課程設(shè)計(jì)范例

1、 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)課程設(shè)計(jì)題目： 不同啟動(dòng)子對(duì)RNA介導(dǎo)的病毒抗性的影響 姓名： 學(xué)號(hào)： 年級(jí)： 專業(yè)： 指導(dǎo)教師： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院二 年 月 日一、選題依據(jù)（擬開(kāi)展研究項(xiàng)目的研究目的、意義）雙鏈RNA 導(dǎo)致基因沉默RNA 干涉,它是一種普遍存在于生物界的生命現(xiàn)象, 也是現(xiàn)在生命科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。盡管對(duì)RNAi 的機(jī)制研究已經(jīng)取得許多重要的成果, 但是仍有許多環(huán)節(jié)需要進(jìn)一步地探查。RNA 干涉(RNAi)是利用雙鏈RNA 特異性的降解相應(yīng)序列的mRNA , 從而特異性的阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。RNA介導(dǎo)的病毒抗性技術(shù)是利用病毒本身的一些基因?qū)胫参飶亩@得抗病毒植株，也稱為源

2、于病原誘導(dǎo)的抗病，是植物病毒基因工程常用的策略。馬鈴薯Y病毒(PVY)對(duì)馬鈴薯、煙草等重要經(jīng)濟(jì)作物危害十分嚴(yán)重，其侵染所造成的損失可達(dá)80%，尤其是馬鈴薯Y病毒壞死株系（PVYN）可以造成寄主提前死亡而絕收。本研究以馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因3端400bp 的序列為靶目標(biāo)設(shè)計(jì)反向重復(fù)序列,插入含有三種不同類型啟動(dòng)子的表達(dá)載體PCAMBIA1300中，構(gòu)建hpRNA結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，進(jìn)行抗病性鑒定，分析不同啟動(dòng)子對(duì)RNA介導(dǎo)的病毒抗性的影響，尋找能夠引發(fā)RNA介導(dǎo)病毒抗性產(chǎn)生的最佳類型的啟動(dòng)子，同時(shí)探討啟動(dòng)子對(duì)RNA介導(dǎo)病毒抗性的作用本質(zhì)。二、文獻(xiàn)綜述內(nèi)容（在充分收集研究主題相關(guān)資料的

3、基礎(chǔ)上，分析國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，提出問(wèn)題，找到研究主題的切入點(diǎn)，附主要參考文獻(xiàn)）RNA干擾（RNA interference, RNAi）現(xiàn)象最早是在植物中發(fā)現(xiàn)的。1990年，Napoli等將查爾酮合成酶(CHS)基因?qū)氲阶匣ò珷颗Ｖ?，旨在加深花的顏色，但結(jié)果花的顏色不但沒(méi)有加深，而變成白色或紫白相間。分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株并沒(méi)有新的基因表達(dá)，反而使植物本身的色素合成基因也受到了抑制。當(dāng)時(shí)將這種現(xiàn)象稱為共抑制（Co-suppression）或轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（PTGS）。隨后， Dougherty等（1992年）用煙草蝕紋病毒（tobacco etch virus，TEV）的非翻譯CP基因轉(zhuǎn)化煙草，

4、發(fā)現(xiàn)在表現(xiàn)抗性的植物細(xì)胞核中，轉(zhuǎn)入病毒CP基因的轉(zhuǎn)錄正常，甚至加強(qiáng)，但在細(xì)胞質(zhì)中的積累大大降低。這與在研究chs基因的結(jié)果極為相似，也是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。這種抗性被稱為RNA介導(dǎo)的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance, RMVR）。繼在植物中發(fā)現(xiàn)PTGS后，目前已在微生物、動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)與PTGS類似的現(xiàn)象，如在真菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)的“quelling”(Guo, 1995)、線蟲、果蠅內(nèi)發(fā)現(xiàn)的RNAi（Fire,1998 ；Zamore,2000）。根據(jù)上述各種基因沉默的特點(diǎn)和性質(zhì)，可統(tǒng)稱為RNA干擾或RNA沉默。RNA沉默是生物體內(nèi)由雙鏈RNA（doubl

5、e-strand RNA，dsRNA）引發(fā)的同源mRNA降解現(xiàn)象(Hammond, 2001; Phillip, 2002; Kawasaki, 2003)。在細(xì)胞中，dsRNA在Dicer酶的作用下從兩端逐段酶解大小約2125nt的小分子雙鏈RNA (Small interfering RNAs，siRNAs)片段。雙鏈siRNAs形成后，與RNA誘導(dǎo)的RNA沉默復(fù)合體（RNA-Induced Silencing Complex，RISC）結(jié)合，在ATP酶的作用下將雙鏈siRNA解開(kāi)成單鏈RNA。在ss-siRNA的引導(dǎo)下，識(shí)別與其同源的靶mRNA，一旦siRNA和靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)，RIS

6、C中的核酸酶就將靶RNA從siRNA中點(diǎn)的對(duì)應(yīng)位置處切斷，導(dǎo)致靶RNA降解。RNA沉默的顯著特征是這種沉默作用可以被擴(kuò)大。這種擴(kuò)大作用可能是由于反義siRNA與靶mRNA結(jié)合，在RdRP的作用下擴(kuò)增出dsRNA。然后在Dicer的作用下可形成大量的siRNA。建立dsRNA的高效植物表達(dá)載體，對(duì)于成功地應(yīng)用RNAi技術(shù)培育抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物起著至關(guān)重要的作用。對(duì)于轉(zhuǎn)基因來(lái)說(shuō)，dsRNA形成的途徑的最佳途徑是通過(guò)構(gòu)建的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）的外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的外源基因由兩段反向重復(fù)（IR） DNA序列和一段其他DNA（spacer）序列組成，兩段IR DNA由spacer連接起

7、來(lái)。這樣的結(jié)構(gòu)所轉(zhuǎn)錄的RNA會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin RNA, 簡(jiǎn)稱hpRNA）。hpRNA由具有雙鏈結(jié)構(gòu)的“莖”（stem， 是IR DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物配對(duì)形成雙鏈）和單鏈結(jié)構(gòu)的“環(huán)”（loop，是spacer DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物）組成。研究發(fā)現(xiàn)，在一般的轉(zhuǎn)基因植物中（即含有非hpRNA結(jié)構(gòu)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物），產(chǎn)生基因沉默的幾率一般為10%30%；而轉(zhuǎn)錄后能形成雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因（hpRNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因）誘發(fā)基因沉默的幾率較高，可達(dá)到6080%以上；尤其對(duì)于轉(zhuǎn)錄后形成的“環(huán)”（loop）為內(nèi)含子的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（ihpRNA），誘發(fā)基因沉默的效率更高，有的可達(dá)100%（朱俊華, 2004;

8、竺曉平, 2006; Smith, 2000; Wesley, 2001; Zamore, 2002; Helliwell, 2003; Pandolfini, 2003） 。基于hpRNA表達(dá)而誘導(dǎo)的基因沉默已在多種生物、多種基因上獲得成功（Smith, 2000; Wesley, 2001; Piccin, 2001; Paddison, 2002; Stoutjesdijk, 2002; Helliwell, 2003）。通過(guò)對(duì)hpRNA的研究表明，hpRNA中的雙鏈“莖”（stem）部分是誘發(fā)基因沉默的關(guān)鍵部位。莖的長(zhǎng)短可影響RNA沉默的效率及穩(wěn)定性。在植物轉(zhuǎn)基因研究中，Helliwe

9、ll（2003）等研究發(fā)現(xiàn)，501000bp的基因片段均能誘發(fā)基因沉默，但基因片段越短，基因沉默的效率越低；并認(rèn)為片段長(zhǎng)度為300600bp時(shí)，是合適的，且可以獲得最高的基因沉默效率。在RNA介導(dǎo)的病毒抗性研究中，我們的研究結(jié)果表明stem的長(zhǎng)度為200bp、100bp和50bp的莖長(zhǎng)度均可高效的誘導(dǎo)病毒抗性，但200bp的效率更高（竺曉平，2006；遲勝起，2005；李鵬，2007）。莖長(zhǎng)度選擇的原則是，在保證足夠效率的基礎(chǔ)上，選擇盡可能短的片段。這樣，第一，可減少外源DNA的插入對(duì)植物細(xì)胞染色體DNA造成的不良影響；第二，可進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性；第三，可很方便地將同一病毒不同功

10、能基因的cDNA區(qū)段或不同病毒的cDNA連接在同一載體上，從而更高、更持久抗性或多病毒抗性的植物。從目前已有的研究結(jié)果看，較短的適宜莖長(zhǎng)度為300bp左右。hpRNA中的“環(huán)”（loop）也可對(duì)PTGS （RNA沉默）產(chǎn)生影響，loop的長(zhǎng)度直接影響hpRNA的形成和穩(wěn)定性。在一定范圍內(nèi)，短loop有利于hpRNA的形成和穩(wěn)定，但loop過(guò)短會(huì)影響IR結(jié)構(gòu)DNA的在細(xì)菌內(nèi)的克隆。Piccin等（2001）在研究hpRNA引發(fā)果蠅Y基因（長(zhǎng)度為1120bp）沉默中的研究中使用GFP基因片段為spacer，結(jié)果表明當(dāng)loop長(zhǎng)度為330nt時(shí)，對(duì)dsRNA引發(fā)的RNAi無(wú)顯著影響，且極大地提高了I

11、R克隆的效率；而當(dāng)loop長(zhǎng)度為150nt時(shí)，則對(duì)提高IR克隆的效率沒(méi)有幫助。Wesley（2001）等報(bào)道，在植物中，當(dāng)loop長(zhǎng)度為3050nt，stem的長(zhǎng)度為98bp時(shí)，就可引發(fā)100%的基因沉默。我們的研究表明，當(dāng)stem為200nt長(zhǎng)度時(shí)，50nt長(zhǎng)度的loop可有效地形成穩(wěn)定的hpRNA（朱俊華等，2004）；當(dāng)stem長(zhǎng)度為300nt時(shí)，載體的構(gòu)建相當(dāng)困難。從目前的研究結(jié)果看，較適宜的莖環(huán)比例應(yīng)為3/14/1（溫孚江，2004國(guó)家基金）。適宜莖長(zhǎng)度和莖環(huán)比例的確定為研究中構(gòu)建dsRNA的高效表達(dá)載體提供了依據(jù)。高效啟動(dòng)子的選用可能也是高效誘發(fā)RNAi的另一重要因素。Que等（1

12、997）研究發(fā)現(xiàn)由強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的chs轉(zhuǎn)基因引起的PTGS比用弱啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因要有效的多。Waterhouse 等（1998）用35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)殘缺的部分基因被排列成發(fā)夾RNA（hairpin RNA）轉(zhuǎn)錄物的反向重復(fù)uidA轉(zhuǎn)基因，結(jié)果獲得很高的沉默發(fā)生率（90%），而用不帶啟動(dòng)子的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)基因沉默則明顯地減少，推測(cè)高強(qiáng)度的轉(zhuǎn)錄可能較低強(qiáng)度的轉(zhuǎn)錄更易于產(chǎn)生dsRNA，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生的速率對(duì)于激發(fā)PTGS是非常重要的。玉米乙醇脫氫酶基因啟動(dòng)子（ubi ）具有高效啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的作用,并且它基本不受組織細(xì)胞的限制，是禾本科植物中較為常見(jiàn)的啟動(dòng)子，能夠有效地提高外源基因在水稻愈傷中的瞬間表達(dá)，效

13、率為35S啟動(dòng)子的4倍。Pnzip 啟動(dòng)子是一種具有嚴(yán)格組織專一性的啟動(dòng)子, 它能驅(qū)動(dòng)外源基因在光合組織中特異、高效表達(dá)，效率為35S啟動(dòng)子的9倍。在RNA介導(dǎo)的植物病毒抗性研究中，目前尚未見(jiàn)有關(guān)比較不同類型啟動(dòng)子抗病性的系統(tǒng)報(bào)道，本研究將在這方面進(jìn)行深入、系統(tǒng)地探討。主要參考文獻(xiàn)：1 Boogaart TV, et al. Replicase-derived resistance against Pea early browning virus in Nicotiana benthaminaa is an unstable resistance based upon posttranscri

14、ptional gene silencing. MPMI,2001,14(2):196-203.2 Boutla A, et al. Short 5-phosphorylated double-stranded RNAs induce RNAinterference in Drosophila. Cuurr Biol, 2001, 11: 1776-1780.3 Cogoni C & Macino G.Posttranscriptional gene silencing in Neurospora by a RecQ DNA helicase . Science, 1999,286:2342-

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18、mporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell, 2001,106:2334.12 Herrera Estrella L,et al.Light-induced and chloroplast-associated experession of chimearic gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti plasmid vectorJ.Nature,1984,310:115120.13 Vasil V,et al.Herbicide resistant fe

19、rtile transgenic wheat plants obtained by particle bombardment of regenerable callusJ.Bio/Tech,1992,10:667674.14 Wilson T M A.Strategies to protect crop plants against virus:pathogen-derived resistance blossomsJ.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:3134!3141.15 Fujimoto H,et al.Insect resistant rice gener

20、ated by the introduction of a modifide-endotoxin gene of Bacillus thuringiensisJ. Bio/Tech,1993,11:11511155.16 Oeller P W, et al. Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNAJ.Sciece,1991,254:437439.17 Mariani C, et al. Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonu

21、clease geneJ.Nature,1990,347:737741.18 Gasser C S, Fraley R T. Genetically engineering plants for crop impovementJ.Science,1989,244:1293!1299.19 Van der Salm T, et al. Insect resistance of transgenic plants that express modified Bacillus thuringiensis cryIA(b) and cryIC genes:a resistande management

22、 strategyJ. Plant Mol Biol,1994,26:5159.20 白慶榮, 等. 利用RNA介導(dǎo)的抗病性獲得抗2種病毒的轉(zhuǎn)基因煙草。植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（2）：148-154.21 遲勝起. 核基質(zhì)結(jié)合區(qū)對(duì)馬鈴薯Y病毒非翻譯CP基因及反向重復(fù)片段介導(dǎo)的抗病性影響. 植物病理學(xué)報(bào)， 2005，35（4）：345-35122 樊龍江, 等. 轉(zhuǎn)基因植物的基因漂流風(fēng)險(xiǎn). 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2001 (4):151-153.23 郭興啟, 等. 利用RNA介導(dǎo)的抗病性獲得高度抗馬鈴薯Y病毒的轉(zhuǎn)基因煙草. 植物病理學(xué)報(bào), 2001b, 31（4）: 349-356.24 郭興啟,

23、 等翻譯和非翻譯馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因介導(dǎo)的抗病性比較，病毒學(xué)報(bào)， 2001a，17(4)：360-367. 25 賴延?xùn)|，等。應(yīng)用定量競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR篩選芳香烴受體基因RNA干擾片段。衛(wèi)生研究， 2006，35（1）：7-9。26 李 鵬, 等. 馬鈴薯Y病毒CP基因5端和3端反向重復(fù)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的抗病性研究。植物病理學(xué)報(bào), 2007, 37(1):69-76.27 李建龍，等。SiRNA活性與mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究。生物醫(yī)學(xué)工程研究，2006，25（1）：4652.28 劉曉玲, 等. PVX 25kD運(yùn)動(dòng)蛋白基因和外殼蛋白基因介導(dǎo)的抗病性研究。作物學(xué)報(bào)，2005，31（7）：827-8

24、32。29 溫孚江, 等. 轉(zhuǎn)錄后基因沉沒(méi)與植物的病毒抗性. 生物工程學(xué)報(bào), 2001, 17(3)：213-235.30 羊正綱，等。 載體法篩選乙型肝炎病毒S基因小干擾RNA靶位體系的建立。中華肝臟病雜志，2004，12（9）：51551831 趙明敏, 等. 瞬時(shí)表達(dá)靶向TMV外殼蛋白基因的siRNA能干擾病毒侵染. 植物病理學(xué)報(bào), 2006, 36(1):35-40.32 趙遠(yuǎn). RNA干擾治療馬凡綜合癥的載體和靶位點(diǎn)基礎(chǔ). 博士論文, 2003年.33 朱常香, 等. RNA介導(dǎo)的病毒抗性在轉(zhuǎn)基因煙草中的遺傳. 遺傳學(xué)報(bào), 2005,32 (1): 94-103.34 朱俊華, 等.

25、 馬鈴薯Y病毒衣殼蛋白基因片段長(zhǎng)度對(duì)RNA介導(dǎo)抗病性的影響. 中國(guó)科學(xué)（C輯）, 2004b 34（1）: 23-30.35 朱俊華, 等. 正向和反向重復(fù)RNA介導(dǎo)的抗馬鈴薯Y病毒基因工程比較研究. 植物病理學(xué)報(bào), 2004a, 34（2）:133-140.36 竺曉平, 等. 馬鈴薯 Y病毒CP基因的短片段及其反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因煙草的RNA介導(dǎo)的抗病性研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 39（6）:1153-1158.楊予濤 ，等.一個(gè)光合組織特異表達(dá)強(qiáng)啟動(dòng)子的分離及功能分析.中國(guó)科學(xué)（C輯）.2003, 8, 33（4）：228-306.三、研究方案（主要研究?jī)?nèi)容、研究方法和技術(shù)路線）本研究

26、以馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因3端400bp 的序列為靶目標(biāo)設(shè)計(jì)反向重復(fù)序列,插入含有三種不同啟動(dòng)子的表達(dá)載體PCAMBIA1300中，構(gòu)建hpRNA結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，進(jìn)行抗病性鑒定，分析不同啟動(dòng)子對(duì)RNA介導(dǎo)的病毒抗性的影響，尋找能夠引發(fā)RNA介導(dǎo)病毒抗性產(chǎn)生的最佳類型的啟動(dòng)子，同時(shí)探討啟動(dòng)子對(duì)RNA介導(dǎo)病毒抗性的作用本質(zhì)。研究方法1不含內(nèi)含子的反向重復(fù)序列的表達(dá)載體的構(gòu)建 hpRNA的構(gòu)建如圖所示 轉(zhuǎn)錄 400bp 100bp 2含有內(nèi)含子的反向重復(fù)序列的表達(dá)載體的構(gòu)建hpRNA的構(gòu)建如圖所示載體的構(gòu)建以雙元載體pCAMBIA1300為基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)引物（兩端加上適宜的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)），PCR分別擴(kuò)增花椰菜花葉病毒35S（CaMV35S）啟動(dòng)子、水稻肌動(dòng)蛋白基因Act1啟動(dòng)子、玉米乙醇脫氫酶基因Ubi啟動(dòng)子和PNZIP基因啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶基因3端Nos終止子。將擴(kuò)增的啟動(dòng)子和終止子連接于雙元載體pCAMBIA1300中，獲得含有不同啟動(dòng)子的重組的表達(dá)載體。以已克隆的PVY的CP基因3段400bp的cDNA區(qū)段為目的基因，分別反向重復(fù)插入含有不同啟動(dòng)子植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中。在SacI位點(diǎn)和EcoRI位點(diǎn)之間插入Nos 3終止子，在XhoI單位點(diǎn)插入NptIII抗性基因，在HindIII和BamHI位點(diǎn)