶液5口點樣于硅膠G薄層板上，以石油醴（60C90C）-乙酸乙酯（9：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，在110c10分鐘，立即檢視，應有紫色斑點。（4）取本品1.5g,加甲醇10ml,密塞，時時振搖，浸漬1小時，濾過，濾液濃縮至約1ml,照薄層色譜法（中國藥典2000年版二部附錄VB）試驗，吸取上述溶液5口點樣于硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯（4：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%磷鋁酸乙醇溶液，在110c10分鐘，立即檢視，應有藍色斑點?！緳z查】應符合膠囊劑項下有關的各項規(guī)定（中國藥典2010年版一部附錄

7、IL）o鉛、鎘、神、汞、銅取本品1g,照鉛、鎘、神、汞、銅測定法（中國藥典2010年版一部附錄DCB原子吸收分光光度法或電感耦盒等離子體質譜法）測定，鉛不得過百萬分之五，鎘不得過千萬分之三、種不得過百萬分之二、汞不得過千萬分之二、銅不得過百萬分之二十。重金屬取本品1g,照重金屬檢查法（中國藥典2010年版一部附錄IXE重金屬檢查法）測定，含重金屬不得過百萬分之二十?！竞繙y定】（1）丹參照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VID）測定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇一水一甲酸（18：81.5：0.5）為流動相；檢測波長為280nm。理論板數(shù)按原兒茶醛峰計

8、算應不低于1000。對照品溶液的制備精密稱取原兒茶醛對照品適量，加50%甲醇制成每1ml含30國的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品裝量差異項下的內(nèi)容物，研細，混勻，取1g,精密稱定，第3頁共15頁精密加入水25ml,稱定重量，加熱回流2小時，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取濾液10ml,蒸干，殘渣加50%甲醇溶解并轉移至5ml量瓶中，力口50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10M,注入液相色譜儀，測定，即得。本品每粒含丹參以原兒茶醛(C7H6。3)計，不得少于90四?！竟δ苤髦巍扛纳蒲h(huán)，活血化瘀，安神寧心。用于冠

9、心病、心絞痛、頭痛眩暈、神經(jīng)衰弱?！居梅ㄓ昧俊靠诜淮?粒，一日2次?！疽?guī)格】每粒裝0.3g【貯藏】密封。注：蜜環(huán)菌提取液系白蘑科真菌蜜環(huán)菌Armillariamillea(Vahl.exFr.)Quel,人工液體發(fā)酵的培養(yǎng)液，經(jīng)濃縮濾過的液體。培養(yǎng)條件：將60%體積的培養(yǎng)基汁發(fā)酵罐中，隔水加熱滅菌30分鐘，用壓差法接三級種子與種子罐中，2628c培養(yǎng)46天，轉入發(fā)酵罐中，2628c繼續(xù)培養(yǎng)67天,帶發(fā)酵液變?yōu)樽虾稚?，由稠變稀，部分菌絲開始自溶，菌絲顆粒變碎，pH值降至5.65.2,管內(nèi)亮度開始減弱，即可出罐。發(fā)酵液處理：將發(fā)酵液濾過，收集濾液至貯罐，即得蜜環(huán)菌發(fā)酵液培養(yǎng)液，濃縮至相對密度1

10、.0301.035(20C),即得蜜環(huán)菌提取液。第4頁共15頁強力腦心康膠囊質量標準分析方法驗證摘要概述：強力腦心康膠囊質量標準為“國家藥品標準WS-10947（ZD-0947）-2002-2012Z為滿足產(chǎn)品出口的質量檢驗標準，增加對密環(huán)菌中有效成份多糖與肽進行薄層色譜【鑒別】測定項，并依據(jù)中華人民共和國藥典標準2010版一部附錄X皿A中藥質量標準分析方法驗證指導原則要求，對質量標準中所增加的密環(huán)菌多糖與肽的檢測項進行分析方法驗證。關鍵詞強力腦心康膠囊成品方法學驗證；蜜環(huán)菌提取物多糖的鑒別；蜜環(huán)菌提取物肽的鑒別。驗證目的采用薄層色譜法對密環(huán)菌提取物中的多糖與多肽的鑒別，并確定該檢測方法的重現(xiàn)

11、性、專屬性、耐用性方法依據(jù)中華人民共和國藥典標準2010版一部附錄X叩A中藥質量標準分析方法驗證指導原則實驗設備、儀器與試劑1.1 DHG202®電熱干燥箱1臺、WS2-133-85-2型電熱恒溫水浴鍋1臺、202-0型臺式干燥箱1臺、HHB11-42!電熱恒溫培養(yǎng)箱1臺（上海嘉展儀器設備有限公司）；DT-10M帶光分析天平、TG-328At光分析天平、AG13契電子天平、JD-200多功能電子天平（上海發(fā)瑞儀器科技公司）；SK3200Hp超聲清洗器DS10260S聲波清洗器（上海易凈超聲波清洗機器廠）UV-1型三用紫外分析儀（山東華鵬環(huán)?？萍加邢薰荆￤FZ800-D3A單光束紫外

12、可見分光光度計、QY-20E用紫外分析儀（上海美普達儀器有限公司）XS-810物顯微鏡（寧波永新光學儀器廠）ZH-2自動漩渦混合器、YXQSG46.28人提式煤電兩用消毒器（北京金時速儀器設備經(jīng)營部）Agilent1100高效液相色譜儀（上海伍豐科技有限公司）第5頁共15頁1.2 所用試劑：石油醴、醋酸乙酯、苯、磷金目酸（天津市欣寬福利化工廠）、香草醛（山東安伯化工有限公司）【藥材標準】2.1 丹參：本品為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。本品應符合中國藥典2010年版一部70頁“丹參”項下的有關規(guī)定，并以此作為鑒定依據(jù)。

13、2.2 密環(huán)菌（提取物）：本品為白蘑科真菌蜜環(huán)菌Armillariamellea（vane.ex.Fr.）Quel.經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)分離提取制得的干燥菌粉。本品含多糖以無水葡萄糖（GH12O）計，不得低于5.0%,含肽不得低于5.0%。本品應符合化學藥品地方標準上升國家標準（第十三冊）WS-10001-（HD-1224）-2002“密環(huán)菌”項下的有關規(guī)定，并以此作為鑒定依據(jù)。2.3 、蜂王漿（凍干粉）：本品工蜂咽下腺和上腭腺分泌的，主要用于飼喂蜂王和蜂已為幼蟲的乳白色、淡黃色或淺橙色漿狀物質。本品應符合中華人民共和國國家標準GB96972008”蜂王漿Royaljelly”和中華人民共和國國

14、家標準GB215322008“蜂王漿凍干粉Lyophilizedroyaljellypowder”項下的有關規(guī)定，并以此作為鑒定依據(jù)?！局品ā恳陨先?，取丹參75g,粉碎成細粉；剩余丹參粉碎成粗粉，加水煎煮三次，第一、二次各2小時，第三次3小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.30-1.32（70C）的稠膏，減壓干燥，粉碎成細粉；蜜環(huán)菌提取液減壓濃縮至相對密度為1.301.32（70C）的稠膏，減壓干燥，粉碎成細粉，與上述細粉混勻，制成顆粒，干燥；蜂王漿冷凍干燥成細粉后，與上述顆粒混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得。3密環(huán)菌提取物中多糖的（鑒別）3.1 材料與方法3.1.1 材料

15、3.1.1.1 對照溶液（密環(huán)菌提取物）；3.1.1.2 空白溶液（石油醴）；第6頁共15頁3.1.1.3 陰性樣品（以密環(huán)菌提取物為空白制得樣品）；3.1.1.4 成品：樣品1（）、樣品2（）、樣品3（）;3.1.1.5 硅膠G薄層板，（分別為自制、廠牌1、廠牌2）3.2 樣品制備3.2.1 對照溶液：取密環(huán)菌提取物1g,加石油醴（60C90C）10ml,時時振搖，浸漬1小時，濾過，濾液濃縮至約1ml,作為對照溶液。3.2.2 空白溶液：取石油醴（60C90C）溶液為空白溶液。3.2.3 陰性樣品溶液：取陰性樣品1.5g,加石油醴（60C90C）10ml,時時振搖，浸漬1小時，濾過，濾液濃縮

16、至約1ml,作為陰性供試品溶液。3.2.4 成品樣品溶液：取三個批號的成品樣品顆粒適量，研細，分別精密稱取1.5g,加石油醴（60C90C）10ml,時時振搖，浸漬1小時，濾過，濾液濃縮至約1ml,作為成品供試品溶液。3.3 結果判定3.3.1 對照溶液：照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VIB）試驗吸取上述溶液5口，點樣于竣甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醴（60C90C）-醋酸乙酯（9：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1貼草醛硫酸溶液，在110c10分鐘，立即檢視，應有紫色斑點。3.3.2 空白：在與對照溶液色譜相應的位置上，無斑點呈現(xiàn)；3.3.3 陰性樣品：在與對

17、照溶液色譜相應的位置上，無相同的紫斑點3.3.4 三批成品樣品：在與對照溶液色譜相應的位置上，顯相同的紫色斑點；3.4 方法學驗證內(nèi)容3.4.1 專屬性定義在其他成分可能存在下，如雜質、降解物、添加物（如緩沖液、賦形劑、穩(wěn)定劑）等存在時，采用的方法能正確測定出被測成分的特性。不含被測成份的供試品均不得干擾。在本試驗中，采用標準品溶液、空白溶液、陰性樣品一供試品溶液、成品樣品供第7頁共15頁試品溶液在同一硅膠G薄層板上做斑點顏色對比，其他成份的存在應對其檢測結果無干具體方案取“3.2樣品制備”的各樣品溶液各5口，點樣于竣甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醴（60C-90C）-醋酸乙酯（

18、9：1）為展開劑，展開，取出，晾干,噴以1貼草醛硫酸溶液，在110c10分鐘，立即檢視。判定標準成品樣品的供試品色譜中，在與對照溶液色譜相應的位置上，顯相同的紫色斑點；空白與陰性樣品一的供試品色譜中，在與對照溶液色譜相應的位置上，則無上述斑點呈現(xiàn)；圖譜（照片）標準品空白陰樣一成品1標準品空白陰樣一成品2標準品空白陰樣一成品33.4.2 重復性定義分析方法的重復性是指在同樣的操作條件下，在較短時間間隔的精密度。本試驗中的重復性是對不同批號的樣品進行連續(xù)多次測定，比較測定結果的精密度。具體方案取“3.2樣品制備”的標準品溶液、三批成品供試品溶液各5膜分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醴（60C-9

19、0C）-醋酸乙酯（9：1）為展開劑，展開，取出，晾干,噴以1貼草醛硫酸溶液，在110c10分鐘，立即檢視，應有紫色斑點。以此法，對3批強力腦心康膠囊樣品連續(xù)重復測定3次，比較3次的結果，考察該第8頁共15頁檢測方法的重復性。判定標準對三個批號的強力腦心康膠囊樣品連續(xù)重復測定3次，測定結果應一致，無明顯差異。圖譜標準品成品1成品2成品3標準品成品1成品2成品3標準品成品1產(chǎn)品2成品31次測定二次測定三次修3.5.1耐用性定義在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為把方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。本實驗中的耐用性是對不同廠家的硅膠G薄層板進行連續(xù)多次測定，比較測定結果的耐用性。具體方案取

20、“3.2樣品制備”的標準品溶液、三批成品供試品溶液各5膜分別點于同一個不同廠牌的竣甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醴（60C90C）-醋酸乙酯（9：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，在110c10分鐘，立即檢視，比較3個廠牌的結果，考察該檢測方法的耐用性。判定標準對三個批號的強力腦心康膠囊樣品樣品采用三個廠牌的硅膠G薄層板重復測定3次，測定結果應一致，無明顯差異。圖譜（照片）第9頁共15頁標準品成品1成品2成品3標準品成品1成品2成品3標準品成品1成品2成品3自制廠牌1廠牌23.6 方法學驗證結果專屬性實驗在本試驗中，采用標準品溶液空白溶液與陰性樣品一供試品溶

21、液、成品樣品供試品溶液在同一硅膠G薄層板上做斑點顏色對比，其他成份的存在，對其檢測結果無干擾，空白樣品與陰性樣品沒有相同斑點呈現(xiàn)，其專屬性較高。重復性實驗對3批強力腦心康膠囊樣品連續(xù)重復測定3次，比較3次的結果。試驗結果表明，3次的測定結果一致，無明顯差異。耐用實驗對3批強力腦心康膠囊樣品采用三個廠牌的硅膠G薄層板連續(xù)重復測定3次，比較3次的結果。試驗結果表明，采用三個廠牌的硅膠G薄層板的測定結果無明顯差異。3.7 結論采用薄層色譜分析法對強力腦心康膠囊的主要成分密環(huán)菌提取物中的多糖進行鑒別分析實驗，實驗結果表明此方法專屬性高、重現(xiàn)性、耐用性好，實驗結果準確。3密環(huán)菌提取物中肽的【鑒別】3.1

22、 材料與方法3.1.1 材料第10頁共15頁3.1.1.1 對照溶液（密環(huán)菌提取物）；3.1.1.2 空白溶液（甲醇）；3.1.1.3 陰性樣品（以密環(huán)菌提取物為空白制得樣品）；3.1.1.4 成品：樣品1（）、樣品2（）、樣品3（）;3.1.1.5 硅膠G薄層板，（分別為自制、廠牌1、廠牌2）3.2 樣品制備3.2.1 對照溶液：取密環(huán)菌提取物1g,加甲醇10ml,時時振搖，浸漬1小時，濾過,濾液濃縮至約1ml,作為對照溶液。3.2.2 空白溶液：取甲醇溶液為空白溶液。3.2.3 陰性樣品溶液：取陰性樣品1.5g,加甲醇10ml,時時振搖，浸漬1小時，濾過，濾液濃縮至約1ml,作為陰性供試品

23、溶液。3.2.4 成品樣品溶液：取三個批號的成品樣品顆粒適量，研細，分別精密稱取1.5g,甲醇10ml,時時振搖，浸漬1小時，濾過，濾液濃縮至約1ml,作為成品供試品溶液。3.3 結果判定3.3.1 對照溶液：照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VIB）試驗吸取上述溶液5口，點樣于竣甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯（4：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1名磷鋁酸乙醇溶液，在110C10分鐘，立即檢視，應有藍色斑點。3.3.2 空白：在與對照溶液色譜相應的位置上，無斑點呈現(xiàn)；3.3.3 陰性樣品：在與對照溶液色譜相應的位置上，無相同的藍斑點3.3.4 三批成品樣品：

24、在與對照溶液色譜相應的位置上，顯相同的藍色斑點；3.4 方法學驗證內(nèi)容3.4.1 專屬性定義在其他成分可能存在下，如雜質、降解物、添加物（如緩沖液、賦形劑、穩(wěn)定劑）等存在時，采用的方法能正確測定出被測成分的特性。不含被測成份的供試品均不得干擾。第11頁共15頁在本試驗中，采用標準品溶液、空白溶液、陰性樣品一供試品溶液、成品樣品供試品溶液在同一硅膠G薄層板上做斑點顏色對比，其他成份的存在應對其檢測結果無干擾。具體方案取“3.2樣品制備”的各樣品溶液各5口，點樣于竣甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯（4：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%S鋁酸乙醇溶液，在110c10分鐘，

25、立即檢視。判定標準成品樣品的供試品色譜中，在與對照溶液色譜相應的位置上，顯相同的藍色斑點；空白與陰性樣品一的供試品色譜中，在與對照溶液色譜相應的位置上，則無上述斑點呈現(xiàn)；圖譜（照片）標準品空白陰樣一成品1標準品空白陰樣一成品2標準品空白陰樣一成品33.4.2 重復性定義分析方法的重復性是指在同樣的操作條件下，在較短時間間隔的精密度。本試驗中的重復性是對不同批號的樣品進行連續(xù)多次測定，比較測定結果的精密度。具體方案取“3.2樣品制備”的標準品溶液、三批成品供試品溶液各5膜分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯（4：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%S鋁酸乙醇溶液，在110c10分鐘，立即檢