高效液相色譜方法及應(yīng)用

1、1高效液相色譜方法及應(yīng)用2主要內(nèi)容v緒論v高效液相色譜法的特點v高效液相色譜法的分類v化學(xué)鍵合相色譜v高效液相色譜儀v定性、定量分析基本原理v在藥物分析中的應(yīng)用3 高效液相色譜法高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography HPLC） 是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。 4v經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)v引入氣相色譜法的理論和實驗技術(shù)v高壓輸送流動相v高效固定相及高靈敏度檢測器v現(xiàn)代液

2、相色譜分析方法5“三高一廣一快三高一廣一快”高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻 力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓，一般可達(dá)150350105Pa 。高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。 高靈敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng/ml，進(jìn)樣量在uL數(shù)量級。 6“三高一廣一快三高一廣一快”應(yīng)用范圍廣：80%以上的有機(jī)化合物可用HPLC分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。 分析速度快、載液流速快：通常分析一個樣品僅需幾分鐘到幾十分鐘的時間，一般小于1小時。 色譜柱可反復(fù)使用、樣

3、品不被破壞、易回收等優(yōu)點7 局限性：局限性：v使用多種溶劑作為流動相，成本高于氣相色譜法，且易引起環(huán)境污染，梯度洗脫操作復(fù)雜； v “柱外效應(yīng)” ：在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低；v高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜；v不能代替中、低壓柱色譜法，在200KPa至1MPa柱壓下去分析受壓易分解、變性的具有生物活性的生化樣品。 81經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動相 柱效低（H，n） 分析周期長

4、無法在線檢測92HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑10m（球形，勻漿裝柱） 高壓輸送流動相 柱效高（H，n） 分析時間大大縮短 可以在線檢測10HPLC與與GC差別差別相同：兼具分離和分析功能 均可以在線檢測不同： 1分析對象的區(qū)別 2流動相的區(qū)別 3操作條件區(qū)別 11HPLC與與GC差別差別1分析對象的區(qū)別 GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品；但對高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品，尤其對大多數(shù)生化樣品不可檢測，占有機(jī)物的20% HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品（包括有機(jī)介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的

5、生化樣品及高分子和離子型樣品均可檢測，用途廣泛，占有機(jī)物的80%12HPLC與與GC差別差別2流動相的區(qū)別 GC：流動相為惰性氣體，氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相有相互作用。 HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對分離起正向作用。且流動相種類較多，選擇余地廣，改變流動相極性和pH值也對分離起到調(diào)控作用，當(dāng)選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相也可以增大分離選擇性。13HPLC與與GC差別差別3操作條件區(qū)別 GC：加溫操作 HPLC：室溫，高壓（液體粘度大，峰展寬?。?4HPLC的分類的分類根據(jù)分離機(jī)制不同分為根據(jù)分離機(jī)制不同分為: 1

6、、液固吸附色譜法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 2、液液分配色譜法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography ) 3、離子色譜法（IC） ( ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 4、空間排阻色譜法（SEC） ( steric exclusion chromatography )15其他色譜類型其他色譜類型：v親和色譜（Affinity

7、 Chromatography; AC）v手性色譜法（Chiral Chromatography；CC）v膠束色譜法（Micellar Chromatography；MC）v電色譜法（Electrochromatography；EC）16液液固色譜法固色譜法v固定相：固體吸附劑（如硅膠、氧化鋁等，粒度510m）v流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑v基本原理：溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異；分離過程是一個吸附-解吸附的平衡過程17液液固色譜法固色譜法v適用范圍：適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性v缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾18

8、液液液分配色譜法液分配色譜法固定相與流動相：均為液體（互不相溶），其中固定相是將特殊的液態(tài)物質(zhì)涂于或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面，常用的載體材料為全多孔型或薄殼型（表面多孔）微粒硅膠吸附劑基本原理：根據(jù)被分離組分在固定相和流動相中溶解度不同而分離，分離過程是一個分配平衡過程適用范圍：水溶性和油溶性樣品，極性和非極性化合物，離子型和非離子型化合物等19液液液分配色譜法液分配色譜法優(yōu)點：色譜柱再生方便，樣品負(fù)載量大，重現(xiàn)性好，分離效果好等缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機(jī)械沖擊力，造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相可克服上述缺

9、點?，F(xiàn)在應(yīng)用很廣泛（7080%）。 20化學(xué)鍵合相色譜化學(xué)鍵合相色譜以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡稱鍵合相色譜法 (bonded phase chromatography；BPC)化學(xué)鍵合固定相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相正相（正相（normal phasenormal phase，NPNP）和反相（）和反相（reversed phasereversed phase，RPRP）鍵合相色譜法）鍵合相色譜法21正相鍵合相色譜正相鍵合相色譜 流動相的極性小于固定液的極性分離機(jī)制：分配：把有機(jī)鍵合層作為一個液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解 吸附：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、

10、誘導(dǎo)力或氫作用力固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相流動相：相對極性小的疏水性溶劑（烷烴類如正己烷、環(huán)己烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、二氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間22正相鍵合相色譜正相鍵合相色譜出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱適用范圍：中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）23反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜 流動相的極性大于固定液的極性分離機(jī)制：疏溶劑理論-溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。 排斥力強，作用時間，k，組分tR 排斥力弱，作用時間，k，組分tR固定相：極性小的烷基鍵合相（

11、如C8柱，C18柱）24反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜流動相：水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時間出柱順序：極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適用范圍：非極性和極性較弱的化合物，占整個HPLC應(yīng)用的80%左右25化學(xué)鍵合色譜具有下列優(yōu)點：化學(xué)鍵合色譜具有下列優(yōu)點：1、適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過控制化學(xué)鍵合反應(yīng)，可以把不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過改變流動相的組成合乎種類來有效地分離非極性、極性和離子型化合物。2、由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶

12、來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。3、鍵合固定相對不太強的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。4、固定相柱效高，使用壽命長，分析重現(xiàn)性好。26高效液相色譜儀組成組成v輸液系統(tǒng)v進(jìn)樣器v色譜柱v檢測器v組分收集器v數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)27進(jìn)樣器進(jìn)樣器停留進(jìn)樣裝置、手動進(jìn)樣閥（六通閥）、自動進(jìn)樣裝置28 檢測器檢測器示差折光化學(xué)檢測器 紫外吸收檢測器 紫外一可同分光光度檢測器 二極管陣列紫外檢測器 熒光檢測器電化學(xué)檢測器 29專屬型檢測器 它對不同組成的物質(zhì)響應(yīng)差別極大，因此只能選擇性的檢測某些物質(zhì)，如紫外檢測器、熒光檢測器和電導(dǎo)檢測器。通用型檢測器 它對大多

13、數(shù)物質(zhì)的響應(yīng)相差不大幾乎適用于所有物質(zhì)，如示差折光化學(xué)檢測器 。但它的靈敏度低，受溫度影響波動大、使用時有一定局限性。30紫外吸收檢測器 簡稱紫外檢測器（ ultraviolet absorption detector ，UV），是基于溶質(zhì)分子吸收紫外光的原理設(shè)計的檢測器。 因為大部分常見有機(jī)物質(zhì)和部分無機(jī)物質(zhì)都具有紫外吸收性質(zhì)，所以該檢測器是液相色譜中應(yīng)用最廣泛的檢測器，幾乎所有液相色譜儀都配置了這種檢測器。 它不僅有較好的選擇性和較高的靈敏度，而且對環(huán)境溫度、流動相組成變化和流速波動不太敏感，因此既可用于等度洗脫，也可用于梯度洗脫。31檢測原理：朗伯比爾 (Lambert-Beer) 定律

14、，響應(yīng)信號（吸光度）與濃度成正比A=Cl特點：靈敏度較高（10-6-10-9 g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度洗脫，不破壞樣品，應(yīng)用廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用 ）局限：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應(yīng)小于檢測波長 專屬型、濃度型檢測器32示差折光檢測器示差折光檢測器 v凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測v糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統(tǒng)v這一系統(tǒng)通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7gml）v流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測33熒光檢測器

15、熒光檢測器 v凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強度與物質(zhì)的濃度成正比v只適用于具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測定 柱前或柱后衍生v其靈敏度很高（檢測下限為10-1210-14gml）v痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測均可采用 34從色譜流出曲線中可以得出許多重要信息：從色譜流出曲線中可以得出許多重要信息： 樣品所含組分的最少個數(shù)； 定性分析（保留值）； 定量分析（峰高或面積）； 分離效能（保留值及區(qū)域?qū)挾龋?兩相選擇的依據(jù)（峰間距離）35HPLC定性分析的基本原理定性分析的基本原理 在同一個色譜條件下，不同樣品內(nèi)所含有的同一物質(zhì)，在色譜柱內(nèi)

16、具有相同的作用機(jī)理和平衡參數(shù)，因此，具有相同的色譜保留行為，反映在色譜圖上就是有相同的保留時間，這就是高效液相色譜儀定性的依據(jù)。36 但是，由于色譜柱內(nèi)，被分析物質(zhì)和固定相、流動相之間作用的復(fù)雜性，以及色譜柱的分離能力-柱效的局限，有些物質(zhì)是不能分離或是完全分開，因此出現(xiàn)在同一或是相近的保留時間內(nèi)。色譜的這種定性的局限性概括為：在同一色譜條件下，同一物質(zhì)具有相同的保留時間，而同一保留時間并不說明是同一物質(zhì)。 37 為提高高效液相色譜的定性能力，通常使用一些具有較強定性能力的檢測器，如：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）,液相色譜-紫外可見光掃描檢測器（HPLC-PDA），液相色譜-紅外、核磁聯(lián)

17、用儀等。通過這些檢測器可對每一組分進(jìn)行定性分析。38定量分析的基本原理定量分析的基本原理 當(dāng)一個樣品在色譜柱內(nèi)被分離成幾個組分以后，每個組分依次流經(jīng)檢測器，經(jīng)檢測得到相應(yīng)的色譜圖。色譜圖中各個組分的響應(yīng)值，也就是色譜峰的一些性質(zhì)如峰高、峰面積是定量分析的基本依據(jù)。39 以常用的紫外-可見光檢測器為例：由于紫外-可見光檢測器(UV-Vis檢測器)與分光光度計的基本原理一致，在一定的濃度范圍內(nèi)都服從比爾定律（Beers law）: a=ebc 其中，a：吸光度；e：該物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)；b：光程；c：該物質(zhì)的濃度。 40在一定的濃度范圍內(nèi)，有 C=kA+b C：樣品中該物質(zhì)的濃度，A:該物質(zhì)對應(yīng)的

18、峰面積，k、b為常數(shù)。 也就是說，被分析樣品內(nèi)某一物質(zhì)的濃度和該物質(zhì)所對應(yīng)的峰面積成正比，這就是高效液相色譜定量分析的基本原理。41在藥物分析中的應(yīng)用 1.在鑒別中的應(yīng)用在鑒別中的應(yīng)用 在HPLC法中，保留時間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，是定性的參數(shù)，可用于藥物的鑒別。如中國藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項下規(guī)定：在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間應(yīng)與對照品主峰的保留時間一致。頭抱拉定、頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進(jìn)行鑒別。 422.在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用 HPLC分離效能高，靈敏，在藥物的雜質(zhì)檢查中應(yīng)用廣泛。主要用

19、于藥物中有關(guān)物質(zhì)的檢查。 “有關(guān)物質(zhì)有關(guān)物質(zhì)”是指藥物中存在的合成原料、中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等物質(zhì)，這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與藥物相似，含量很低，只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測。 若雜質(zhì)是已知的，又有雜質(zhì)的對照品，可用雜質(zhì)對照品做對照進(jìn)行檢查。若雜質(zhì)是未知的，可以采用主成分自身對照法或峰面積歸一化法進(jìn)行檢查。433在含量測定中的應(yīng)用在含量測定中的應(yīng)用 用高效液相色譜法測定含量可以消除藥物中的雜質(zhì)，制劑中的附加劑及共存的藥物對測定的干擾。中藥材及其制劑組成復(fù)雜，基中不少有效成分的含量測定也越來越多地采用了高效液相色譜法。4.手性分離手性分離445.在血藥濃度檢測中的應(yīng)用在血藥濃度檢測中的應(yīng)用 用HPLC測定可疑中毒病人血中藥物濃度具有準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點，可有效地幫助臨床醫(yī)生確診，快速有效地救治患者，對提高