高效液相色譜培訓(xùn)

1、高效液相色譜培訓(xùn)基本原理和特點(diǎn)液相色譜儀器部件實(shí)驗(yàn)操作與應(yīng)用日常維護(hù)基本原理和特點(diǎn)基本原理：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí),由于與 固定相(stationary phase)發(fā)生作用(吸附,分配,離子吸引,排阻,親和)的大小,強(qiáng) 弱不同,在固定相中滯留時(shí)間不同,從而先后從固定相中流出.特點(diǎn)：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動(dòng)化。一些商品化儀器脫氣裝置 四元泵檢測(cè)器柱溫箱樣品盤(pán)控溫箱流動(dòng)相啟動(dòng)液相色譜儀器的流程 l開(kāi)啟HPLC系統(tǒng)各個(gè)設(shè)備的電源 打開(kāi)泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、檢測(cè)器電源， 待設(shè)備通過(guò)自檢后，打開(kāi)計(jì)算機(jī)啟動(dòng) 色譜管理軟件l準(zhǔn)備流動(dòng)相 過(guò)濾，脫氣l色譜泵

2、排氣 用新配制的流動(dòng)相灌注泵高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 色譜泵自動(dòng)進(jìn)樣器 檢測(cè)器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜的流動(dòng)相液相柱-保留值與pH的關(guān)系 pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流動(dòng)相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6溫度： 50流速： 1.0mL/min.2. 流動(dòng)相類別 按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分 按極性分：極性、弱極性、非極性 按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫 對(duì)溶劑的要求水： 去離子水 自動(dòng)純水儀純凈水 商品瓶裝水 溶劑: 色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，

3、異丙醇）試劑: 分析純不管采用何種途徑，配制流動(dòng)相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時(shí)間越短。 理想的HPLC用水應(yīng)為18.2的超純水，并通過(guò)0.22um的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無(wú)機(jī)離子及空氣等。 l過(guò)濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無(wú)機(jī)鹽配制的緩沖液。l脫氣：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對(duì)測(cè)定的影響： 1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積 2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形 3）檢測(cè)器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng) 過(guò)濾與脫氣過(guò)濾與脫氣流動(dòng)相的保存l有機(jī)溶劑流動(dòng)相： 室溫下密封，避光保存l緩沖鹽流動(dòng)相： 當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用： 低溫下密封保

4、存，一般不超過(guò)3天 防止微生物生長(zhǎng)l有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動(dòng)相： 低溫密封保存 防止有機(jī)相的揮發(fā)l選用適宜的容器1梯度洗脫的特點(diǎn)（1）改善分離, 加快分析速度；（2）改善峰形, 減少拖尾, 有利于痕量組分的檢測(cè)；（3）增加峰容量；（4）強(qiáng)烈滯留的組分不容易殘留在柱上, 保持柱性能長(zhǎng)期良好；（5）下次分析時(shí), 流動(dòng)相需要一段平衡時(shí)間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異, 可能會(huì)引起基線漂移2梯度洗脫的主要條件 A 流動(dòng)相/弱溶劑組成； B 流動(dòng)相/強(qiáng)溶劑組成； 梯度時(shí)間； 梯度曲線：線性、凸型或凹型等。強(qiáng)溶劑 A%time125梯度洗脫123梯度：低壓混合低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端

5、）混合對(duì)脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計(jì)不當(dāng)，梯度的準(zhǔn)確性受影響滯后體積（系統(tǒng)體積）設(shè)計(jì)合理梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無(wú)色譜柱時(shí))滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測(cè)器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意注意滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例閥檢測(cè)器進(jìn)樣器ABCD色譜柱色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度 阻尼器 混合器梯度滯后大小的影響l滯后體積太大會(huì)引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚 2 分鐘響應(yīng)，沒(méi)有問(wèn)題對(duì)微柱色譜影響

6、更大，同上例但流速0.1ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚20 分鐘響應(yīng)，不能接受l滯后體積的不同會(huì)使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會(huì)使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會(huì)導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好l普通分析型液相色譜的滯后體積為24ml滯后體積變化的影響設(shè)計(jì)不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時(shí)間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時(shí)間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)液相色譜的色譜柱色譜柱的連接 Stop_depth長(zhǎng)度不合適造成柱前死體積 錐

7、箍錐度不合適造成滲漏 色譜柱的連接 l除去柱上端固定相變色部分 (約3mm左右)，再補(bǔ)充新的固定相。 l色譜柱吸附未被洗脫成分時(shí)，柱效將明顯下降，選合適的溶劑進(jìn)行洗凈。 l采用梯度洗脫時(shí)，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來(lái)得到再生?？赡芴岣咧У姆椒℉PLC檢測(cè)器應(yīng)提供的功能對(duì)樣品有響應(yīng)并有一個(gè)輸出信號(hào)應(yīng)該提供在檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計(jì)的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系理想的HPLC檢測(cè)器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨(dú)立于流動(dòng)相及操作參數(shù)的響應(yīng)對(duì)壓力、溫度及流速等變化不敏感長(zhǎng)時(shí)間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性靈敏度：信噪比

8、靈敏度是信號(hào)與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測(cè)限（LOD）：S/N = 24定量限（LOQ）：S/N = 810好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性6:1NS吸光度（Absorbance UV/Vis）檢測(cè)目前實(shí)驗(yàn)室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測(cè)器是吸光度檢測(cè)器（其中50%是多波長(zhǎng)，25%是PDA）測(cè)量通過(guò)溶液后的紫外或可見(jiàn)光光強(qiáng)度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測(cè)物的最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)時(shí)靈敏度最大吸光度檢測(cè)器（UV/Vis） 優(yōu)點(diǎn)這種檢測(cè)器簡(jiǎn)單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實(shí)驗(yàn)并且是非破壞性的大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的

9、吸光度一般來(lái)說(shuō)靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabens at 254 nm吸光度檢測(cè)器（UV/Vis） 缺點(diǎn)由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測(cè)器對(duì)某些化合物的檢測(cè)靈敏度不及其他檢測(cè)器樣品中不同化合物的最大吸收波長(zhǎng)不同時(shí)，需要使用多波長(zhǎng)檢測(cè)，或使用折衷的波長(zhǎng)受流動(dòng)相組成的影響：用截止波長(zhǎng)以上至少510nm作為工作波長(zhǎng)緩沖鹽、離子對(duì)試劑、胺改性劑也會(huì)有影響背景吸收對(duì)紫外檢測(cè)器噪音的影響UV Spectrum of Eluents with 0.1% TF

10、A Against HPLC Grade H2O BlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20 with 0.1% TFA50% ACN with 0.1% TFA溶劑混合的基線噪音色譜條件色譜柱：C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C.流動(dòng)相： A: 0.1% TFA in Water.B: 0.1% TFA in Acetonitrile.梯度： 5

11、 - 40% B in 35 min.流速： 1.0 mL/min.樣品： 水（10 L inj. vol.）檢測(cè)： 214 nm 圖1；好的梯度系統(tǒng) 圖2；一般的二元梯度系統(tǒng) 圖3；一般的四元梯度系統(tǒng)為何如此重要？五個(gè)小肽的5ng進(jìn)樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，第一個(gè)峰則消失在基線噪音中?；€噪音對(duì)積分的影響1.2241.1831.183Caffeine 271 nm維護(hù)流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過(guò)濾器進(jìn)樣器檢測(cè)器吸濾頭定期清洗，更換溶劑時(shí)單向閥定期清洗，壓力波動(dòng)大時(shí)泵自動(dòng)清洗在線過(guò)濾器壓力大時(shí)清洗材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣

12、泡生成措施：用5稀硝酸，超聲波清洗， 再用蒸餾水清洗吸濾頭吸濾頭故障：寶石球或塑料墊片受污導(dǎo)致密封不好表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動(dòng)大措施：打開(kāi)排液閥，以異丙醇為流動(dòng)相輸液拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波清洗單向閥單向閥故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動(dòng)大或壓力 偏高措施：5稀硝酸，超聲波清洗判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開(kāi)出口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力3kgf/cm2，則堵塞。線路過(guò)濾器線路過(guò)濾器排液閥壓力傳感器線路過(guò)濾器流動(dòng)相泵的保養(yǎng)：使用流動(dòng)相盡量要清潔；進(jìn)液處的砂芯過(guò)濾頭要經(jīng)常清洗；流動(dòng)相交換時(shí)要防止沉淀； 避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染；柱的保養(yǎng)：柱子在

13、任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)；當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動(dòng)相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測(cè)定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)清洗柱；若分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時(shí)間單次樣品運(yùn)行時(shí)間單次樣品運(yùn)行時(shí)間 = 分析時(shí)間分析時(shí)間 + 色譜柱平衡時(shí)間色譜柱平衡時(shí)間色譜柱平衡時(shí)間色譜柱平衡時(shí)間 = 10倍柱內(nèi)體積倍柱內(nèi)體積 流速流速4.6 x 500.5 mL5 min4.6 x 300.3 mL3 min4.6 x 150.15 mL1.5 min4.6 x 1501.54 mL15 min2.1 x 500.10 mL5 min60 sec2.1 x 300.06 mL3 min36 sec2.1 x 150.03 mL1.5 min18 sec色譜柱色譜柱柱內(nèi)柱內(nèi) 平衡時(shí)間平衡時(shí)間 尺寸尺寸體積體積 流速流速(mm)(Vm) 1.0 mL/min色譜柱色譜柱柱內(nèi)柱內(nèi) 平衡時(shí)間平衡時(shí)間 尺寸尺寸體積體積 流速流速(mm)(Vm)