液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)

1、液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)色譜原理Concentration in Phase AConcentration in Phase BKD=色譜原理流動(dòng)相固定相高效液相色譜是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次的交換過(guò)程，它借助溶質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)、親和力、吸附能力、離子交換、分子大小引起的排阻作用等差別使不同溶質(zhì)進(jìn)行分離（分離條件）。分離過(guò)程受溶質(zhì)在兩相的擴(kuò)散系數(shù)、固定相填料的顆粒大小、填充密度、流動(dòng)相組成及流速等因素影響 。色譜原理-分離過(guò)程ISDC色譜參數(shù) -保留值保留時(shí)間 t R 保留體積VR = tR F , 死時(shí)間 tM 調(diào)整保留時(shí)間tR = tR- tM 調(diào)整保留體積VR = tR

2、F 提高選擇性改變色譜峰的間距提高柱效改變色譜峰的寬窄n液相色譜(LC or HPLC)以液相為流動(dòng)相的色譜，或流動(dòng)相為液體的色譜。n液液色譜以一種液體作流動(dòng)相，另一種液體作固定相的色譜。n液固色譜以液體作流動(dòng)相，以固體作固定相的色譜。（俄國(guó)植物學(xué)家）液相色譜分析基本概念液相色譜分析基本概念n柱色譜把固定相裝在一根管子里（色譜柱），液體流動(dòng)相流過(guò)色譜柱中的固定相。液相色譜分析基本概念n平面色譜紙色譜和薄層色譜(TLC:Thin Layer Chromatography)。用濾紙或是涂在玻璃板（或鋁箔）上的硅膠（或三氧化二鋁等）作固定相，利用濾紙或硅膠層的毛細(xì)管作用把流動(dòng)相（溶劑或叫展開(kāi)劑）從底

3、端吸上來(lái)，使混合物得到分離。液相色譜分析基本概念n凝膠滲透色譜（GPC：Gel Permeation Chromatography）是液相色譜的一個(gè)分支，以一定尺寸的多孔固體（凝膠）作固定相，以液體作流動(dòng)相，按樣品分子尺寸大小進(jìn)行分離的方法。（類(lèi)似于氣相色譜的分子篩填充柱）主要用于測(cè)定樣品中物質(zhì)的分子量及分子量分布。（環(huán)境水樣也如此，目前很多研究與此相關(guān)消毒副產(chǎn)物、催化氧化、膜處理）。液相色譜分析基本概念n超臨界流體色譜（SFC：Supercritical Fluid Chromatography）以超臨界狀態(tài)流體作流動(dòng)相，以固體或液體作固定相的色譜。超臨界狀態(tài)流體是指溫度和壓力都在超臨界溫度

4、和超臨界壓力之上時(shí)，物質(zhì)狀態(tài)處于氣體和液體之間，既不是氣體也不是液體的一種特定形態(tài)的流體。超臨界流體色譜類(lèi)似于液相色譜，超臨界流體由于其密度不同具有特殊的溶解各種物質(zhì)的能力。n我們常用的液相色譜是指液固柱色譜。液相色譜分析基本概念液相色譜儀的基本組成Solvent1Solvent2ReservoirsDegasser1Vacuum pumpDegasser2to MSPressure gauge FilterPrecolumn High pressure pumpMixing vesselInjection portTo wasteDetectorAuto samplerAnalytical

5、columnSignal collectionPulse damper液相色譜流動(dòng)相n單一溶劑：甲醇、乙腈、四氫呋喃、MTBE等或水。n混合溶劑：2種以上混合溶劑，如甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸緩沖溶液、己烷-乙酸乙酯等。n等強(qiáng)度洗脫：流動(dòng)相組成和流量保持恒定。液相色譜流動(dòng)相n梯度洗脫：流動(dòng)相組成比列和流量隨時(shí)間變化。需要比例閥、閥驅(qū)動(dòng)器、溶劑比例控制器、梯度程序器。n注意：1、溶劑需要帶蓋密封；2、溶劑需要脫氣處理：攪拌下真空抽氣或通入惰性氣體（氦、氮）驅(qū)走其中的溶解氣體。液相色譜高壓泵 n有往復(fù)泵、注射泵、氣體放大泵等，不銹鋼材質(zhì)，主要是要能克服大阻力以恒定流速輸送流動(dòng)相。Pumpto

6、mixing chamberto wastePurge valveABCD比例伐四元梯度泵-低壓混合二元梯度泵-高壓混合ABPumpPPtt液相色譜進(jìn)樣閥n進(jìn)樣閥是保證色譜分析準(zhǔn)確度的重要部件。 n六通手動(dòng)進(jìn)樣閥：羅達(dá)因（Rheodyne）進(jìn)樣閥：兩個(gè)位置，一是取樣，二是進(jìn)樣。有固定體積的進(jìn)樣定量環(huán)管，0.5-100ul之間，可根據(jù)樣品情況更換選用。 Injection portn自動(dòng)進(jìn)樣器：模擬手動(dòng)進(jìn)樣過(guò)程。 n注意：1、進(jìn)樣閥內(nèi)部通道很細(xì)，不能帶有固體顆粒，所以水樣需要用濾膜過(guò)濾(0.45um or 0.2um)；2、樣品濃度不能太高，以免在進(jìn)樣閥內(nèi)析出結(jié)晶；3、經(jīng)常清洗進(jìn)樣閥通道。 液相

7、色譜進(jìn)樣閥Auto sampler液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣樣品架n不銹鋼材質(zhì)、有柱管、接頭和過(guò)濾片，柱管內(nèi)填充幾微米的小顆粒填料即固定相（當(dāng)前仍以硅膠基質(zhì)的填料占主導(dǎo)地位）。通常4-8mm、也有1-2mm的細(xì)管徑分析柱，還有1mm以下的毛細(xì)管分析柱。液相色譜色譜柱 液相色譜色譜柱液相色譜色譜柱n色譜柱填料的不斷進(jìn)步是液相色譜能不斷解決成千上萬(wàn)分析難題的關(guān)鍵。 n通用型檢測(cè)器：視差折光檢測(cè)器 。n選擇性檢測(cè)器：紫外吸收檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等。 n紫外吸收檢測(cè)器：樣品有紫外吸收、樣品分子種有生色基團(tuán)、有機(jī)物有羰基、芳香基、烯基等 。液相色譜檢測(cè)器 液相色譜紫外可見(jiàn)檢測(cè)器n單波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器：

8、單色光光源（低壓汞燈254nm）樣品檢測(cè)器（光電二極管）。UV/Vis -Fixed Wavelength Detector液相色譜紫外可見(jiàn)檢測(cè)器n可變波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器：復(fù)合光光源（氘燈190-600nm）單色器（光柵）樣品檢測(cè)器（光電二極管）。UV/Vis -variable wavelength detectorn The UV/Vis source usually comes from a monochromator so the wavelength can be selected, or scanned.n Absorbance increases as eluate passes

9、 through the cell.n If wavelength scanning is desired, the flow is stopped long enough for the scan to take place.液相色譜紫外可見(jiàn)檢測(cè)器n二極管陣列檢測(cè)器：復(fù)合光（氘燈或鹵鎢燈190-800nm）樣品單色器陣列的檢測(cè)器（光電二極管）。UV/Vis -PhotoDiode Array Detector液相色譜紫外檢測(cè)器溶劑最低波長(zhǎng)極限/nm溶劑最低波長(zhǎng)極限/nm溶劑最低波長(zhǎng)極限/nm十二烷200四氫呋喃225四氯乙烯290（280）正丙醚2001,4-二氧六環(huán)225二甲苯295十氫化

10、萘2001,2-二氯乙烷225苯甲腈300正戊烷2051,2-二氯乙烯230氯苯300正丙醇2051,2-二氯丙烷230苯甲醚300乙醚210（215） 二氯甲烷235（232） 苯乙醚300乙酯2101,1-二氯乙烷235吡啶305己烷210氯仿245丙酮330庚烷210（195） 丁酸甲酯250甲乙酮330液相色譜紫外檢測(cè)器正辛烷210乙酸正丁酯254溴仿335異辛烷210甲酸甲酯260溴乙烷350甲基環(huán)己烷210乙酸甲酯260異溴丙烷350正丁醚210乙酸乙酯260正溴丁烷350環(huán)己烷210（200）乙酸正丙酯260碘甲烷350正丁醇210丙酸甲酯260二硫化碳380乙醇210（205）

11、四氯化碳265硝基甲烷380水210（180）N,N-二甲基甲酰胺270硝基乙烷380異丙醇215（205苯2802-硝基丙烷380甲醇215（205）甲苯285 n熒光檢測(cè)器：樣品中物質(zhì)分子能在特定波長(zhǎng)的光激發(fā)后躍遷到高能級(jí)狀態(tài)，在返回到基態(tài)的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光，稱(chēng)做熒光。n熒光強(qiáng)度F=I0abcnI0激發(fā)光強(qiáng)度n熒光量子產(chǎn)率液相色譜熒光檢測(cè)器na吸收系數(shù)nb吸收介質(zhì)光程nc樣品濃度n應(yīng)用：多環(huán)芳烴、黃曲霉毒素、核黃素、卟啉類(lèi)化合物等都能產(chǎn)生熒光。 液相色譜熒光檢測(cè)器n不能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)衍生化反應(yīng)使其產(chǎn)生熒光。如氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等重要生化物質(zhì)并不能產(chǎn)生熒光，衍生反應(yīng)后接上一個(gè)發(fā)熒

12、光基團(tuán)用熒光檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)，靈敏度很高。液相色譜熒光檢測(cè)器Fluorescence Detector State Key Lab of Biochemical Engineering Short pass - transmits all wavelengths below a specified cutoff Long pass - transmits all wavelengths above a specified cutoff Band pass - blocks all wavelengths outside a specified bandn柱前衍生：?jiǎn)我唤M分或衍生物易于被色譜柱分離，

13、則在柱前衍生后進(jìn)樣檢測(cè)。n柱后衍生：18種氨基酸經(jīng)色譜柱分離后，在柱后與茚三酮反應(yīng)后在可見(jiàn)波長(zhǎng)條件下測(cè)定。 液相色譜熒光檢測(cè)器n色譜柱低壓泵三通注入衍生化試劑衍生化反應(yīng)器 （ 加 熱 、 光 照等）檢測(cè)器n光路：n復(fù)合光光源（氘燈190-600nm）單色器（光柵）樣品檢測(cè)器（900角用光電倍增器檢測(cè)發(fā)射光）。 液相色譜熒光檢測(cè)器液相色譜視差折光檢測(cè)器n視差折光檢測(cè)器：（與氣相色譜的TCD非常相似）光線通過(guò)介質(zhì)時(shí)產(chǎn)生折射。當(dāng)兩束平行相同的光分別通過(guò)樣品池和參比池時(shí)，若樣品池和參比池均為純流動(dòng)相溶劑，樣品池和參比池折射率相同，兩個(gè)光電二極管檢測(cè)到的信號(hào)之差為零，沒(méi)有電信號(hào)輸出；液相色譜視差折光檢測(cè)

14、器若參比池中為純流動(dòng)相溶劑，而樣品池中為含有待測(cè)物質(zhì)的流動(dòng)相溶劑，則流動(dòng)相的折射率與含有樣品的流動(dòng)相的折射率不同，即參比池和樣品池折射率不同，有電信號(hào)輸出。Refractive Index DetectornA valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell.nThe eluate flows through the other half of the cell.nThe two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that

15、bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.液相色譜視差折光檢測(cè)器n檢測(cè)器組成：光源透鏡兩束平行光樣品池和參比池光電二極管比較兩者信號(hào)差值輸出信號(hào) 。n凝膠滲透色譜儀（GPC儀）、體積排阻色譜(Size Exclusion Chrom.) 。n分離原理：利用多孔物質(zhì)做固定相，按照待測(cè)組分分子尺寸大小進(jìn)行分離。測(cè)定相對(duì)分子量大小、分子量分布。液相色譜凝膠色譜常用填料：硅膠、甘油基丙基鍵合、交聯(lián)葡聚糖或瓊脂糖、甲基丙烯酸酯等。主要公司：Merk, Pharmacia,Toso

16、h, Waters, Synchrom(SEC, GFC, GPC)n各種命名：60年代發(fā)展起來(lái)的一種快速分離和分子的液相色譜。n凝膠過(guò)濾色譜/分子篩過(guò)濾色譜/分子篩色譜/排除色譜/分子排除色譜/凝膠排除色譜/有限擴(kuò)散色譜/凝膠擴(kuò)散色譜/體積色譜/凝膠滲透色譜/液體排除色譜。液相色譜凝膠色譜液相色譜凝膠色譜n凝膠色譜儀基本結(jié)構(gòu)n溶劑貯存器、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)記錄與處理n色譜柱：固定相為凝膠填料。 n有機(jī)凝膠（交聯(lián)聚苯乙烯）和無(wú)機(jī)凝膠（多孔硅膠）。n親水性和親油性色譜柱。n各類(lèi)色譜柱適用的分子量范圍不同。100-上億。 液相色譜凝膠色譜n檢測(cè)器：分濃度檢測(cè)器和分子量檢測(cè)器兩大類(lèi)

17、。n濃 度 檢 測(cè) 器 ： 視 差 折 光 檢 測(cè) 器（RID）、紫外檢測(cè)器（UVD）、紅外檢測(cè)器（IRD）。液相色譜凝膠色譜n分子量檢測(cè)器：分為間接法和直接法。間接法需要標(biāo)準(zhǔn)樣品。直接法有粘度檢測(cè)器和光散射檢測(cè)器。n粘度檢測(cè)器：在濃度檢測(cè)器出口處接一根不銹鋼毛細(xì)管和壓力傳感器，測(cè)定淋出液流經(jīng)毛細(xì)柱的壓差，壓差與溶液粘度呈正比，粘度與分子量成正比。液相色譜凝膠色譜n光散射檢測(cè)器：通過(guò)測(cè)量散射光強(qiáng)與入射光強(qiáng)之比的因子R，同時(shí)記錄濃度曲線，由濃度和R計(jì)算分子量。液相色譜凝膠色譜n凝膠色譜技術(shù)的應(yīng)用 。液相色譜凝膠色譜01000000200000030000004000000500000060000

18、00101520253060KD5KDn離子色譜儀：（IC）。n分離原理：利用離子交換樹(shù)脂做色譜柱固定相填料，按照待測(cè)樣品中離子組分與固定相樹(shù)脂的親和能力（離子交換能力）不同實(shí)現(xiàn)多組分離子的分離。液相色譜離子色譜常用填料：磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、表面改性硅膠等分類(lèi)：陽(yáng)離子交換、陰離子交換液相色譜離子色譜n高價(jià)離子對(duì)樹(shù)脂的親和力大于低價(jià)離子。Al3+Ca2+Na+ n同價(jià)離子，半徑大的對(duì)樹(shù)脂親和力大于半徑小的。Ag+Tl+Cs+Rb+K+NH4+Na+Li+(CH3)4N+Ba2+Sr2+Ca2+Mg2+n強(qiáng)堿性陰離子樹(shù)脂上的交換次序大體為：PO43-SO42-NO3-Br-HPO42-N

19、O2-Cl-HCOO-OH-CH3COO-F- 液相色譜離子色譜液相色譜離子色譜n發(fā)展：國(guó)外1971年開(kāi)始。國(guó)內(nèi)1982年開(kāi)始研究。n美國(guó)DIONEX公司、WATERS公司、日本SHIMADZU公司。也有國(guó)產(chǎn)儀器。n離子色譜儀基本結(jié)構(gòu)：淋洗液貯存器、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)系統(tǒng) n流動(dòng)相：酸、堿、鹽、絡(luò)合劑等。n輸液泵及進(jìn)樣閥：耐酸堿腐蝕的材料。DIONEX公司PEEK材料。 液相色譜離子色譜n色譜柱：陽(yáng)離子交換柱填料帶磺酸或酸酸官能團(tuán)的聚苯乙烯二乙烯基苯共聚物。陰離子交換柱填料帶季胺官能團(tuán)的聚苯乙烯二乙烯基苯共聚物或帶叔胺官能團(tuán)的聚甲基丙烯酸酯樹(shù)脂。液相色譜離子色譜n檢測(cè)器：電化學(xué)合光學(xué)兩類(lèi)檢測(cè)器。n電化學(xué)檢測(cè)器有電導(dǎo)檢測(cè)器（測(cè)量?jī)呻姌O間離子型溶質(zhì)的電導(dǎo)）、安培檢測(cè)器（兩電極間時(shí)間一電位，僅用于具有電活性的組分測(cè)定）、脈沖和積分安培檢測(cè)器（兩電極間施加三個(gè)脈沖電位）。 液相色譜離子色譜Conductivity DetectorSensitivities for compounds such as phenol, catecholamines,nitrosamines,