實驗電子教案酪氨酸酶的提取及其酶促反應動力學研究

1、 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 1實驗實驗4- -電子教案電子教案酪氨酸酶的提取及其酶促反應酪氨酸酶的提取及其酶促反應動力學研究動力學研究 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 2 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 3一、實驗目的一、實驗目的二、實驗原理二、實驗原理 三、儀器和試劑三、儀器和試劑 四、實驗步驟四、實驗步驟五、注意事項五、注意事項 六、結果和討論六、結果和討論 化學化工學院2005-11 C

2、omprehensive Chemical Experiments 4q 認識生物體中酶的存在和催化作用認識生物體中酶的存在和催化作用q 了解酶促反應的特點了解酶促反應的特點q 初步了解最小二乘法的基本思想，學會利用最小初步了解最小二乘法的基本思想，學會利用最小二乘法對實驗數據進行簡單處理二乘法對實驗數據進行簡單處理 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 5q 酶的本質：酶的本質： 生物細胞合成的、對特定底物生物細胞合成的、對特定底物（Substrate)起高效起高效催化作用的蛋白質，是生物催化劑催化作用的蛋白質，是生物催化劑酶化學組

3、成單純酶結合酶蛋白質蛋白質+輔助因子結合松弛結合緊密輔酶輔基 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 6q 酶的特點：酶的特點： 主要成分主要成分蛋白質，是生物催化劑蛋白質，是生物催化劑 活化能較低活化能較低 催化效率高催化效率高 高度的專一性高度的專一性 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 7q 酪氨酸酶催化酪氨酸酶催化 多巴多巴(DOPA) 的氧化反應的氧化反應： HOO2O2OOOOONH2COOHO2NH2NHCOOHCOOHHOHO-CO2O2HHHOHOHOHOO

4、NHOONH2COOHNHNHNHCOOHOO多 巴O2, 酶多 巴 醌多 巴 紅二 羥 基 吲 哚吲 哚 醌黑 色 素酶無 色快快快快快慢HN 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 8q 酶促反應的過程及處理：酶促反應的過程及處理：E + Sk1k2ESP + Ek3q 米氏方程及米氏常數：米氏方程及米氏常數：當當K2 K3 時，米氏常數時，米氏常數Km可看成是可看成是 ES 的離解常數，也可以作為衡量酶與其底物的離解常數，也可以作為衡量酶與其底物結合力的尺度，結合力的尺度，Km值越大，表示酶與其底物的結合力越小，反之，則越大。對每

5、值越大，表示酶與其底物的結合力越小，反之，則越大。對每一個酶一個酶 - 底物體系來說，底物體系來說，Km是一個特征值，它與酶的濃度無關，但與是一個特征值，它與酶的濃度無關，但與pH、溫度及、溫度及其他外在因素有關。其他外在因素有關。Km的物理意義是：當酶促反應速率達到最大反應速率一半時的物理意義是：當酶促反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度，單位是的底物濃度，單位是mol/L。 max03SkSVSkSEkVmmi 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 9q 最小二乘實驗數據擬合：最小二乘實驗數據擬合： 以線性模型以線性模型y y

6、 = = ax+bax+b 為例：為例：為確定回歸系數為確定回歸系數a和和b，通常采用最小二乘法，即要使，通常采用最小二乘法，即要使Q=yI - (axI+b)2達到最小。達到最小。根據極值原理，根據極值原理，a與與b應滿足下列方程：應滿足下列方程： 102niaQyI - (axI+b)（-xI）=0 yI - (axI+b)（-1）=0 102nibQ 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 10q 最小二乘實驗數據擬合：最小二乘實驗數據擬合： 數據擬合處理工具：數據擬合處理工具： Excel 電子表格電子表格回歸回歸 規(guī)劃求解計算

7、示例規(guī)劃求解計算示例Origin注：本實驗公共電子郵箱注：本實驗公共電子郵箱 pei- 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 11分光光度計，離心機，研缽，水浴，秒表。分光光度計，離心機，研缽，水浴，秒表。pH = 6.8的磷酸鈉緩沖溶液；的磷酸鈉緩沖溶液；1 - 多巴（左旋多巴，二羥基苯丙多巴（左旋多巴，二羥基苯丙胺酸）溶液（胺酸）溶液（ 10 mmol/L）；銅試劑（二乙基二硫代氨基甲酸）；銅試劑（二乙基二硫代氨基甲酸鈉），用緩沖液配置成鈉），用緩沖液配置成10-3 mol/L；土豆（或蘋果）。；土豆（或蘋果）。 化學化工學院20

8、05-11 Comprehensive Chemical Experiments 12土豆或蘋果（12.5 g）緩沖溶液25 mL用力研磨酶提取物離心分離酶提取物清液475 nm, 1 cm比色皿酶催化多巴氧化反應動力學475 nm, 1 cm比色皿銅試劑抑制劑的影響最小二乘數據擬合米氏常數及最大反應速率 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 13本實驗測定速率本實驗測定速率反應初速率（反應初速率（1 min時的平均速率）時的平均速率）注意：掌握操作時間注意：掌握操作時間溶液的配制溶液的配制采用緩沖溶液為溶劑采用緩沖溶液為溶劑注意：防止多巴氧化注意：防止多巴氧化了解酶催化反應的特點了解酶催化反應的特點觀察實驗現象觀察實驗現象注意：反應溫度的控制和酶的加入注意：反應溫度的控制和酶的加入掌握實驗儀器的使用掌握實驗儀器的使用注意：高速離心機的安全使用注意：高速離心機的安全使用 化學化工學院2005-11 Comprehensive Chemical Experiments 14實驗結果實驗結果坐標紙作圖與最小二乘法擬合的實驗數據比較坐標紙作圖與最小二