第3章 吸附層析

1、2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss1第三章第三章 吸附層析吸附層析Absorption chromatographyAbsorption chromatography2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss2 背景資料背景資料1 1 色譜和色譜分析色譜和色譜分析2 2 層析法發(fā)展簡(jiǎn)史層析法發(fā)展簡(jiǎn)史3 3 層析過程和基本概念層析過程和基本概念4 4 層析法分類層析法分類2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss31.1.色譜和色譜分析色譜和色譜分析n色譜法和色譜學(xué)（色譜法和色譜學(xué)（Chromatography），也），也稱色層法或?qū)游龇?。此種方法基于物質(zhì)溶稱色層法或?qū)游龇?。此種方法基于物質(zhì)溶解度、蒸氣壓

2、、吸附能力、立體結(jié)構(gòu)或離解度、蒸氣壓、吸附能力、立體結(jié)構(gòu)或離子交換等物理化學(xué)性質(zhì)的微小差異，使其子交換等物理化學(xué)性質(zhì)的微小差異，使其在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，而當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，組分在兩相間進(jìn)而當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，組分在兩相間進(jìn)行連續(xù)多次分配，從而達(dá)到彼此分離。行連續(xù)多次分配，從而達(dá)到彼此分離。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss42022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss52.2.色譜法發(fā)展簡(jiǎn)史色譜法發(fā)展簡(jiǎn)史nTswett19031903植物葉色素的實(shí)驗(yàn)植物葉色素的實(shí)驗(yàn)n19061906開創(chuàng)了液固色譜法理論開創(chuàng)了液固色譜法理論nKuhn,Ledere

3、r 19311931 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并成功地分離了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并成功地分離了6060多多種色素。種色素。nMartinMartin19401940提出液液色譜分配法提出液液色譜分配法n19411941提出氣液色譜分配法提出氣液色譜分配法nMartinMartin，SyngeSynge 1952 1952出臺(tái)完整的理論及實(shí)踐，并出臺(tái)完整的理論及實(shí)踐，并獲當(dāng)年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。獲當(dāng)年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。nGolayGolay19571957開創(chuàng)開管柱氣相色譜法開創(chuàng)開管柱氣相色譜法2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss6n20 20 世紀(jì)世紀(jì) 505060 60 年代年代氣相色譜為突破口的發(fā)展階段。氣相色譜為突破口的

4、發(fā)展階段。n70 70 年代進(jìn)入高效色譜為代表的現(xiàn)代色譜階段。高壓液相年代進(jìn)入高效色譜為代表的現(xiàn)代色譜階段。高壓液相色譜，高效快速色譜。色譜，高效快速色譜。n75 75 年出現(xiàn)離子色譜。年出現(xiàn)離子色譜。n70 70 年代末，計(jì)算機(jī)進(jìn)入色譜領(lǐng)域，出現(xiàn)計(jì)算機(jī)控制的全年代末，計(jì)算機(jī)進(jìn)入色譜領(lǐng)域，出現(xiàn)計(jì)算機(jī)控制的全自動(dòng)色譜儀自動(dòng)色譜儀n1981 1981 年，杜邦公司生產(chǎn)的能自動(dòng)選擇最佳方案的液相色年，杜邦公司生產(chǎn)的能自動(dòng)選擇最佳方案的液相色譜儀譜儀 “探索者探索者”。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss73.3.色譜過程色譜過程 色譜方法的共同特點(diǎn)：色譜方法的共同特點(diǎn)：色譜分離體系都有流動(dòng)相和固定相

5、兩個(gè)相。色譜分離體系都有流動(dòng)相和固定相兩個(gè)相。 色譜過程中，流動(dòng)相對(duì)固定相作連續(xù)的相對(duì)運(yùn)動(dòng)。色譜過程中，流動(dòng)相對(duì)固定相作連續(xù)的相對(duì)運(yùn)動(dòng)。被分離樣品在兩相中具有不同的作用力，各組分被分離樣品在兩相中具有不同的作用力，各組分混合物在流動(dòng)相的帶動(dòng)下通過固定相，實(shí)現(xiàn)分離?；旌衔镌诹鲃?dòng)相的帶動(dòng)下通過固定相，實(shí)現(xiàn)分離。 樣品在分離時(shí)的兩個(gè)基本點(diǎn)：樣品在分離時(shí)的兩個(gè)基本點(diǎn)：混合物中不同組分在柱內(nèi)的差速遷移?；旌衔镏胁煌M分在柱內(nèi)的差速遷移。同種組分在色譜體系遷移過程中分子分布離散。同種組分在色譜體系遷移過程中分子分布離散。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss84.4.色譜法分類色譜法分類1 1）按兩相物理狀

6、態(tài)分類）按兩相物理狀態(tài)分類n用氣體作流動(dòng)相氣相色譜；用液體作流動(dòng)相用氣體作流動(dòng)相氣相色譜；用液體作流動(dòng)相液相色譜；固定相可以是液體或氣體，便可組合液相色譜；固定相可以是液體或氣體，便可組合成四種主要色譜類型。成四種主要色譜類型。 氣固色譜氣固色譜（gas-solid chromatography，GSC ） 氣液色譜氣液色譜（ gas-liquid chromatography ，GLC ） 液固色譜液固色譜（liquid - solid chromatography ，LSC) 液液色譜液液色譜（ liquid - liquid chromatography ，LLC)2022-5-3海南大

7、學(xué)農(nóng)學(xué)院wss92）按固定相的形態(tài)分類）按固定相的形態(tài)分類柱層析柱層析 (column chromatography) 固定相裝在柱內(nèi)即為層析柱固定相裝在柱內(nèi)即為層析柱, ,根據(jù)層析柱的尺寸，根據(jù)層析柱的尺寸，結(jié)構(gòu)和制備方法不同，分為填充柱層析和毛細(xì)管柱或結(jié)構(gòu)和制備方法不同，分為填充柱層析和毛細(xì)管柱或開管柱層析。開管柱層析。平板層析平板層析(planar chromatography) 固定相呈平板狀，包括薄層層析、薄膜層析和紙層固定相呈平板狀，包括薄層層析、薄膜層析和紙層析。固定相以均勻薄層涂敷在玻璃板、塑料板或有機(jī)析。固定相以均勻薄層涂敷在玻璃板、塑料板或有機(jī)薄膜，或?qū)⒐潭ㄏ嘀苯又瞥杀“鍫?/p>

8、，稱為薄層層析薄膜，或?qū)⒐潭ㄏ嘀苯又瞥杀“鍫?，稱為薄層層析(TLC)，用濾紙作為固定相或固定相載體的層析為紙，用濾紙作為固定相或固定相載體的層析為紙層析層析(PC)。 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss103)3)按分離過程物理化學(xué)原理分類按分離過程物理化學(xué)原理分類吸附層析吸附層析 (absorption chromatography)(absorption chromatography)n 用固體吸附劑作層析的固定相，樣品各組分在吸用固體吸附劑作層析的固定相，樣品各組分在吸附劑上吸附力的大小不同，而將各組分分離。如氣附劑上吸附力的大小不同，而將各組分分離。如氣固吸附層析和液固吸附層析。固吸

9、附層析和液固吸附層析。分配層析分配層析 (partition chromatography)(partition chromatography)n 用液體作固定相，樣品組分（溶質(zhì)）在固定相中用液體作固定相，樣品組分（溶質(zhì)）在固定相中溶解、吸附或吸著能力不同，因而在兩相之間分配系溶解、吸附或吸著能力不同，因而在兩相之間分配系數(shù)不同將樣品組分分離。如氣液分配層析、液液數(shù)不同將樣品組分分離。如氣液分配層析、液液分配層析。在液液分配層析中，根據(jù)流動(dòng)相和固定分配層析。在液液分配層析中，根據(jù)流動(dòng)相和固定相對(duì)極性不同，又分為相對(duì)極性不同，又分為正相色譜正相色譜和和反相層析反相層析。 2022-5-3海南大學(xué)

10、農(nóng)學(xué)院wss11正相分配色譜與反相分配色譜正相分配色譜與反相分配色譜A.正相分配層析正相分配層析 normal phase partition chromatographyn 一般以強(qiáng)極性、親水性物質(zhì)或溶液為固定相，非一般以強(qiáng)極性、親水性物質(zhì)或溶液為固定相，非極性、弱極性或親脂性溶劑為流動(dòng)相，稱極性、弱極性或親脂性溶劑為流動(dòng)相，稱正相層析正相層析（ NPC)。B.反相分配層析反相分配層析 reversed phase partition chromatographyn 以非極性、親脂性物質(zhì)或溶液為固定相，以極以非極性、親脂性物質(zhì)或溶液為固定相，以極性、親水性溶劑或水溶液為流動(dòng)相，稱性、親水性溶

11、劑或水溶液為流動(dòng)相，稱反相層析反相層析（ RPC)。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss12其他層析其他層析離子交換層析離子交換層析 ion-exchange chromatography離子對(duì)層析離子對(duì)層析 ion-pair chromatography凝膠層析凝膠層析 gel chromatography絡(luò)合層析絡(luò)合層析 complexation chromatography親和層析親和層析 affinity chromatography2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss132022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss14操作簡(jiǎn)便、快速、自動(dòng)化操作簡(jiǎn)便、快速、自動(dòng)化效果靈敏、精確效果靈敏、精確2

12、022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss15層析法的優(yōu)點(diǎn)層析法的優(yōu)點(diǎn)n生物大分子的特點(diǎn)：生物大分子的特點(diǎn)：以多樣性，復(fù)雜性的形式存在；以以多樣性，復(fù)雜性的形式存在；以混合物，復(fù)雜的結(jié)構(gòu)形式存在；對(duì)環(huán)境如溫度、混合物，復(fù)雜的結(jié)構(gòu)形式存在；對(duì)環(huán)境如溫度、pH 條條件，離子強(qiáng)度的要求較高。件，離子強(qiáng)度的要求較高。n用于研究的樣品要求：用于研究的樣品要求：一定的質(zhì)和量，保存生物活性和一定的質(zhì)和量，保存生物活性和嚴(yán)格的構(gòu)象。嚴(yán)格的構(gòu)象。n層析法的優(yōu)點(diǎn)：層析法的優(yōu)點(diǎn)：在室溫下操作，流動(dòng)相可以具有與生理在室溫下操作，流動(dòng)相可以具有與生理液相似的液相似的 pH 值，可以為含鹽的緩沖溶液或可與水互溶值，可以為含鹽的緩

13、沖溶液或可與水互溶的有機(jī)溶劑，柱填料的表面經(jīng)各種相應(yīng)化學(xué)修飾和覆蓋的有機(jī)溶劑，柱填料的表面經(jīng)各種相應(yīng)化學(xué)修飾和覆蓋為生物大分子的分離提供了溫和的條件和為生物大分子的分離提供了溫和的條件和 軟接觸軟接觸 ，利于保持其原有的構(gòu)象和生理活性。利于保持其原有的構(gòu)象和生理活性。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss16色譜文獻(xiàn)色譜文獻(xiàn) n專著：專著：色譜技術(shù)叢書色譜技術(shù)叢書，化學(xué)工業(yè)出版社，一套，化學(xué)工業(yè)出版社，一套23本，涵蓋本，涵蓋所有色譜技術(shù)：所有色譜技術(shù)：色譜分析概論色譜分析概論 色譜儀器維護(hù)與故障排除色譜儀器維護(hù)與故障排除色譜定性和定量色譜定性和定量 制備色譜技術(shù)及應(yīng)用制備色譜技術(shù)及應(yīng)用氣相色譜

14、檢測(cè)方法氣相色譜檢測(cè)方法 親和色譜方法及應(yīng)用親和色譜方法及應(yīng)用液相色譜檢測(cè)方法液相色譜檢測(cè)方法 裂解氣相色譜方法及應(yīng)用裂解氣相色譜方法及應(yīng)用氣相色譜方法及應(yīng)用氣相色譜方法及應(yīng)用 色譜手性分離技術(shù)及應(yīng)用色譜手性分離技術(shù)及應(yīng)用高效液相色譜方法及應(yīng)用高效液相色譜方法及應(yīng)用 氣相色譜在石油化工中的應(yīng)用氣相色譜在石油化工中的應(yīng)用平面色譜方法及應(yīng)用平面色譜方法及應(yīng)用 色譜在環(huán)境分析中的應(yīng)用色譜在環(huán)境分析中的應(yīng)用離子色譜方法及應(yīng)用離子色譜方法及應(yīng)用 色譜在食品安全分析中的應(yīng)用色譜在食品安全分析中的應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用 色譜在生命科學(xué)中的應(yīng)用色譜在生命科學(xué)中的應(yīng)用色譜分析樣品處理色譜分

15、析樣品處理 色譜在藥物分析中的應(yīng)用色譜在藥物分析中的應(yīng)用色譜聯(lián)用技術(shù)色譜聯(lián)用技術(shù) 色譜在無機(jī)材料分析中的應(yīng)用色譜在無機(jī)材料分析中的應(yīng)用色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù)2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss17主要期刊與雜志主要期刊與雜志n色譜科學(xué)雜志（色譜科學(xué)雜志（J，Chromatography Sci）1963年創(chuàng)刊年創(chuàng)刊,原原名氣相色譜雜志，名氣相色譜雜志，1969年改為現(xiàn)名，主要發(fā)表氣相、液相原年改為現(xiàn)名，主要發(fā)表氣相、液相原始論文和總結(jié)性文章（英文）和色譜標(biāo)準(zhǔn)圖譜。始論文和總結(jié)性文章（英文）和色譜標(biāo)準(zhǔn)圖譜。n色譜雜志（色譜雜志（J， Chromatograpy）1958年創(chuàng)刊年創(chuàng)刊,系多科性（包系

16、多科性（包括氣相、液相色譜，薄層色譜，紙色譜，離子交換色譜等）括氣相、液相色譜，薄層色譜，紙色譜，離子交換色譜等）國際雜志，刊登各種原始論文及講座性文章，并附有定性、國際雜志，刊登各種原始論文及講座性文章，并附有定性、定量數(shù)據(jù)及色譜文摘，文章以英文、法文或德文發(fā)表，從定量數(shù)據(jù)及色譜文摘，文章以英文、法文或德文發(fā)表，從1993年起分年起分A、B卷發(fā)行，每年還有卷發(fā)行，每年還有Review專輯。專輯。nJouynal of Chromatography Library, 不定期出版。不定期出版。n色層法（色層法（Chromatographia），），1968年創(chuàng)刊，多科性國際雜年創(chuàng)刊，多科性國際雜

17、志，亦稱色譜快報(bào)，文章以英文、法文、或德文發(fā)表，并附志，亦稱色譜快報(bào)，文章以英文、法文、或德文發(fā)表，并附有三種文字的摘要。有三種文字的摘要。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss18n液相色譜雜志（液相色譜雜志（J, of Liquid Chromatography），），1978年創(chuàng)年創(chuàng)刊，主要發(fā)表刊，主要發(fā)表HPLC的研究報(bào)告。的研究報(bào)告。n高分離色譜與色譜通訊（高分離色譜與色譜通訊（J.of High Resolution Chromatography and Chromatography Communication）1978年創(chuàng)刊。年創(chuàng)刊。n色譜色譜，1984年創(chuàng)刊，刊登各種原始論文和綜

18、述，為雙年創(chuàng)刊，刊登各種原始論文和綜述，為雙月刊。月刊。n刊登色譜文章和評(píng)論性文章的還有各種分析化學(xué)相關(guān)的雜刊登色譜文章和評(píng)論性文章的還有各種分析化學(xué)相關(guān)的雜志，如各國的志，如各國的“分析化學(xué)分析化學(xué)”（美、英、日、德等），（美、英、日、德等），Analytical Chemistry；Analytical Chemistry Acta；Journal of Analytical and Applied Pyrolysis。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss19色譜網(wǎng)站色譜網(wǎng)站 (日本島津公司日本島津公司)qhttp:/(瓦里安公司瓦里安公司)qhttp:/www.perkin-(PE公司公

19、司)qhttp:/ 第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析 第二節(jié)第二節(jié) 薄層層析薄層層析 第三節(jié)第三節(jié) 聚酰胺薄膜層析聚酰胺薄膜層析2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss21n吸附柱層析吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相是以固體吸附劑為固定相（床），以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動(dòng)相構(gòu)（床），以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動(dòng)相構(gòu)成柱狀的一種層析方法。成柱狀的一種層析方法。極性：羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁極性：羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁非極性：活性炭非極性：活性炭吸附劑吸附劑2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss22第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術(shù)語一、常用術(shù)語二、基本原理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗

20、脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應(yīng)用實(shí)例六、應(yīng)用實(shí)例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss23一一. .常用術(shù)語：常用術(shù)語：1. 1. 固定相固定相2. 2. 流動(dòng)相流動(dòng)相3. 3. 層析層析4. 4. 操作容量操作容量5. 5. 床體積床體積6. 6. 洗脫體積洗脫體積7. 7. 膨脹度膨脹度8. 8. 分配系數(shù)，遷移率分配系數(shù)，遷移率 固定相固定相流動(dòng)相流動(dòng)相層析層析洗脫體積洗脫體積 Ve床體積床體積 Vt2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss24 1.固定相固定相 固定相固定相是能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸是能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換

21、作用的物質(zhì)。附、溶解和交換作用的物質(zhì)。固定相由層析基質(zhì)組成，基質(zhì)包括固體物質(zhì)固定相由層析基質(zhì)組成，基質(zhì)包括固體物質(zhì)（如吸附劑、離子交換劑）和液體物質(zhì)（如固定在（如吸附劑、離子交換劑）和液體物質(zhì)（如固定在纖維素或硅膠上的溶液）。纖維素或硅膠上的溶液）。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss25 2.流動(dòng)相流動(dòng)相 流動(dòng)相流動(dòng)相是在層析過程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)是在層析過程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)的液體或氣體稱為流動(dòng)相。向一定方向移動(dòng)的液體或氣體稱為流動(dòng)相。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss26 3.層析層析 以基質(zhì)為固定相（柱狀或薄層狀），以液體或以基質(zhì)為固定相（柱狀或薄層狀），以液體或氣

22、體為流動(dòng)相，有效成分和雜質(zhì)在這兩個(gè)相中連續(xù)氣體為流動(dòng)相，有效成分和雜質(zhì)在這兩個(gè)相中連續(xù)多次地進(jìn)行分配、吸附或交換作用，最終結(jié)果是使多次地進(jìn)行分配、吸附或交換作用，最終結(jié)果是使混合物得到分離?；旌衔锏玫椒蛛x。平衡液、洗滌液、洗脫液平衡液、洗滌液、洗脫液2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss27 4.操作容量操作容量 即在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到即在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，一般以每克平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，一般以每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。數(shù)來表示。 2022-5-3海南

23、大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss285.床體積（床體積（Vt） 通常床體積是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所通常床體積是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（占有的體積（Vt）。）。Vt是基質(zhì)的外水體積（是基質(zhì)的外水體積（Vo）和內(nèi)水體積（和內(nèi)水體積（Vi）以及自身體積（）以及自身體積（Vg）的總和。）的總和。即即 VtVo十十Vi十十Vg2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss297.膨脹度膨脹度 在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積，用有的體積，用V表示。即每克溶脹基質(zhì)所具有的表示。即每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積。床體積。6.洗脫體積（洗脫體積（Ve） 洗脫體積

24、是指某一成分從柱頂部到底部的洗洗脫體積是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積。脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)的流動(dòng)相體積。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss308.分配系數(shù)和遷移率分配系數(shù)和遷移率 分配系數(shù)分配系數(shù)是指一組分在固定相與是指一組分在固定相與流動(dòng)相中含量的比值。常用流動(dòng)相中含量的比值。常用K表示。表示。 遷移率遷移率是指一組分在相同時(shí)間內(nèi)，是指一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移動(dòng)距在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離之比值，常用離之比值，常用Rf表示。表示。 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss31外水體積外水體積 VoVo洗脫體積洗脫體積

25、VeVe流流動(dòng)動(dòng)相相固固定定相相層析柱層析柱層析床層析床床體積外水體積基質(zhì)體積內(nèi)水體積床體積外水體積基質(zhì)體積內(nèi)水體積 Vt Vt Vo Vo Vg Vg ViViK 在固定相中的含量在固定相中的含量在流動(dòng)相中的含量在流動(dòng)相中的含量Rf 在固定相中移動(dòng)的距離在固定相中移動(dòng)的距離在流動(dòng)相中移動(dòng)的距離在流動(dòng)相中移動(dòng)的距離2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss32第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術(shù)語一、常用術(shù)語二、基本原理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應(yīng)用實(shí)例六、應(yīng)用實(shí)例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss33二、基

26、本原理二、基本原理 生物大分子在層析柱中與吸附劑顆粒的表生物大分子在層析柱中與吸附劑顆粒的表面吸附位點(diǎn)以范德華引力、靜電引力作用進(jìn)行面吸附位點(diǎn)以范德華引力、靜電引力作用進(jìn)行可逆性結(jié)合。在洗脫劑，流動(dòng)相的作用下，生可逆性結(jié)合。在洗脫劑，流動(dòng)相的作用下，生物大分子通過吸附解吸附再吸附再解吸物大分子通過吸附解吸附再吸附再解吸附的連續(xù)歷程。依據(jù)分子各成份與吸附劑結(jié)合附的連續(xù)歷程。依據(jù)分子各成份與吸附劑結(jié)合力之間的差異而達(dá)到分開。力之間的差異而達(dá)到分開。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss342022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss35例：豬腎二胺氧化酶在羥基磷灰石吸附層析例：豬腎二胺氧化酶在羥基磷灰石吸附

27、層析柱中的分離柱中的分離梯度鹽緩沖液梯度鹽緩沖液雜蛋白雜蛋白 氧化酶氧化酶氧化酶氧化酶雜蛋白雜蛋白鹽析的樣品液鹽析的樣品液吸收值吸收值2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss36關(guān)于吸附層析分離效果的因素關(guān)于吸附層析分離效果的因素n吸附劑的性質(zhì)吸附劑的性質(zhì)n洗脫劑的性質(zhì)洗脫劑的性質(zhì)n層析柱及裝填技術(shù)層析柱及裝填技術(shù)n對(duì)樣品的要求對(duì)樣品的要求n加樣方式及加樣量加樣方式及加樣量n柱效（踏板理論）柱效（踏板理論） 柱長(zhǎng)柱長(zhǎng) L樣品高度樣品高度H踏板理論數(shù)踏板理論數(shù)N 樣品高度樣品高度H柱長(zhǎng)柱長(zhǎng) L2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss37第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術(shù)語一、常用術(shù)語二、基本原

28、理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應(yīng)用實(shí)例六、應(yīng)用實(shí)例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss38三、吸附劑三、吸附劑1.1.吸附劑的選擇吸附劑的選擇n選擇性好選擇性好: : 對(duì)不同物質(zhì)的吸附力的差異性。對(duì)不同物質(zhì)的吸附力的差異性。n表面積大：表面積大：增加吸附容量。增加吸附容量。n性質(zhì)穩(wěn)定：性質(zhì)穩(wěn)定：不與被分離物、洗脫劑及溶劑發(fā)生化不與被分離物、洗脫劑及溶劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)學(xué)反應(yīng), ,不分解不破壞被分離物，在一定范圍的不分解不破壞被分離物，在一定范圍的酸堿，一定的操作壓時(shí)不變形、不破碎。酸堿，一定的操作壓時(shí)不變形、不破碎。n

29、顆粒的大小尺寸適合、均勻、顏色淺、便于觀察。顆粒的大小尺寸適合、均勻、顏色淺、便于觀察。 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss392.常用吸附劑的特點(diǎn)常用吸附劑的特點(diǎn)1）羥基磷灰石：羥基磷灰石：性質(zhì)穩(wěn)定，吸附容量大，適用范性質(zhì)穩(wěn)定，吸附容量大，適用范圍廣。圍廣。2 2）硅膠：硅膠：化學(xué)惰性，吸附容量大?；瘜W(xué)惰性，吸附容量大。n極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。為便于解吸附，的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。為便于解吸附，故在分離極性大的物質(zhì)應(yīng)選擇極性小的吸附劑，故在分離極性大的物質(zhì)應(yīng)選擇極性小的吸附劑，反之亦然。反之亦然。 2

30、022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss402022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss41第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術(shù)語一、常用術(shù)語二、基本原理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應(yīng)用實(shí)例六、應(yīng)用實(shí)例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss42四、溶劑與洗脫劑四、溶劑與洗脫劑n溶劑：溶劑：溶解樣品的溶液。溶解樣品的溶液。n洗脫液：洗脫液：洗脫吸附柱的溶液。洗脫吸附柱的溶液。n通常為相同的成份或同一種組分。通常為相同的成份或同一種組分。n選擇時(shí)，根據(jù)樣品組分的溶解度、吸附劑的性選擇時(shí)，根據(jù)樣品組分的溶解度、吸附劑的性質(zhì)、溶劑

31、的極性方面考慮極性大的洗脫能力大，質(zhì)、溶劑的極性方面考慮極性大的洗脫能力大，因此可先用極性小的作溶劑，使組分易被吸附，因此可先用極性小的作溶劑，使組分易被吸附，然后換用極性大的溶劑作洗脫劑，使組分易從然后換用極性大的溶劑作洗脫劑，使組分易從吸附柱中洗出。吸附柱中洗出。 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss43洗脫劑的性質(zhì)洗脫劑的性質(zhì)n性質(zhì)穩(wěn)定：性質(zhì)穩(wěn)定：不改變吸附劑的性質(zhì)，如溶脹或收不改變吸附劑的性質(zhì)，如溶脹或收縮?？s。n純度高：純度高：防止流動(dòng)相中的雜質(zhì)在吸附柱上的積防止流動(dòng)相中的雜質(zhì)在吸附柱上的積累形成的污染。累形成的污染。n無吸收背景：無吸收背景：提高檢測(cè)的靈敏度。提高檢測(cè)的靈敏度。n低

32、粘度：低粘度：高粘度時(shí)降低溶質(zhì)擴(kuò)散、增加柱壓，高粘度時(shí)降低溶質(zhì)擴(kuò)散、增加柱壓，降低效率。降低效率。n溶解度理想溶解度理想n樣品容易回收樣品容易回收2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss44第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術(shù)語一、常用術(shù)語二、基本原理二、基本原理三、吸附劑三、吸附劑四、洗脫劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應(yīng)用實(shí)例六、應(yīng)用實(shí)例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss45五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作 柱層析的設(shè)柱層析的設(shè)備主要有層析柱、備主要有層析柱、部分收集器、磁部分收集器、磁力攪拌器和恒流力攪拌器和恒流泵。有條件時(shí)，

33、泵。有條件時(shí)，配置一臺(tái)檢測(cè)儀配置一臺(tái)檢測(cè)儀就構(gòu)成一個(gè)完整就構(gòu)成一個(gè)完整的層析系統(tǒng)。詳?shù)膶游鱿到y(tǒng)。詳見下圖見下圖3-4。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss462022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss472022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss482022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss492022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss501 1層析柱層析柱n柱材質(zhì)：柱材質(zhì)：通常是玻璃的通常是玻璃的n柱子的裝填（干裝與濕裝）及大小類型柱子的裝填（干裝與濕裝）及大小類型n吸附層析柱吸附層析柱 d: h 1:10d: h 1:101:40 1:40 ，特殊，特殊的可為的可為4 4：3.63.6。n層析柱的床體積是由吸附劑

34、的量和膨脹度層析柱的床體積是由吸附劑的量和膨脹度決定的。決定的。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss512吸附劑的用量及準(zhǔn)備吸附劑的用量及準(zhǔn)備n吸附劑的用量是根據(jù)其自身的操作容量和分離物吸附劑的用量是根據(jù)其自身的操作容量和分離物中各成分的性質(zhì)所決定。中各成分的性質(zhì)所決定。n當(dāng)操作容量高時(shí)，吸附劑用量少。當(dāng)操作容量高時(shí)，吸附劑用量少。n在裝柱前吸附劑要用溶劑平衡，另外還需作一些在裝柱前吸附劑要用溶劑平衡，另外還需作一些預(yù)處理。預(yù)處理。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss523.3.裝柱裝柱n裝柱裝柱是是最關(guān)鍵最關(guān)鍵的一步。的一步。n重力沉降法裝柱。重力沉降法裝柱。n陸續(xù)不斷地添加糊狀物，使其形成

35、的膠粒床面上陸續(xù)不斷地添加糊狀物，使其形成的膠粒床面上有膠粒連續(xù)有膠粒連續(xù)均勻地沉降均勻地沉降，直至裝柱物完全沉降至，直至裝柱物完全沉降至適當(dāng)?shù)闹搀w積為止。適當(dāng)?shù)闹搀w積為止。 n柱的表面始終要保持著一層溶劑柱的表面始終要保持著一層溶劑( (一般一般l l3cm3cm柱柱高高) )柱的任何一部分絕對(duì)柱的任何一部分絕對(duì)不能不能“流干流干”。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss53加適量溶劑加適量溶劑到柱內(nèi)到柱內(nèi)攪勻攪勻預(yù)先用溶劑浸泡好的預(yù)先用溶劑浸泡好的吸附劑，吸附劑，連續(xù)連續(xù)傾入柱中傾入柱中自然沉降自然沉降至柱高的至柱高的1/41/3時(shí)時(shí)打開柱下端出口打開柱下端出口裝柱（干裝法和濕裝法）裝柱

36、（干裝法和濕裝法）懸浮液徐徐下降至需要的高度懸浮液徐徐下降至需要的高度2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss544.4.平衡平衡 n層析柱正式使用前，必須平衡至所需的層析柱正式使用前，必須平衡至所需的pHpH和離和離子強(qiáng)度，一般用起始緩沖液在恒定壓力下走柱，子強(qiáng)度，一般用起始緩沖液在恒定壓力下走柱，其洗脫體積相當(dāng)于其洗脫體積相當(dāng)于3 35 5倍床體積，使交換劑充倍床體積，使交換劑充分平衡，柱床穩(wěn)定。分平衡，柱床穩(wěn)定。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss555上樣和洗脫上樣和洗脫平衡層析柱平衡層析柱分離樣品的溶液加到固定相表面分離樣品的溶液加到固定相表面樣品液的液面流到固定相表面時(shí)，用滴管加入洗脫

37、劑樣品液的液面流到固定相表面時(shí)，用滴管加入洗脫劑收集收集濃度或活性測(cè)定濃度或活性測(cè)定2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss56(1)(1)層析樣品的要求層析樣品的要求n樣品的溶解度好，樣品中的不溶物在上樣前用離樣品的溶解度好，樣品中的不溶物在上樣前用離心法或過濾法除去。心法或過濾法除去。n加入的樣品量利于提高分辨率；加樣量加入的樣品量利于提高分辨率；加樣量 VtVt VtVt。n樣品的濃度與粘度的考慮。樣品的濃度與粘度的考慮。n一般使其與起始緩沖液有相同一般使其與起始緩沖液有相同pHpH，低的離子強(qiáng)度，低的離子強(qiáng)度和盡可能小的體積。和盡可能小的體積。210112022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss

38、57（2 2）加樣方法）加樣方法 有有3 3種方法可將樣品加到已制備好的柱頂：種方法可將樣品加到已制備好的柱頂：A.A.簡(jiǎn)單的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心簡(jiǎn)單的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液管加樣；地用移液管加樣；2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss58B.B.不需要讓柱流干至床表面，而是加入不需要讓柱流干至床表面，而是加入1 1濃度濃度的蔗糖來增加樣品的密度；的蔗糖來增加樣品的密度；C.C.方法是用一個(gè)毛細(xì)管和一個(gè)注射器或蠕動(dòng)泵把方法是用一個(gè)毛細(xì)管和一個(gè)注射器或蠕動(dòng)泵把樣品直接傳送到柱表面樣品直接傳送到柱表面( (如一些商品柱附有專門如一些商品柱附有專門加樣裝置加樣

39、裝置) )。 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss59(3(3）洗脫）洗脫 洗脫：洗脫：吸附在柱中的混合樣品在洗脫劑的推動(dòng)下不吸附在柱中的混合樣品在洗脫劑的推動(dòng)下不斷發(fā)生溶解（解吸附）、吸附、再溶解、再吸附，斷發(fā)生溶解（解吸附）、吸附、再溶解、再吸附，被吸附的物質(zhì)解吸并隨洗脫劑向前移動(dòng)，又吸附到被吸附的物質(zhì)解吸并隨洗脫劑向前移動(dòng)，又吸附到新的吸附劑上，新流出的洗脫劑又進(jìn)行解吸，如此新的吸附劑上，新流出的洗脫劑又進(jìn)行解吸，如此反復(fù)，各組分的分子結(jié)構(gòu)不同，其吸附能力及溶解反復(fù)，各組分的分子結(jié)構(gòu)不同，其吸附能力及溶解能力的差別，導(dǎo)致移動(dòng)距離的差異，使各種成份形能力的差別，導(dǎo)致移動(dòng)距離的差異，使各種成

40、份形成各自的區(qū)帶，若分離物是有色的，便看見色譜層，成各自的區(qū)帶，若分離物是有色的，便看見色譜層，使樣品得以分離及純化。使樣品得以分離及純化。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss60 圖中的圖中的A A峰和峰和B B峰均呈對(duì)稱形，峰均呈對(duì)稱形，二者沒有重疊，二者沒有重疊，這表明樣品液中這表明樣品液中的組分已完全分的組分已完全分開。開。 層析峰的面積層析峰的面積（FEGFEG）、峰高）、峰高（BEBE）和半峰高）和半峰高寬度（寬度（HIHI）等參）等參數(shù)是定性、定量數(shù)是定性、定量洗脫物的依據(jù)。洗脫物的依據(jù)。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss616.6.流速與分離效果流速與分離效果流速太慢，前峰流

41、速太慢，前峰托尾與后峰相連托尾與后峰相連流速太快，流速太快，組分分不開組分分不開正常的流速使正常的流速使組分完全分離組分完全分離0-1 M(NH4)2SO4梯梯度解吸附氧化酶度解吸附氧化酶2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss62 為了獲得滿意的分離結(jié)果，洗脫液的流速務(wù)為了獲得滿意的分離結(jié)果，洗脫液的流速務(wù)必恰當(dāng)控制。如果太快，洗脫物在兩相中的平衡必恰當(dāng)控制。如果太快，洗脫物在兩相中的平衡過程不完全；如果太慢，洗脫物會(huì)擴(kuò)散。過程不完全；如果太慢，洗脫物會(huì)擴(kuò)散。 流速可以通過調(diào)節(jié)流速可以通過調(diào)節(jié)“操作壓操作壓”來控制，來控制，“操操作壓作壓”相當(dāng)于在柱上部的貯液瓶中溶劑的水平和相當(dāng)于在柱上部的貯液

42、瓶中溶劑的水平和柱出水口位置的水平之差。柱出水口位置的水平之差。 獲得穩(wěn)定流速的另一方法是利用蠕動(dòng)泵把洗獲得穩(wěn)定流速的另一方法是利用蠕動(dòng)泵把洗脫液泵入或泵出柱，并保持穩(wěn)定流速。脫液泵入或泵出柱，并保持穩(wěn)定流速。 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss637.7.分部收集分部收集 8.8.檢測(cè)和合并收集檢測(cè)和合并收集 n為了測(cè)定收集的各部分中各種成分的分布須用一為了測(cè)定收集的各部分中各種成分的分布須用一些能特異地檢測(cè)被分離化合物的方法來進(jìn)行分析，些能特異地檢測(cè)被分離化合物的方法來進(jìn)行分析，一般可用直接或間接方法：一般可用直接或間接方法： n直接法有分光光度法、光折射法、熒光法等。直接法有分光光度法

43、、光折射法、熒光法等。 n間接法包括化學(xué)顯色法、等電聚焦法、電泳法、間接法包括化學(xué)顯色法、等電聚焦法、電泳法、薄層層析法和生物活性測(cè)定法等。薄層層析法和生物活性測(cè)定法等。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss64n洗脫液的合并方法對(duì)目的物質(zhì)量和產(chǎn)量有較大的洗脫液的合并方法對(duì)目的物質(zhì)量和產(chǎn)量有較大的影響。欲得高純度的化合物，一般根據(jù)洗脫峰位影響。欲得高純度的化合物，一般根據(jù)洗脫峰位置收集合并較窄的部分；欲得產(chǎn)量較多目的物，置收集合并較窄的部分；欲得產(chǎn)量較多目的物，則合并較寬部分。則合并較寬部分。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss659.9.層析峰的分析及處理層析峰的分析及處理AB 1 B2 B3

44、A:體積超載體積超載B B ：質(zhì)量超載。：質(zhì)量超載。B1 樣品有沉淀；B2 流動(dòng)相有溶質(zhì)； B3 組分出現(xiàn)結(jié)晶2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss6610吸附劑的再生吸附劑的再生 用過的吸附劑，經(jīng)適當(dāng)方法處理后，又恢復(fù)用過的吸附劑，經(jīng)適當(dāng)方法處理后，又恢復(fù)其性能的過程稱吸附劑的再生。其性能的過程稱吸附劑的再生。 一般不同吸附劑（或基質(zhì)）的再生方法是不一般不同吸附劑（或基質(zhì)）的再生方法是不同的。同的。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss6711.11.最佳加樣量與踏板理論最佳加樣量與踏板理論 踏板理論是把整個(gè)層析柱長(zhǎng)比喻為蒸餾塔（踏板理論是把整個(gè)層析柱長(zhǎng)比喻為蒸餾塔（ L L ），），在某一段柱

45、長(zhǎng)范圍內(nèi)溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間達(dá)到在某一段柱長(zhǎng)范圍內(nèi)溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間達(dá)到平衡，這一段柱長(zhǎng)便相當(dāng)于一個(gè)理論踏板的高度（平衡，這一段柱長(zhǎng)便相當(dāng)于一個(gè)理論踏板的高度（H H）踏板理論數(shù)（）便表示柱內(nèi)溶質(zhì)譜帶的分布。踏板理論數(shù)（）便表示柱內(nèi)溶質(zhì)譜帶的分布。 表示法：表示法：踏板理論數(shù)與踏板理論高度呈反比的關(guān)系。踏板理論數(shù)與踏板理論高度呈反比的關(guān)系。N=LH2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss682022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss69提高踏板理論數(shù)提高踏板理論數(shù)n降低洗脫液的粘度降低洗脫液的粘度n適當(dāng)降低流速適當(dāng)降低流速n提高柱溫提高柱溫n匹配微量分離檢測(cè)技術(shù)匹配微量分離檢測(cè)技術(shù) n選用毛細(xì)

46、管層析柱選用毛細(xì)管層析柱n柱定長(zhǎng)時(shí)加大柱直徑柱定長(zhǎng)時(shí)加大柱直徑n固定相的粒度細(xì)小固定相的粒度細(xì)小n減少上樣的體積減少上樣的體積n較小的樣品分子較小的樣品分子2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss70 程序程序n裝填層析柱裝填層析柱n柱的平衡柱的平衡n加樣加樣n洗脫洗脫n收集收集n鑒定鑒定n繪制洗脫曲線繪制洗脫曲線n合并有效成份合并有效成份n計(jì)算含量（酶活力）計(jì)算含量（酶活力）n基質(zhì)的再生基質(zhì)的再生 注意注意n柱的柱的 d:h=1:101:40n吸附劑用量為樣品的吸附劑用量為樣品的 30 50 倍倍n分析時(shí)的加樣量一般分析時(shí)的加樣量一般 110Vtn 制備時(shí)的加樣量一般制備時(shí)的加樣量一般 12Vt

47、2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss71第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析一、常用術(shù)語一、常用術(shù)語二、基本原理二、基本原理三三 、吸附劑、吸附劑四四 、洗脫劑、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作五、層析柱的制備與層析操作六、應(yīng)用實(shí)例六、應(yīng)用實(shí)例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss72六、應(yīng)用實(shí)例六、應(yīng)用實(shí)例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss732022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss742022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss75內(nèi)容提要內(nèi)容提要 第一節(jié)第一節(jié) 吸附柱層析吸附柱層析 第二節(jié)第二節(jié) 薄層層析薄層層析 第三節(jié)第三節(jié) 聚酰胺薄膜層析聚酰胺薄膜層析2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss76第二節(jié)

48、第二節(jié) 薄層層析薄層層析Thin layer chromatography, TLCn將吸附劑在玻璃或滌綸膠片片基上均勻涂布成將吸附劑在玻璃或滌綸膠片片基上均勻涂布成薄膜或薄板，經(jīng)過活化后，即可對(duì)樣品進(jìn)行展薄膜或薄板，經(jīng)過活化后，即可對(duì)樣品進(jìn)行展層，達(dá)到分離、純化、制備、分析鑒定等目的。層，達(dá)到分離、純化、制備、分析鑒定等目的。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：n展層時(shí)間短展層時(shí)間短 設(shè)備簡(jiǎn)單設(shè)備簡(jiǎn)單 干擾因素小干擾因素小n適合定性及定量研究適合定性及定量研究 靈敏度高靈敏度高 顯色方便。顯色方便。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss77R f值值nR f值為遷移率（值為遷移率（rate of flow, R f）

49、在一定條件下，某種物質(zhì)的在一定條件下，某種物質(zhì)的R f 值是常數(shù)。值是常數(shù)。R f值表示為：值表示為：原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離 原點(diǎn)到溶劑前沿的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離R f =2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss78第二節(jié)第二節(jié) 薄層層析薄層層析一、固定相支持介質(zhì)的選擇一、固定相支持介質(zhì)的選擇 二、操作及注意事項(xiàng)二、操作及注意事項(xiàng)三、應(yīng)用實(shí)例三、應(yīng)用實(shí)例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss79一、固定相支持介質(zhì)的選擇一、固定相支持介質(zhì)的選擇 （一）支持介質(zhì)（基質(zhì)）的性能（一）支持介質(zhì)（基質(zhì)）的性能 就其性質(zhì)，可分為無機(jī)吸附劑就其性質(zhì)，可分為無機(jī)吸附劑( (如氧化鋁、硅藻如

50、氧化鋁、硅藻土、磷酸鈣等土、磷酸鈣等) )和有機(jī)吸附劑和有機(jī)吸附劑( (如硅膠、聚酰胺、纖如硅膠、聚酰胺、纖維素和葡聚糖等維素和葡聚糖等) )。 吸附劑應(yīng)具備的條件：吸附劑應(yīng)具備的條件：(1)(1)純度高、雜質(zhì)少。純度高、雜質(zhì)少。 (2)(2)結(jié)構(gòu)均勻，有一定比表面積。結(jié)構(gòu)均勻，有一定比表面積。 (3)(3)穩(wěn)定而具有一定機(jī)械強(qiáng)度，不與樣品組分和展層劑發(fā)穩(wěn)定而具有一定機(jī)械強(qiáng)度，不與樣品組分和展層劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。生化學(xué)反應(yīng)。 (4)(4)有適當(dāng)?shù)奈侥芰?，容易用展層劑把樣品組分從它的有適當(dāng)?shù)奈侥芰?，容易用展層劑把樣品組分從它的表面解吸下來。表面解吸下來。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss80

51、（二）（二） 支持介質(zhì)的選擇原則支持介質(zhì)的選擇原則 介質(zhì)的選擇應(yīng)從兩方面考慮：介質(zhì)的選擇應(yīng)從兩方面考慮：(1)(1)樣品各組分的性質(zhì)，即它們的溶解性、酸堿性樣品各組分的性質(zhì)，即它們的溶解性、酸堿性及極性大??；及極性大?。?2)(2)支持介質(zhì)的親和能力強(qiáng)弱。支持介質(zhì)的親和能力強(qiáng)弱。 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss812022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss82第二節(jié)第二節(jié) 薄層層析薄層層析一、固定相支持介質(zhì)的選擇一、固定相支持介質(zhì)的選擇 二、操作及注意事項(xiàng)二、操作及注意事項(xiàng)三、應(yīng)用實(shí)例三、應(yīng)用實(shí)例2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss83操作及注意事項(xiàng)操作及注意事項(xiàng)n薄層層析薄層層析操作（以硅膠

52、吸附劑為例）操作（以硅膠吸附劑為例）薄板制備（鋪板）薄板制備（鋪板）點(diǎn)樣點(diǎn)樣展層展層顯顯色色R f值測(cè)定值測(cè)定結(jié)果分析等步驟結(jié)果分析等步驟2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss841.1.吸附劑的選擇吸附劑的選擇n硅膠硅膠n氧化鋁氧化鋁n吸附劑與樣品性質(zhì)的關(guān)系吸附劑與樣品性質(zhì)的關(guān)系2.2.制備薄板、薄層、薄膜制備薄板、薄層、薄膜n薄層的厚度與薄層的厚度與 R Rf f值值n薄層的活性測(cè)定薄層的活性測(cè)定2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss85硅膠的分類硅膠的分類l硅膠型號(hào)很多，其性質(zhì)和組分硅膠型號(hào)很多，其性質(zhì)和組分各不相同各不相同。l硅膠硅膠H系粘性差的純硅膠；系粘性差的純硅膠； 硅膠硅膠G系含系

53、含1015鍛石膏和鍛石膏和5淀粉的硅膠，粘性淀粉的硅膠，粘性好；好； 硅膠硅膠CMC系含有適量的羧甲基纖維素的硅膠；系含有適量的羧甲基纖維素的硅膠； 硅膠硅膠HF254系含有熒光劑的硅膠系含有熒光劑的硅膠H。l硅膠硅膠H能用腐蝕性顯色劑檢測(cè)，而硅膠能用腐蝕性顯色劑檢測(cè)，而硅膠G和硅膠和硅膠CMC則不能用。則不能用。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss861.1.吸附劑的選擇吸附劑的選擇n硅膠硅膠n氧化鋁氧化鋁n吸附劑與樣品性質(zhì)的關(guān)系吸附劑與樣品性質(zhì)的關(guān)系2.2.制備薄板、薄層、薄膜制備薄板、薄層、薄膜n薄層的厚度與薄層的厚度與 R R f f值值n薄層的活性測(cè)定薄層的活性測(cè)定2022-5-3海

54、南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss87n鋪板鋪板 ：（2.5 cm7.5 cm玻板）玻板） 鋪板用的勻漿不宜過稠或過稀。鋪板用的勻漿不宜過稠或過稀。l過稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋；過稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋；l過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。l勻漿配比一般是硅膠勻漿配比一般是硅膠G : 水水=1 : 23，硅膠，硅膠G : 羧羧甲基纖維素鈉水溶液甲基纖維素鈉水溶液=1 : 2。2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss88簡(jiǎn)易涂布簡(jiǎn)易涂布半自動(dòng)涂布半自動(dòng)涂布自動(dòng)涂布自動(dòng)涂布2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss89硅膠薄層薄板的活性測(cè)定硅膠薄層薄板的活性測(cè)定蘇丹黃、蘇丹紅

55、、靛酚藍(lán)在活化蘇丹黃、蘇丹紅、靛酚藍(lán)在活化的薄層薄板上的層析行為的薄層薄板上的層析行為A B C D2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss904.4.展層劑的選擇展層劑的選擇種類：?jiǎn)我蝗軇?、混合溶劑種類：?jiǎn)我蝗軇?、混合溶?要求：要求：*將混合樣品分開將混合樣品分開 * *易揮發(fā)，粘度小，組成簡(jiǎn)單易揮發(fā)，粘度小，組成簡(jiǎn)單 * *對(duì)樣品的定性與定量無干擾對(duì)樣品的定性與定量無干擾 * *毒性小，對(duì)人與環(huán)境安全毒性小，對(duì)人與環(huán)境安全選擇：選擇：選用時(shí)考慮展層劑的極性與溶解度，極性、溶選用時(shí)考慮展層劑的極性與溶解度，極性、溶解度與樣品展層距離呈正比的關(guān)系。解度與樣品展層距離呈正比的關(guān)系。 3.3.點(diǎn)樣點(diǎn)

56、樣2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss91不同展層劑對(duì)物質(zhì)的分離影響不同展層劑對(duì)物質(zhì)的分離影響n咖啡酸與綠原酸在極性不同的咖啡酸與綠原酸在極性不同的展層劑中的分離效果展層劑中的分離效果2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss92單一溶劑極性大小的次序單一溶劑極性大小的次序n石油醚環(huán)己烷二硫化碳四氯化碳苯石油醚環(huán)己烷二硫化碳四氯化碳苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶乙酸丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶乙酸2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss935.展層與顯色展層與顯色展層方式展層方式n上行展開與下行展開上行展開與下行展開n一次展開與二次展開一次展開與二次展開n連續(xù)

57、展開與填補(bǔ)展開連續(xù)展開與填補(bǔ)展開n單向展開與雙向展開單向展開與雙向展開n濃度梯度展開濃度梯度展開n圓心展開圓心展開顯色選擇顯色選擇n特異性顯色劑特異性顯色劑n腐蝕性顯色劑腐蝕性顯色劑n薄板中含熒光素薄板中含熒光素2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss942022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss95n顯色顯色 噴顯色劑顯色噴顯色劑顯色最重要是有好的霧最重要是有好的霧化器?；鳌?022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss962022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss972022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss986.特殊薄層特殊薄層n針對(duì)某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出，有時(shí)針對(duì)某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出，有時(shí)需

58、采用一些特殊薄層。需采用一些特殊薄層。 熒光薄層熒光薄層 絡(luò)合薄層絡(luò)合薄層 酸堿薄層和酸堿薄層和pH緩沖薄層緩沖薄層 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss99 熒光薄層熒光薄層n有些化合物本身無色，在紫外燈下也不顯熒光，又無適有些化合物本身無色，在紫外燈下也不顯熒光，又無適當(dāng)?shù)娘@色劑時(shí)，則可當(dāng)?shù)娘@色劑時(shí)，則可在吸附劑中加入熒光物質(zhì)在吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成熒光制成熒光薄層進(jìn)行層析。薄層進(jìn)行層析。n展層后展層后置于紫外光下照射置于紫外光下照射，薄層板本身顯熒光，而樣品，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點(diǎn)處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒斑點(diǎn)處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質(zhì)多

59、為無機(jī)物。其一是在光物質(zhì)多為無機(jī)物。其一是在254 nm紫外光激發(fā)下顯出紫外光激發(fā)下顯出熒光的，如錳激活的硅酸鋅。另一種為在熒光的，如錳激活的硅酸鋅。另一種為在365 nm紫外光紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光的，如銀激化的硫化鋅等。激發(fā)下發(fā)出熒光的，如銀激化的硫化鋅等。 2022-5-3海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院wss100 絡(luò)合薄層絡(luò)合薄層n常用的有硝酸銀薄層。用來分離碳原子數(shù)相等而其常用的有硝酸銀薄層。用來分離碳原子數(shù)相等而其中中CC雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物，如不飽和醇、雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等。酸等。n其主要機(jī)理是由于不飽和其主要機(jī)理是由于不飽和CC鍵能與硝酸銀形成絡(luò)鍵能與硝酸銀形成絡(luò)合

60、物，而飽和的合物，而飽和的CC鍵則不與硝酸銀絡(luò)合。因此在鍵則不與硝酸銀絡(luò)合。因此在硝酸銀薄層上，化合物可由于飽和程度不同而獲得硝酸銀薄層上，化合物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時(shí)飽和化合物由于吸附最弱而分離。層析時(shí)飽和化合物由于吸附最弱而R f最高，最高，含一個(gè)雙鍵的較含兩個(gè)雙鍵的含一個(gè)雙鍵的較含兩個(gè)雙鍵的Rf值高，含一個(gè)三鍵值高，含一個(gè)三鍵的較含一個(gè)雙鍵的的較含一個(gè)雙鍵的Rf值高。此外，在一個(gè)雙鍵化合值高。此外，在一個(gè)雙鍵化合物中，順式的與硝酸銀絡(luò)合較反式的易于進(jìn)行。因物中，順式的與硝酸銀絡(luò)合較反式的易于進(jìn)行。因此，還可用來分離順反異構(gòu)體。此，還可用來分離順反異構(gòu)體。 2022-5-3海