核酸的提取方法

1、2021/3/231 核酸的提取2021/3/2322021/3/233第一節(jié) 基因組DNA的提取制備基因組DNA是研究的重要步驟Southern分析基因文庫. 大分子量DNA通常要求達(dá)到片段的分子量100-200 kb2021/3/234高純度且完整的RNA用途: Northern分析 mRNA純化 cDNA合成 體外轉(zhuǎn)錄 . 研究基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控的重要環(huán)節(jié)2021/3/2351.核酸的含量2021/3/236一、基本原理基本原理RNA在組織重含量:動物組織：1mg RNA/g 組織植物材料：含量低一些mRNA：15%rRNA：80%tRNA：7%2021/3/2372.核酸的理化性質(zhì)

2、核酸的理化性質(zhì) RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶,DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。 DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑,它們的鈉鹽比游離酸易溶于水,RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 2021/3/238 天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA 時,先把DNP抽提出來,再把P除去,再除去細(xì)胞中的糖,RNA 及無機(jī)離子等,從中分離DNA 。 DNP和RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在

3、低濃度鹽溶液中,幾乎不溶解,如在0.14 mol/L的氯化鈉溶解度最低,僅為在水中溶解度的1%,隨著鹽濃度的增加溶解度也增加,至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大,比純水高2倍。RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小,在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。因此,在提取時, 常用此法分離這兩種核蛋白。2021/3/239 3、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則 分離純化核酸總的原則分離純化核酸總的原則: 應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性; 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。 核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求: 核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的核酸樣品中

4、不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子; 其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度度; 排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。2021/3/2310 核酸制備的關(guān)鍵核酸制備的關(guān)鍵: 1保持低溫（04）,縮短提取過程縮短提取過程 2防止化學(xué)（過酸、過堿）,避免機(jī)械（劇烈攪拌）降解。 3防止核酸酶的作用。 2021/3/23114.核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和抑制劑 降低溫度,改變pH及鹽的濃度,都利于對核酸酶活性的抑制,但均不如利用核酸酶抑制劑更有利,當(dāng)然,幾個條件并用更好。 對于DNA,抑制DNase活力很

5、容易,但防止機(jī)械張力拉斷則更重要。 對于RNA,因分子較小,不易被機(jī)械張力拉斷,但抑制RNase活力較難,故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。2021/3/2312 DNase抑制 加入少量金屬離子螯合劑,如0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉,DNase基本可以全部失活。 去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。2021/3/2313 抑制RNase: （1）實驗器皿高溫,或高壓滅菌,不能高壓滅菌的用具用0.1%二乙基焦碳酸鹽（diethyl pyrocarbonate, DEPC）處理。 （2）加強(qiáng)的蛋白變性劑如硫氰酸胍、異硫氰酸胍等。（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白

6、（RNasin）等RNase的抑制劑。 2021/3/2314 核酸制備中常用的去垢劑核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負(fù)電荷,結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑,一般都是陰離子去垢劑,去垢劑的作用: 1溶解膜蛋白及脂肪,使細(xì)胞膜破裂; 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì),使其解聚,將核酸釋放出來; 3對RNase、DNase有一定的抑制作用。如如:SDS、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉2021/3/2315 核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑 蛋白質(zhì)變性劑的作用蛋白質(zhì)變性劑的作用:

7、 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀使蛋白質(zhì)變性、沉淀,從核酸提取液中分從核酸提取液中分離除去離除去,以防造成蛋白污染。以防造成蛋白污染。 2.使蛋白質(zhì)變性使蛋白質(zhì)變性,故可使核糖體解聚釋放出故可使核糖體解聚釋放出核酸。核酸。 3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性活性和破裂細(xì)胞的作用。和破裂細(xì)胞的作用。 如如:苯酚、氯仿、鹽酸胍、苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC2021/3/2316 核酸制備中常用的酶核酸制備中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶蛋白酶K 溶菌酶溶菌酶 2021/3/23175.核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程I. I.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備II.II.破碎細(xì)

8、胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸沉淀或吸附核酸, ,并去除雜質(zhì)并去除雜質(zhì) V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中2021/3/23181）材料的選擇 動植物中動植物中,小牛胸腺小牛胸腺?動物肝臟動物肝臟?魚類精子魚類精子,植植物種子的胚中都含有豐富的物種子的胚中都含有豐富的DNA新鮮組織或細(xì)胞新鮮組織或細(xì)胞2021/3/2319 2）破碎細(xì)胞）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用） 機(jī)械方法機(jī)械方法:超聲波處理法、研磨法、勻漿法超聲波處理法、研磨法、勻漿法; 化學(xué)試劑法化學(xué)試劑法:用

9、用SDS處理細(xì)胞處理細(xì)胞; 酶 解 法 酶 解 法 : 加 入 溶 菌 酶 或 蝸 牛 酶加 入 溶 菌 酶 或 蝸 牛 酶 , 都 可都 可 使細(xì)胞壁破碎。使細(xì)胞壁破碎。 微生物微生物:溶菌酶、溶菌酶、SDS裂解。裂解。 高等植物高等植物:搗碎器破碎、液氮研磨。搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法酶法:蛋白酶蛋白酶,如胰蛋白酶如胰蛋白酶, 冰凍法冰凍法:反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。 動物動物:液氮處理后用勻漿器破碎。液氮處理后用勻漿器破碎。 細(xì)胞器細(xì)胞器DNA:首先純化細(xì)胞器。首先純化細(xì)胞器。 以上處理時均要同時加入核酸酶抑制以上處理時均要同時加入核酸酶抑制2021/3/

10、2320 3）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)）破碎抽提核酸除去雜質(zhì) 1首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白、與其它成分分離病毒的核蛋白、與其它成分分離 2使核酸與蛋白質(zhì)分離使核酸與蛋白質(zhì)分離 3除去脂類除去脂類 4多糖的除去多糖的除去2021/3/2321 4）核酸的純化）核酸的純化根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核酸污根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核酸污染染,并除去提取過程中的系列試劑并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機(jī)鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)溶劑等）雜質(zhì),最后得到均一的核酸樣品。最后得到均一的核酸樣品。2021/3/2322 5）核酸樣品的保存）核酸樣品的保存 核酸

11、保存的主要條件是核酸保存的主要條件是溫度溫度和和介質(zhì)介質(zhì) 溫度溫度: 4（5）最佳和最簡單）最佳和最簡單 -70是長期保存的良好溫度是長期保存的良好溫度,為一次性保存為一次性保存 -20保存保存 保存介質(zhì)保存介質(zhì): TE緩沖溶液緩沖溶液(最常用最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 水水2021/3/23236.基因組DNA的常用提取方法CTAB法 SDS法 其他2021/3/2324一、基因組DNA-CTAB法（1）CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide,十六

12、烷基三甲基溴化銨）,是一種陽離子去污劑,可溶解細(xì)胞膜,并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液（ Nacl 0.7mol/L ）是可溶的,通過有機(jī)溶劑抽提,去除蛋白,多糖,酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。2021/3/2325CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方（2）試劑的作用Tris-Hcl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞;Nacl提供一個高鹽環(huán)境,使DNP充分溶解,存在于液相中-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除。CTAB溶解細(xì)胞膜,并結(jié)合核酸,使核酸便于分離2021/3/23262021/3/2327 氯仿還可加速有機(jī)相與水相的分層。 異戊醇

13、:抑制界面泡沫的形成。 交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑,更有效去除蛋白質(zhì)。 標(biāo)準(zhǔn)程序:酚酚-氯仿氯仿。2021/3/2328PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物,能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì),有效地去除多酚,減少DNA中酚的污染,同時它也能和多糖結(jié)合,有效去除多糖。2021/3/2329（3）CTAB法流程圖2021/3/2330二、基因組DNA-SDS法 （1）原理 SDS是一種陰離子蛋白質(zhì)變性劑,在高溫(55 -65）條件下能裂解細(xì)胞細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因為陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去污劑使染色體離析,蛋白質(zhì)變性,釋放出核酸。2021/3

14、/2331 提高鹽(KAc或NH4Ac）濃度并降低溫度(冰浴),使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀,離心后除去沉淀。 上清液用酚/氯仿反復(fù)抽提除去蛋白質(zhì),再用乙醇沉淀水相中的DNA。 然后用RNase酶除去RNA即可得到較純的DNA.2021/3/2332 rRNA tRNARnaseProteinase K酚/氯仿mRNA protein 異硫氰酸胍 SDSDNADnaseMg2+1）防止和抑制內(nèi)源Dnase對DNA的降解;只需加入一定濃度的螯合劑如,因為幾乎所有Dnase 都需要Mg2+或Mn2+為輔助因子。DNA提取方法很多,實驗采用酚抽提法。其基本原理是超低溫粉碎,通過蛋白酶K和SDS消化,破碎細(xì)

15、胞,再用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)。2）盡量減少對溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞。在操作過程中盡量減弱溶液的渦旋,動作要輕柔,進(jìn)行DNA溶液轉(zhuǎn)移時用大口吸管。2021/3/2333SDS法DNA提取緩沖液2021/3/2334（2）SDS法流程圖（以動物組織為例）2021/3/2335三、基因組DNA-其他方法 根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有: 物理方式:玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法。 化學(xué)方式:異硫氰酸胍法、堿裂解法。 生物方式:酶法。2021/3/2336根據(jù)核酸分離純化方式的不同有: 吸附材料結(jié)合法: 硅質(zhì)材料 高鹽低PH值結(jié)合膜,低鹽高PH值洗脫?？焖俑咝?。 陰離子交換樹脂 低鹽高PH值結(jié)合核酸,

16、高鹽低PH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。 磁珠 磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物,從而達(dá)到分離目的。2021/3/2337 濃鹽法 利用RNP和DNP在鹽溶液（1M 氯化納中溶解度不同,將二者分離。 有機(jī)溶劑抽提法: 有機(jī)溶劑（苯酚）作為蛋白變性劑,同時抑制核酸酶的降解作用,蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。 密度梯度離心法 利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物0.51.0012 0.14DNP在NaCl中的溶解度2021/3/2338質(zhì)粒DNA的提取 堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法2021/3/2339 細(xì)胞器DNA-差速離心法 線粒體和葉綠

17、體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器,他們的比重和大小一定,因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定,比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降,比重小的卻處于上層,從而得以分離出來。2021/3/2340舉例（提取細(xì)菌的DNA）2021/3/2341一、試驗的實驗試劑及儀器1.試劑溶液I（50mm/L,glucose,25mmol/L,tris0HCl,pH8.0,10mmol/L EDTA）溶菌酶（100mg/ml）,蛋白酶K（10mg/ml）酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）3M醋酸鈉 無水乙醇 含RNaseA（10mg/ml）的TE, LB培養(yǎng)基, 70%乙醇2.儀器超凈工作臺,微量取液器, 高速冷凍離心機(jī),臺式離心機(jī),水

18、浴鍋,冰箱,制冰機(jī),恒溫?fù)u床,漩渦震蕩儀,烘箱,電泳儀2021/3/2342 二、材料、設(shè)備及試劑二、材料、設(shè)備及試劑 菌種菌種 :DBT降解菌 設(shè)備設(shè)備 :eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l), 臺式高速離心機(jī), 渦旋振蕩器 試劑試劑:LB液體培養(yǎng)基 、裂解液（40mMTris-醋酸,20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5M NaCl 、Tris-飽和酚、氯仿、RNA酶A 、無水乙醇 2021/3/2343 三、操作步驟三、操作步驟 1、1.5ml菌液（每組兩管）4 12000rpm離心30sec,棄去上清,倒置試管于吸水紙上吸干。 2、每管

19、加入400l裂解液,用移液槍槍頭反復(fù)抽吸輔助裂解,37 水浴30min。 3、每管加入132l的5M NaCl溶液,顛倒試管,充分混勻后,13000rpm離心15min。用粗口的槍頭（用剪刀剪去1ml槍頭的尖端）小心取出上清液轉(zhuǎn)倒兩支新的eppendorf管中。 4、加入等體積的飽和苯酚/氯仿,充分混勻后,12000rpm離心3min,離心后的水層如混濁則說明仍含有蛋白質(zhì),則需將上清液轉(zhuǎn)入新的試管,重復(fù)上述步驟直到水層透明,水層和酚層之間不再白色沉淀物為止（約2次）。2021/3/2344 5、將上層清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管,加等體積的氯仿,混勻后13000rpm離心3min,除去苯酚

20、。 6、小心吸出上清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管,用預(yù)冷的兩倍體積的無水乙醇沉淀,放置20冰箱30min,然后13000rpm離心15min,可見白色絲狀沉淀物。 7、小心吸出液體,棄上清液,用預(yù)冷的400l 70乙醇洗滌2次,室溫干燥后,用50lTE （含20g/ml的Rnase）溶解DNA,20冰箱放置備用。 2021/3/23452021/3/23462021/3/23472021/3/2348 電泳 瓊脂糖電泳,采用0.8%的瓊脂糖,0.5TBE緩沖液,100V電泳10min,觀察電泳譜帶。2021/3/2349四、實驗的結(jié)果2021/3/2350 材料應(yīng)適量材料應(yīng)適量,過多會影響裂

21、解過多會影響裂解,導(dǎo)致導(dǎo)致DNA量少量少,純度純度低低 針對不同材料針對不同材料,選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式: 植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨 動物組織勻漿或液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨 組培細(xì)胞蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶K 細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠 高溫溫浴時高溫溫浴時,定時輕柔振蕩定時輕柔振蕩2021/3/2351 采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DNA時時,應(yīng)提供相應(yīng)應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系的緩沖體系 采用有機(jī)（酚采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻,但動作但動作要輕柔要輕柔 離心分離兩相

22、時離心分離兩相時,應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 針對不同材料的特點針對不同材料的特點,在提取過程中輔以相應(yīng)的去在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法雜質(zhì)的方法2021/3/2352 當(dāng)沉淀時間有限時當(dāng)沉淀時間有限時,用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀,沉淀會更充分沉淀會更充分 沉淀時加入沉淀時加入1/10體積的體積的NaAc（pH5.2,3M）,有利有利于充分沉淀于充分沉淀 沉淀后應(yīng)用沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌的乙醇洗滌,以除去鹽離子等以除去鹽離子等 晾干晾干DNA,讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長期儲存建議使用若長期儲存建議使用TE緩

23、沖液溶解緩沖液溶解 TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+離子離子,抑制抑制DNase pH值為值為8.0,可防止可防止DNA發(fā)生酸解發(fā)生酸解 2021/3/23531. 1.DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)多糖、多酚類雜質(zhì)2.2.DNADNA在溶解前在溶解前, ,有酒有酒精殘留精殘留, ,酒精抑制后酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)續(xù)酶解反應(yīng)3.3.DNADNA中殘留有金屬中殘留有金屬離子離子1. 1.重新純化重新純化DNADNA, ,去除去除蛋白、多糖、多酚等蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)雜質(zhì)2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA, ,讓酒讓酒精充分揮發(fā)精充分揮發(fā)3.3.增加增加

24、7070乙醇洗滌乙醇洗滌的次數(shù)（的次數(shù)（2-32-3次）次）q問題一問題一: :DNADNA樣品不純樣品不純, ,抑制后續(xù)酶解和抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。 原因原因?qū)Σ卟?021/3/23541. 1.材料不新鮮或反復(fù)凍材料不新鮮或反復(fù)凍融融2.2.未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇烈烈, ,DNADNA被機(jī)械打斷被機(jī)械打斷4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反復(fù)凍融反復(fù)凍融1. 1.盡量取新鮮材料盡量取新鮮材料, ,低溫保存材料避免低溫保存材料避免反復(fù)凍融反復(fù)凍融2.2.液氮研磨或勻漿組織后液氮研磨或勻漿組織

25、后, ,應(yīng)在解凍前應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液加入裂解緩沖液3.3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的的DNADNA時時, ,可增加裂解液中螯合劑可增加裂解液中螯合劑的含量的含量4.4.細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔5.5.所有試劑用無菌水配制所有試劑用無菌水配制, ,耗材經(jīng)高溫耗材經(jīng)高溫滅菌滅菌6.6.將將DNADNA分裝保存于緩沖液中分裝保存于緩沖液中, ,避免避免反復(fù)凍融反復(fù)凍融q問題二問題二: :DNADNA降解降解對對策策 原原因因2021/3/23551. 1.實驗材料不佳或量少實驗材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂

26、解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗滌時洗滌時DNADNA丟失丟失1. 1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材盡量選用新鮮（幼嫩）的材料料2.2.動植物要勻漿研磨充分動植物要勻漿研磨充分; ;G G菌菌、酵母裂解前先用生物酶或、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁機(jī)械方式破壁3.3.高溫裂解時高溫裂解時, ,時間適當(dāng)延長（時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PKPK的用量）的用量）4.4.低溫沉淀低溫沉淀, ,延長沉淀時間延長沉淀時間5.5.加輔助物加輔助物, ,促進(jìn)沉淀促進(jìn)沉淀6.6.洗滌時洗滌時, ,最好用槍頭將洗滌液最好用槍頭將洗滌液吸出吸出, ,勿傾倒勿傾倒q問

27、題三問題三: :DNADNA提取量少提取量少對對策策 原原因因2021/3/2356q問題四問題四:DNA斷裂為小片段斷裂為小片段1.機(jī)械張力或高溫2.細(xì)胞內(nèi)源DNA酶的作用3.化學(xué)因素也會降解DNA如過酸的條件下1.動作輕緩,避免過多的溶液轉(zhuǎn)移,劇烈的震蕩等。同時也應(yīng)避免過高的溫度,所用的槍頭口不能太小(孔徑有5mm左右)。2. 在溶液中加入EDTA,SDS以及蛋白酶等。3. 應(yīng)避免使用過酸的條件。盡量減少酚/氯仿抽提,對對策策 原原因因2021/3/2357思考1簡要敘述酚氯仿抽提體系后出簡要敘述酚氯仿抽提體系后出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。2.沉淀時為什么要用無水乙醇沉淀時為什么

28、要用無水乙醇? 3.為了獲得較為完整的基因組在實驗中應(yīng)注意什么問題?4.加NaCL的作用,為什么要加到1mol/L?2021/3/2358一、質(zhì)粒一、質(zhì)粒(Plasmid) (Plasmid) 的概念的概念: :獨立于染色體外的獨立于染色體外的, ,能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈子。是一種環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子。分子。存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中, ,在細(xì)菌細(xì)胞中最多。在細(xì)菌細(xì)胞中最多。質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid）大小在）大小在1kb200kb之間之間,結(jié)構(gòu)簡單結(jié)構(gòu)簡單,大多大多是具有

29、雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的是具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA分子分子,通常以超螺旋狀態(tài)存在通常以超螺旋狀態(tài)存在于許多細(xì)菌和酵母菌中。于許多細(xì)菌和酵母菌中。第二節(jié) 質(zhì)粒的提取2021/3/23592021/3/2360DNA超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒具有不相容性質(zhì)粒具有不相容性,兩種不同的質(zhì)粒不能共兩種不同的質(zhì)粒不能共存在同一個宿主細(xì)胞中。質(zhì)?？稍诩?xì)胞間存在同一個宿主細(xì)胞中。質(zhì)?？稍诩?xì)胞間傳遞傳遞,其在胞內(nèi)的存在一般對宿主細(xì)胞的代其在胞內(nèi)的存在一般對宿主細(xì)胞的代謝活動無影響。謝活動無影響。2021/3/2361 兩條多核苷酸鏈均保持著完整環(huán)形結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)超螺旋的; 兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu),

30、另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口; 雙鏈斷裂,在體內(nèi),質(zhì)粒DNA是以超螺旋構(gòu)型存在的。二、質(zhì)粒的構(gòu)型:2021/3/2362L構(gòu)型松弛線性的 DNAOC構(gòu)型松弛開環(huán)的 DNASC構(gòu)型共價閉合環(huán)形的超螺旋DNA(cccDNA)連接連接單鏈切割單鏈切割2021/3/2363OC構(gòu)型SC構(gòu)型L構(gòu)型質(zhì)粒電泳一般有三條帶,分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。2021/3/23641. 1. 提純的思路提純的思路 質(zhì)粒的特性:共價、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA 雜質(zhì):蛋白:加蛋白質(zhì)變性劑（酚、氯仿）沉淀蛋白基因組DNA:堿變性+酸復(fù)性,分子量差異導(dǎo)致復(fù)性差異脂類及小分子雜質(zhì)RNA :pH和Rnase三、提取質(zhì)

31、粒的原理2021/3/23652.細(xì)菌裂解的方法: 堿裂解法0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法:10%SDS,一般用于質(zhì)粒大量提取。2021/3/2366 選擇哪一種方法主要取決于以下幾個因素:質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實驗要求2021/3/23673.堿裂解法 質(zhì)粒DNA較染色體DNA小,且具有超螺旋閉合環(huán)狀的特點。 堿變性條件下,染色體DNA雙螺旋解開而變性,而質(zhì)粒DNA部分解開,雙鏈不會完全分離。 pH調(diào)至中性,變性的質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性,呈溶解狀態(tài),離心時留在上清中,而染色體DNA不能復(fù)性,與蛋白質(zhì)一起沉淀。2021/

32、3/2368染色體雙鏈完全分開質(zhì)粒DNA為拓?fù)淅p繞態(tài)不能分開線狀染色體DNA難復(fù)性迅速準(zhǔn)確配對,恢復(fù)天然超螺旋分子染色體、變性蛋白質(zhì)、RNA分子一起沉淀上清中SDS、加溶液II(氫氧化鈉)破壞堿基配對加溶液(醋酸)中和堿性NaOH離心2021/3/23694.煮沸法 染色體DNA比質(zhì)粒DNA大得多。當(dāng)加熱時 ,染色體DNA發(fā)生變性呈長線狀不易復(fù)性,質(zhì)粒DNA雖也變性但在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象。 變性長線狀染色體DNA易與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀,而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中,從而可通過離心將兩者分開。 2021/3/2370四、堿裂解法 包括3個基本步驟: 培養(yǎng)細(xì)

33、菌使質(zhì)粒擴(kuò)增; 收集和裂解細(xì)菌; 分離質(zhì)粒DNA(有時還要求純化質(zhì)粒DNA,根據(jù)實驗所需)2021/3/2371劇烈振蕩新鮮配制1.實驗流程2021/3/23722021/3/23732021/3/2374q對數(shù)期菌體對數(shù)期菌體溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重懸充分重懸溶液溶液IIII裂解裂解上清液上清液抽提抽提離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀質(zhì)粒質(zhì)粒DNA溶液溶液2021/3/2375（一） 細(xì)菌培養(yǎng)與質(zhì)粒擴(kuò)增 1. 挑單克隆E.coli菌株接種到斜面培養(yǎng)基上（活化菌種）,37過夜培養(yǎng) 2. 從斜面培養(yǎng)基上挑E.coli菌株,接種于25毫升液體培養(yǎng)液內(nèi)

34、（含氨芐青霉素）,37振蕩過夜培養(yǎng) 3. 從中取4毫升種子菌液于含M9培養(yǎng)基中（含Ap）,37振蕩培養(yǎng)3-4小時（OD6001.0） 2021/3/2376（二） 質(zhì)粒提取1. 取1.5ml培養(yǎng)物倒入Eppendorf管中,12000r/min,4,30sec2. 吸去培養(yǎng)液,使細(xì)胞沉淀盡可能干燥3. 將細(xì)菌沉淀懸浮于100l預(yù)冷的溶液I中,劇烈振蕩4. 加200L溶液II（新鮮配制）,蓋緊Eppendorf管,快速顛倒5次,混勻內(nèi)容物,將Eppendorf管放在冰上2021/3/23775.加入150L溶液III（冰上預(yù)冷）,蓋緊管口,顛倒數(shù)次使混勻,冰上放置5min 6.12000r/mi

35、n,離心5min,將上清夜轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中 7.向上清夜加入2倍體積乙醇,混勻后,室溫放置5-10min。12000r/min離心5min。倒去上清夜,把Eppendorf管倒扣在吸水紙上,吸干液體 8.用1ml 70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀,振蕩并離心,倒去上清夜,真空抽干或空氣中干燥 9.50L TE緩沖液,使DNA完全溶解（-20保存）2021/3/23782.各種溶液成分和作用 溶液I（溶菌液） 50 mM葡萄糖 25 mM Tris-Cl 10 mM EDTA,pH 8.0; 水浴 pH 8.0 劇烈震蕩 10分鐘 溶液粘稠渾濁2021/3/2379 溶菌酶:它是糖苷水

36、解酶,能水解細(xì)胞壁肽聚糖中的-1,4糖苷鍵。當(dāng)溶液中pH小于8時,溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖:增加溶液的粘度,維持滲透壓,防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA:（1）螯合金屬離子,抑制Dnase的活性（2）EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因為溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。2021/3/2380 溶液II（NaOHSDS液） 0.2 N NaOH 1% SDS; 現(xiàn)配現(xiàn)用 切勿振蕩!顛倒混勻 T5分鐘 SDS包被2021/3/2381 NaOH:當(dāng)5pH9時,核酸是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH12或pH3時,就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1L,p

37、H=12.6,DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS:（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-R-蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制Rnase,必須把它去除干凈,2021/3/2382 溶液III, （3molL NaAc（pH4.8）溶液） 3 M 醋酸鈉 2 M 醋酸2021/3/2383 溶液III 用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液,調(diào)回pH至中性,使質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性,并能穩(wěn)定存在。 而高鹽的3molL NaAc有利于變性染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀。Na+中和

38、核酸上的電荷,減少相斥力而互相聚合,后者是因為鈉鹽與SDS蛋白復(fù)合物作用后,能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物,使沉淀更完全。2021/3/2384五、注意事項五、注意事項1.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備 使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加） 培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力,否則菌體易污染,質(zhì)粒易丟失 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒,如為低拷貝或大質(zhì)粒,則應(yīng)加大菌體用量 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）2021/3/23852.細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解 菌體量適當(dāng)。 培養(yǎng)基去除干凈,同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮。 變性的時間不要過長（5分鐘）,否則質(zhì)粒易被打斷。 復(fù)性時間也不宜過長,否則會有基因組DNA的污染。 G菌、酵母質(zhì)粒

39、的提取,應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理,以破壁。2021/3/23863.核酸分離、純化核酸分離、純化 采用吸附材料吸附的方式分離DNA時,應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻,但動作要輕柔 離心分離兩相時,應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 針對不同材料的特點,在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法2021/3/23874.核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解 當(dāng)沉淀時間有限時,用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀,沉淀會更充分 沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2,3M）,有利于充分沉淀 沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌,以除去鹽離子等 晾干DNA,讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長期儲存建議使用TE緩沖液溶

40、解2021/3/23881. 1.菌體老化菌體老化2.2.堿裂解不充分堿裂解不充分3.3.菌體中無質(zhì)粒菌體中無質(zhì)粒4.4.溶液使用不當(dāng)溶液使用不當(dāng)1. 1.請涂布平板培養(yǎng)后請涂布平板培養(yǎng)后, ,重新挑選重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)2.2.可減少菌體用量或增加溶液可減少菌體用量或增加溶液的用量的用量3.3.不要頻繁轉(zhuǎn)接不要頻繁轉(zhuǎn)接, ,每次接種時應(yīng)每次接種時應(yīng)接種單菌落。檢查抗生素使接種單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。用濃度是否正確。4.4.溶液溶液在溫度較低時可能出在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁現(xiàn)渾濁, ,置于置于3737保溫片刻直保溫片刻直至溶解為清亮的溶液至溶解為清亮的溶液。

41、六、質(zhì)粒六、質(zhì)粒DNA提取常見問題提取常見問題q問題一:未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低,如何解決? 原因原因?qū)Σ卟?021/3/23891. 1.混有蛋白混有蛋白2.2.混有混有RNARNA3.3.混有基因組混有基因組DNADNA1. 1.不要使用過多菌體。重新純化不要使用過多菌體。重新純化DNADNA, ,去除蛋白、多糖、多酚等去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)雜質(zhì)2.2.加入加入RNaseARNaseA室溫放置一段時間室溫放置一段時間3.3.加入溶液加入溶液II II 和和IIIIII后防止劇烈振蕩后防止劇烈振蕩, ,可能把基因組可能把基因組DNADNA剪切成碎片剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。細(xì)菌培養(yǎng)從

42、而混雜在質(zhì)粒中。細(xì)菌培養(yǎng)時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞和時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞和DNADNA的的降解降解, ,培養(yǎng)時間不要超過培養(yǎng)時間不要超過1616小時小時。六、質(zhì)粒六、質(zhì)粒DNA提取常見問題提取常見問題q問題二:質(zhì)粒純度不高,如何解決? 原原 因因?qū)Σ卟?021/3/23901. 簡要敘述溶液、溶液和溶液的作用,以及實驗中 分別加入上述溶液后,反應(yīng)體系出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。2. 染色體DNA與質(zhì)粒DNA分離的主要依據(jù)是什么?2021/3/2391第三節(jié) RNA的提取RNA:tRNA15%,mRNA5%,rRNA80%2021/3/2392RNADNA2021/3/23931.RNA不穩(wěn)定的原因: 特別在堿

43、性條件下很容易通過2-OH形成2、3磷酸二酯（環(huán)）,即使無Rnase存在,RNA在溶液中的穩(wěn)定性也很低。 2-OH,且不需要二價金屬離子的參與。 Rnase為較小的單鏈蛋白（約220AA）,尤其是含有較多的二硫鍵（4對）,10020min不會失活,高壓滅菌也不能使之變性。一、去除Rnase方法2021/3/2394RNA組織（樣品）灰塵實驗器皿試劑人體汗液皮膚手指唾液 Rnase分布廣泛:2021/3/2395RNA器皿和材料器皿和材料塑料器皿（如離心管、Tip頭、eppendorf管）其它不能用高溫烤的材料。0.1%DEPC水37浸泡2小時以上，并經(jīng)高壓滅菌；2021/3/2396RNA玻璃

44、器皿:200干烤6-12 h器皿和材料器皿和材料2021/3/2397RNA加入DEPC至 0.1%濃度然后劇烈振蕩20min或室溫過夜煮沸15min或高壓滅菌以消除殘余的DEPC試試 劑劑 否則DEPC與腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。DEPC是Rnase的化學(xué)修飾劑,它與Rnase的活性基團(tuán)組氨酸咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制Rnase的活性。2021/3/2398RNA根據(jù)實驗特點采用不同方法: 如體外轉(zhuǎn)錄等實驗中加入Rnase的專一抑制劑(Rnasin): 對于RNA的分離制備可采用非特異的蛋白變性劑、蛋白酶K、陰離子去污劑。2021/3/2399 二、實驗原理 細(xì)胞內(nèi)RNA均與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起,并且

45、多以核蛋白的形式存在。 制備RNA時,必須使RNA與蛋白解離,并除去蛋白質(zhì)。 由于RNA的種類來源和存在形式不同,所用的制備方法各異,一般常用的方法有,鹽酸胍法,去污劑法和苯酚法。2021/3/23100異硫氰酸胍/苯酚法（Trizol法）原理a. 裂解細(xì)胞:細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解,同時核蛋白體上的蛋白變性,核酸釋放;b. 沉淀Pro等雜質(zhì):有機(jī)溶劑抽提,交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑,更有效去除蛋白質(zhì)。多糖如何去除多糖如何去除?2021/3/23101q 多糖的去除多糖的去除: : 高鹽法高鹽法: :用乙醇沉淀時用乙醇沉淀時, ,在待沉淀溶液中加入在待沉淀溶液中加入1/21/

46、2體積體積的的5M NaCl5M NaCl, ,高鹽可溶解多糖。高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2(1/2體積體積) ), ,氯苯可氯苯可以與多糖的羥基作用以與多糖的羥基作用, ,從而去除多糖從而去除多糖 。 用用聚乙二醇或異丙醇聚乙二醇或異丙醇代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA。多酚如何去除多酚如何去除2021/3/23102q 多酚的去除多酚的去除: : 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑: :-巰基乙醇、抗巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等壞血酸、半胱

47、氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑加入易與酚類結(jié)合的試劑: :如如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) ), ,它們它們與酚類有較強(qiáng)的親和力與酚類有較強(qiáng)的親和力, ,可防止酚類與可防止酚類與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合q 鹽離子的去除鹽離子的去除: : 7070的乙醇洗滌的乙醇洗滌2021/3/23103如何去除DNA?2021/3/23104c.分離DNA與RNA:釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相,從而得以分離;d. 在與組織/細(xì)胞勻漿后加氯仿分相時,e. 如果pH5.2,則DNA會部分分配在水相, Trizol的成分主要

48、是異硫氰酸胍,-巰基乙醇等RNase的抑制劑+十二烷基肌氨酸鈉等表面活性劑+乙酸飽和酚和pH緩沖成分NaAc,整個試劑的pH在44.5之間原理關(guān)鍵2021/3/23105氯仿的作用:一是作為有機(jī)溶劑變性蛋白,使其沉淀,同時也通過變性作用抑制RNase活性;二是RNA提取試劑中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚）,苯酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,氯仿把水相里參與的苯酚抽提掉;三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)（比如油脂、脂溶性色素等）2021/3/23106d.沉淀RNA,核酸與鈉、鉀、鎂形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶,也不會變性.多糖,蛋白等不沉淀,(一半異丙醇加一半高鹽溶

49、液替代純粹的異丙醇,可以大大降低多糖殘留) 有機(jī)溶劑:乙醇、異丙醇、聚乙二醇。乙醇、異丙醇沉淀核酸的區(qū)別?2021/3/23107 異丙醇0.6V1V就夠了,乙醇需要至少2V,一般需要2.5倍體積。 異丙醇在室溫下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。這可以最大程度的降低鹽的共沉淀降,2021/3/23108多次用75%乙醇洗滌的目的?2021/3/23109洗滌目的洗滌目的: 去除鹽離子去除鹽離子 去除殘存的有機(jī)溶劑和水去除殘存的有機(jī)溶劑和水2021/3/23110超低溫下粉碎;再采用鹽酸胍、酚、氯仿等變性試劑,將蛋白質(zhì)溶解、變性,細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解,核蛋白迅速與核酸分離,并抑制了Rnase活力;超

50、速離心后RNA選擇性進(jìn)入無DNA和蛋白質(zhì)的水相,再用異丙醇沉淀濃縮。2021/3/23111 硅膠膜純化法 DNA,RNA在高鹽低PH的條件下,能吸附到膜表面,低鹽和高PH的條件下DNA,RNA可以被洗脫下來。 2021/3/23112（四）核酸的洗滌（四）核酸的洗滌1）洗滌原理洗滌）洗滌原理洗滌,首先一定要將沉淀懸浮起首先一定要將沉淀懸浮起來來;第二就是要控制一定的時間第二就是要控制一定的時間,尤其是當(dāng)核尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時酸沉淀比較大時 (使核酸沉淀最終蓬松使核酸沉淀最終蓬松);第第三是少量多次三是少量多次;第四則是去上清要徹底。第四則是去上清要徹底。 2021/3/23113差的管子

51、差的管子,液體的掛壁非?？捎^液體的掛壁非常可觀,其殘留量多到其殘留量多到會影響后續(xù)的實驗。避免液體殘余的一個會影響后續(xù)的實驗。避免液體殘余的一個好方法好方法,就是倒掉液體后再短暫離心就是倒掉液體后再短暫離心,將殘液將殘液用移液器吸出。揮發(fā)時去掉的是乙醇用移液器吸出。揮發(fā)時去掉的是乙醇,雜質(zhì)雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。這步是不會被揮發(fā)去除的。這步,切忌用手甩切忌用手甩,這這樣容易將核酸甩掉。樣容易將核酸甩掉。乙醇濃度的選擇也非常重要乙醇濃度的選擇也非常重要,一般情況一般情況,洗滌一洗滌一定要用室溫的定要用室溫的 75% 乙醇。乙醇。 2021/3/23114 （五）核酸的溶解和保存（五）核酸的溶解和

52、保存 1）核酸溶解）核酸溶解:純化后的核酸純化后的核酸,其中其中 RNA 以以水溶解為主水溶解為主,DNA 則多以弱堿性的則多以弱堿性的 Tris 或或者者 TE 溶解。經(jīng)典的溶解。經(jīng)典的 DNA 溶解方法多提倡溶解方法多提倡使用使用 TE 溶解溶解,其中原因是有人認(rèn)為其中原因是有人認(rèn)為 EDTA 可以減少可以減少 DNA 被可能殘留下來的被可能殘留下來的 DNase 降解的風(fēng)險降解的風(fēng)險;如果操作過程控制得當(dāng)如果操作過程控制得當(dāng),DNase 的殘留幾乎是可以忽略的的殘留幾乎是可以忽略的,完全可以直接使完全可以直接使用用 Tris 或者水或者水 (pH 接近接近 7) 溶解溶解 DNA。202

53、1/3/23115）核酸保存）核酸保存:基本上基本上,核酸在保存中的穩(wěn)定性核酸在保存中的穩(wěn)定性,與溫度成反比與溫度成反比,與濃度成正比。一般的我們與濃度成正比。一般的我們選擇選擇,-20 或或70 保存的穩(wěn)定。保存的穩(wěn)定。 如果溫度不合適,保存中核酸發(fā)生降解或者消失,首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解,第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導(dǎo)致的水解 (RNA 在弱酸性更穩(wěn)定,而 DNA 在弱堿性更合適)。 2021/3/23116檢測核酸質(zhì)量的方法,一是電泳,二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小,電泳還可以用于估計核酸的濃度,但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗有關(guān);另外,電泳也可能提供某些雜質(zhì)

54、污染的信息,但是同樣與經(jīng)驗有關(guān)。 紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量, 2021/3/23117RNA的提取步驟的提取步驟 取50-100mg樣品于研缽中 加液氮浸泡并磨成粉末轉(zhuǎn)入1.5ml ep管中,加1 ml Trizol,劇烈振蕩,放置5分鐘加0.2 ml氯仿氯仿,劇烈振蕩15秒,12000 rpm 30秒吸水相于一新1.5ml eppendorf中,加0.5ml 異丙醇異丙醇,于-20放置30min12000 rpm 10分鐘棄上清液,加1ml 75%乙醇乙醇,混合,12000 rpm 2min棄上清液,室溫干燥沉淀,加20100ul水,于-20下貯存。2021/3/23118 RN

55、A的分布2021/3/23119(1)材料材料:（樣品的收集樣品的收集/保存保存 ） 新鮮新鮮,切忌使用反復(fù)凍融的材料切忌使用反復(fù)凍融的材料 如若材料來源困難如若材料來源困難,且實驗需要一定的時間且實驗需要一定的時間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在TRIzol或樣品或樣品貯存液中貯存液中,于于70或或20保存保存 如要多次提取如要多次提取,請分成多份保存請分成多份保存 液氮長期保存液氮長期保存,70短期保存短期保存2021/3/23120（2）樣品破碎及裂解）樣品破碎及裂解: 根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法: 培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞:通常可直接加裂解液裂

56、解通常可直接加裂解液裂解 酵母和細(xì)菌酵母和細(xì)菌:一般一般TRIzol可直接裂解可直接裂解,對于一些特殊的材料對于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁可先用酶或者機(jī)械方法破壁 動植物組織動植物組織:先液氮研磨和勻漿先液氮研磨和勻漿,后加裂解液裂解。期間動后加裂解液裂解。期間動作快速作快速,樣品保持冷凍樣品保持冷凍 樣品量適當(dāng)樣品量適當(dāng),保證充分裂解保證充分裂解 為減少為減少DNA污染污染,可適當(dāng)加大裂解液的用量可適當(dāng)加大裂解液的用量 2021/3/23121 四、四、RNA的提取試劑作用的提取試劑作用 Trizol 異硫氰酸胍異硫氰酸胍:蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑使細(xì)胞結(jié)構(gòu)迅速被破壞,可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白

57、質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失,導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解,核蛋白迅速與核酸分離。 苯酚苯酚:主要作用是裂解細(xì)胞,使細(xì)胞中的蛋白,核酸物質(zhì)解聚得到釋放。 0.1%的8-羥基喹啉可以抑制RNase,與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。2021/3/23122 氯仿氯仿:蛋白質(zhì)變性劑;除去苯酚; 異異 丙丙 醇醇: 沉淀RNA,脫去RNA/DNA分子結(jié)合水;不易揮發(fā),可用75%乙醇洗脫; 75%乙醇乙醇: 除去鹽份及異丙醇和水; 酸性條件酸性條件: RNA游離,DNA和蛋白質(zhì)沉淀;2021/3/23123五、五、RNA的提取質(zhì)量的提取質(zhì)量RNARNA純度和完整性純度和完整性:

58、 OD260/OD280=1.7-2.0; 甲醛變性電泳。 OD260=1,RNA樣品濃度=40ug/mlRNA的保存的保存:在去離子甲酰氨（100%）,-70可放置6個月,用時加入4倍體積乙醇沉淀。2021/3/2312423s最亮,并且亮度是18s的約倍,5s最暗 理論上,完整的 RNA 擁有 28S:18S = 2.7:1 的比例,大部分資料則強(qiáng)調(diào) 28S:18S = 2:1 的比例 2021/3/231252021/3/23126為避免RNA酶污染,提取RNA所有的試劑和用具物品必須是專用的,實驗環(huán)境要清潔;帶手套進(jìn)行操作,并勤換手套;RNA提取過程中應(yīng)在冰上進(jìn)行,以盡可能減少RNA的降解;DEPC嫌疑有致癌作用,操作時要小心。六、RNA提取操作注意事項:RNA2021/3/23127