HepG2細胞培養(yǎng)方法

1、HepG2細胞培養(yǎng)方法細胞復(fù)蘇：材料：HepG2細胞、RPMI-1640、胎牛血清、PS（青霉素+鏈霉素）35cm細胞培養(yǎng)瓶、消毒的羅口離心管、消毒的吸管、水浴箱、計時器、離心機、光學(xué)顯微鏡試劑配制：100ml完全培養(yǎng)基：90mlRPMI-1640+10ml胎牛血清+1支PS,4°C保存步驟：1. 羅口離心管加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基3ml.o2. 從液氮罐中取出細胞凍存管，迅速置37C水浴1min至融化。3. 打開凍存管，吸取細胞懸液至離心管，輕輕混勻。4. 800rpm離心5min,棄上清。5. 細胞沉淀中加入4ml完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入35cm培養(yǎng)瓶37C常規(guī)培養(yǎng)，第二天觀察細

2、胞生長情況。細胞傳代與換液：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、35cm細胞培養(yǎng)瓶、消毒的羅口離心管、消毒的吸管、水浴箱、計時器、離心機、光學(xué)顯微鏡試劑配制：100ml終止液：90mlRPMI-1640+10ml小牛血清+1支PS，4C保存步驟：1. 對數(shù)增長期匯合度80%-90%的細胞可以傳代，4mlPBS清洗兩次。2. 加入0.25%胰酶1ml,37C孵育5min。3. 加入3ml終止液，吹打細胞使其脫落并單個化，再移至羅口離心管。4. 離心5min,800rpm，棄上清。5. 羅口離心管加入完全培養(yǎng)基，混勻后分瓶培養(yǎng)。6. 細胞隔日可以用PBS

3、清洗后更換培養(yǎng)基。細胞凍存：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、PBS、PS、35cm細胞培養(yǎng)瓶、消毒的羅口離心管、消毒的吸管、消毒的凍存管、水浴箱、計時器、離心機、過濾器、光學(xué)顯微鏡試劑的配制：10ml凍存液：7ml完全培養(yǎng)基+2ml胎牛血清+1mlDMSO,混勻后過濾，4C保存步驟：1. 去除培養(yǎng)瓶中舊的培養(yǎng)基，加入4mlPBS清洗兩次。2. 混勻胰酶，每瓶加入1ml,37C孵育5min。3. 每瓶加入3ml終止液，反復(fù)抽打細胞使其脫落并單個化，移至羅口離心管。4. 800rpm離心5min,棄上清。5. 每管加入1ml凍存液，混勻細胞

4、，移至凍存管中。將細胞凍存管放于-20C保存2hrso6. 細胞凍存管-80C過夜。7第二天轉(zhuǎn)入液氮中保存。細胞種板：材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、35cm細胞培養(yǎng)瓶、六孔板、消毒的羅口離心管、消毒的吸管、水浴箱、計時器、離心機、光學(xué)顯微鏡、細胞計數(shù)器步驟：1. 將匯合度為80%-90%的HepG2細胞加入4mlPBS清洗兩次。2. 加入1ml已混勻好的胰酶消化，37°C孵育5min。3. 培養(yǎng)瓶中加入終止液3ml，反復(fù)吹打使其脫落并單個化，細胞懸液轉(zhuǎn)移至羅口。4. 800rpm離心5min,棄上清。5. 加入6.5ml完全培養(yǎng)基，充

5、分混勻細胞，取15ul細胞懸液進行細胞計數(shù)，要求六孔板約5*106-1*106/孔。6. 將6ml細胞懸液轉(zhuǎn)入六孔板，每孔1ml，輕輕搖勻懸液，使其均勻完全覆蓋，37C繼續(xù)培養(yǎng)。軟脂酸和炎癥因子處理HepG2細胞：材料：RPMI-1640、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、甲醇、PBS、PS、軟脂酸(SIGMAP9767)、TNF-a、BSA消毒的羅口離心管、消毒的吸管和EP管、過濾器、光學(xué)顯微鏡、測量計、過濾器試劑配制：1. BSA培養(yǎng)液：儲存液：稱取1gBSA溶于10mlRPMI-1640，混勻后過濾，4C保存工作液：一瓶RPMI-1640加入2mlBSA儲存液和一支PS,即濃度為0.2%,4

6、C保存2. 軟脂酸儲存液：稱取13.92mg軟脂酸(分子量278.41)溶于1ml甲醇，即濃度為0.05mmol/ml,37C水浴助溶，分為5份分裝于EP管，-20C保存3. TNF-a儲存液：稱取10ngTNF-a溶解于1mlPBS，及濃度為10ng/ml，分為10份分裝于EP管，-20C保存步驟：1. 低倍顯微鏡觀察六孔板里細胞狀態(tài)，保證無污染，無雜質(zhì)，匯合度為70%-80%的細胞才可以進行下一步實驗。2. 六孔板里的細胞加入1mlPBS清洗，每孔加入1ml0.2%BSA的RPMI-1640，繼續(xù)無血清培養(yǎng)24hrs。3. 不同濃度軟脂酸處理細胞24hrs。(每組三個復(fù)孔)(1) 對照組：

7、用1mlPBS清洗后，每孔1mlBSA繼續(xù)培養(yǎng)。(2) 0.02mmol/Lpalmitate:1.2ul軟脂酸儲存液+2998.8ulBSA,每孔1ml。(3) 0.04mmol/Lpalmitate:2.4ul軟脂酸儲存液+2997.6ulBSA,每孔1ml。(4) 0.08mmol/Lpalmitate:4.8ul軟脂酸儲存液+2995.2ulBSA,每孔1ml。(5) 0.16mmol/Lpalmitate:9.6ul軟脂酸儲存液+2990.4ulBSA,每孔1ml。(6) 0.32mmol/Lpalmitate:19.2ul軟脂酸儲存液+2980.8ulBSA，每孔1ml。4. 不同

8、濃度TNF-a處理細胞24hrs。(每組三個復(fù)孔)(7) 對照組：每孔1mlBSA繼續(xù)培養(yǎng)。(8) 5ng/mlTNF-a:1.5ulTNF-a儲存液+2998.5ulBSA，每孔1ml。(9) 10ng/mlTNF-a:3ulTNF-a儲存液+2997ulBSA，每孔1ml。(10) 20ng/mlTNF-a:6ulTNF-a儲存液+2994ulBSA,每孔1ml。(11) 40ng/mlTNF-a:12ulTNF-a儲存液+2988ulBSA,每孔1ml。Trizol法提取細胞總RNA流程材料：1. RNAisoReagent:購于Taraka（貨號：D312）,100ml2. 氯仿、異丙

9、醇、無水乙醇：國產(chǎn)分析純3. 0.1%DEPC-H2O、PBS、75%乙醇4. DEPC處理的EP管、滴頭、50ml離心管，5ml注射器、計算器、低溫離心機、冰盒材料的去RNA酶化：10.1%DEPC水配好的DEPC水過夜滅活，高壓蒸汽滅菌，2. EP管、滴頭、離心管用0.1%DEPC水浸泡過夜，高壓蒸汽滅菌，3. 75%乙醇：75ml無水乙醇+25ml0.1%DEPC水。4. 新購買的異丙醇分裝于DEPC處理的50ml離心管，4°C保存步驟：1. 吸出培養(yǎng)基，PBS清洗一次；2. 向100ml培養(yǎng)瓶（6孔板中2孔）加入1mlRNAisoReagent，水平放置片刻，使裂解液均勻分布

10、于細胞表面并裂解細胞，然后使用移液槍吹打細胞使其脫落（約30次）；將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管，移液器反復(fù)吹打（推薦用5ml注射器抽打10次）；3. 室溫靜置5min后加入氯仿200ul（RNAisoReagent：氯仿=1ml:200ul）,用力震蕩后，室溫靜置5min，待分層后離心，12000g，4C，15min；4. 取80%無色上清液至另一干凈1.5mlEP管（切忌吸出白色中間層），加入400ul異丙醇（異丙醇應(yīng)與上清體積比為1:1），充分混勻后，靜置10min；5. 12000g，4C,離心10min，此時管底可見沉淀；6. 小心棄上清液，緩慢沿管壁加入75%乙醇1ml，輕輕上下顛

11、倒使沉淀飄起，12000g,4C,離心5min，小心棄乙醇，可離心數(shù)秒后將殘液吸走；7. 室溫靜置2-5min，干燥RNA；8. 加入DEPC-H2O30或40ul溶解RNA，-80C保存。RNA濃度的標化：吸取4ulRNA+196ulDEPC水稀釋50倍在分光光度計上測算樣品的濃度，記好A260、Con（ug/ml）和A260/A280，原始濃度為測量濃度*50（A260和Con換算為Con:A260=40,A260/A280為1.6-2.0，線性范圍最好），標化的方法是以最低濃度的一個樣品為標準進行標化，標化10ulRNA，計算各個樣品加DEPC水量，做RT時RNA加樣量為X（0.5ug/

12、原始濃度*1000）ul。RT-PCR材料：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARADRR047A）、PCR試劑盒（TAKARADRR081A）PCR水（滅菌蒸餾水）、去RNA酶的200ul離心管、PCR8連管、計時器、水浴箱逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20ul(1)基因組DNA的除去反應(yīng)。5*gDNAEraserBuffergDNAEraserRNaseFreedH2OTotalRNA42°C2min水浴，4°C保存(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。5*PrimeScriptBuffer2PrimerScriptRTEnzymeMIX1RTPrimerMIX42ul1ul(10-2-1-X)ulXul4ul1ul1ul4ulRNaseFreedH2O37C15minf85°C5sec（PCR儀反應(yīng)，約16min，迅速轉(zhuǎn)入一20C保存）PCR反應(yīng)體系為25ulSYBRPremixEXTaqII12.5ul上游引物0.25ul下游引物0.25ulPCR水10ulcDNA2ul*無論做RT還是PCR應(yīng)先將按樣品數(shù)計算每種試劑