Myc基因通過調(diào)節(jié)PDL-1的表達促進DLBCL增殖的機制研究-博士科研計劃書

1、考試方式：公開招考本科直博口碩博連讀報名號：博士科研計劃書學生姓名：報考院系：報考專業(yè)：研究方向：導(dǎo)師：年月日一、立題依據(jù)產(chǎn)重點介紹本項目的科學意義、國內(nèi)外現(xiàn)狀，弁附主要參考文獻【研究意義】彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma,DLBCL足非霍奇金淋巴瘤(NHL)最常見的組織學類型1,占成人淋巴瘤的30%40%。我國24個中心聯(lián)合收集了10002例病例，統(tǒng)計結(jié)果顯示，中國的DLBC占NHL45.8%,所有淋巴瘤的40.1%2。研究表明肺癌最主要的致病原因與病毒感染以及化學毒物等環(huán)境致癌物相關(guān)，分子流行病學研究發(fā)現(xiàn)EBW毒、化學物或紫外線等可作為啟動因子參與改

2、變多個與DNA復(fù)制及修復(fù)相關(guān)的傳導(dǎo)通路，引起細胞的遺傳學改變進而致癌。例如癌基因如BCL-6激活，從而引起生發(fā)中心細胞增殖異常及凋亡障礙，最終導(dǎo)致B細胞生長調(diào)節(jié)失控而形成月中瘤。目前環(huán)境污染致癌已成為全民關(guān)注的熱點問題，因此探尋與環(huán)境致癌物相關(guān)的新調(diào)控因子并闡明其作用機制是當前月中瘤防治工作中十分迫切的科學議題。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生c-Myc重排的彌漫大B細胞淋巴瘤患者具有Ki67高表達的特點3,提示該基因重排與淋巴瘤細胞的無限增值有關(guān)。文獻報道大約有8%-25%JDLBC患者存在c-myc基因重排4-6,且為DLBC思者的一個不良預(yù)后因素。止匕外，大約24%勺彌漫大B細胞淋巴瘤患者不同程度地表達P

3、DL1在動物,K型中，MycS因可促進PDL-1的表達，從而抑制機體免疫功能，并促進月中瘤生長，而抑制MycS因可下調(diào)PDL-1的表達水平，增強抗月中瘤免疫反應(yīng)，最終抑制月中瘤生長口。這些研究數(shù)據(jù)為進一步研究彌漫大B細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展機制和靶向治療提供了新思路。在以往研究的基礎(chǔ)上，本課題將研究mycS因在弓漫大虔田胞淋巴瘤發(fā)生中的作用，并在細胞水平和在動物模型中揭示my&口何通過調(diào)控PDL-1表達促進DLBC增殖的分子機制。本研究的意義在于：1.闡明myc#因?qū)DL-1表達的調(diào)控機制，揭示mycS因在弓漫大B細胞淋巴瘤中的作用機制；3.證實mycS因促進PDL-1表達是彌漫大B細胞

4、淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵分子生物學事件，并促進彌漫大B細胞淋巴瘤的增殖；4.闡明干擾RNAtB細胞淋巴瘤中內(nèi)源性mycS因的抑制作用，進而促進月中瘤細胞凋亡的機制；5.以上科學問題的闡明將為彌漫大B細胞淋巴瘤的預(yù)防和靶向治療提供有價值的理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)?！緡鴥?nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析】DLBCL子發(fā)于中老年男性，發(fā)病年齡范圍廣，平均發(fā)病年齡70歲，亦可見于兒童，主要臨床表現(xiàn)為無痛性淋巴結(jié)月中大伴潮熱、盜汗等全身癥狀，也可累及結(jié)外組織，常見于胃腸道、中樞等受侵。根據(jù)基因表達特征可將DLBC吩成2種亞型：一種為生發(fā)中心B細胞樣(germinalcenterBcell-like,GCB)另一種為非生

5、發(fā)中心Bffl月樣(non-GCB),又稱活化隹田胞樣(activatedB-cell1ike,ABC)8。DLBC是高度侵襲性惡性月中瘤，一旦診斷，應(yīng)及早治療，采取積極的聯(lián)合化療，約50%的患者可以獲得臨床治愈。利妥昔單克隆抗體(Rituximab，商品名：美羅華)的問世，美羅華聯(lián)合化療的R-CHOP案應(yīng)運而生，使得DLBCL患者5年生存率(overallsurvival,OS)W所提高。但是仍有不少患者在治療結(jié)束后復(fù)發(fā)甚至在治療過程中進展，亟待研究發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，進一步彌漫大B細胞淋巴瘤的治療效果。c-myc基因是定位于染色體8q24的一種癌基因，myc#因及其產(chǎn)物mycg白具有促進DN

6、A復(fù)制以及調(diào)節(jié)G,細胞周期分布、細胞生長、細胞增殖及分化等功能9。在惡性淋巴瘤、白血病及各種上皮細胞來源的惡性月中瘤組織中均有mycS因及蛋白的過度表達，mycS因的擴增或其蛋白的過度表達可促進月中瘤細胞生長。文獻報道大約有8%-25%JDLBC患者存在c-myc基因重排4-6,且為DLBC患者的一個不良預(yù)后因素。特異性效應(yīng)T細胞的成熟需要兩個信號，一是抗原呈遞細胞呈遞的抗原肽與T細胞表面受體TCR-CD3合體交連，產(chǎn)生的抗原特異性TCRS號；二是由APCfe面分子與T細胞表面相應(yīng)受體結(jié)合所提供的第二刺激信號，即共刺激信號，該信號是非抗原特異性的，能夠決定受抗原刺激的T細胞是增殖、分化成為效應(yīng)

7、細胞，還是進入無反應(yīng)狀態(tài)或凋亡。PD混從發(fā)生程序性死亡的T細胞中分離出來的一種跨膜蛋白，是CD2瓊族成員之一，主要表達于T細胞、B細胞和骨髓細胞表面。PD混負向調(diào)節(jié)共刺激分子，是誘導(dǎo)效應(yīng)T細胞進入靜息凋亡的表面標志，它通過免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序的酪氨酸磷酸化來募集酪氨酸磷酸酶2,傳遞負性刺激信號，能有效抑制早期激活的T細胞及其抗原受體信號10。PDLfl"1999年被確認為PD-1的配體(也叫B7-H1),PDL-1的mRNA泛分布于心臟、骨骼肌、肺、脾臟、腎臟、肝臟等非淋巴組織。但PD-L1蛋白表達主要是限于巨噬細胞來源的細胞，如肝庫弗細胞、血管內(nèi)皮細胞等。PD1/PD-L1B號傳

8、導(dǎo)系統(tǒng)屬于第二共刺激信號，傳遞負性調(diào)控信號。PDL1與PD給合后，能抑制T細胞增殖和細胞因子的分泌，在T細胞激活和分化的不同階段中，該信號途徑的共刺激和共抑制角色與慢性感染性疾病，自身免疫性疾病和月中瘤等密切相關(guān)，PD1/PDL-1信號的抑制原理并非直接引起T細胞凋亡，而是使T細胞發(fā)育停滯于G0/G1W,該期的細胞處于靜息狀態(tài)，不能實現(xiàn)T細胞的毒性吞噬功能11。研究表明，PDL促影響多種實體瘤患者生存的一個不良預(yù)后因素，但PDL-1在淋巴增生性疾病中的預(yù)后作用不一。研究表明，PDL俵達于約24%勺彌漫大B細胞淋巴瘤患者12。近年來的研究表明，一些小的雙鏈RN版為干擾RNA(RNAinterfe

9、rence,RNAi),它可以高效、特異地降解有關(guān)基因的mRNA誘使RNA0胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型13。目前，RNA技術(shù)已成為探尋與月中瘤相關(guān)基因和研究功能基因組學領(lǐng)域的一個重要研究方向及熱點。有研究發(fā)現(xiàn)，21bp、干擾性(smallinterferenceRNA,siRNA)可在體外培養(yǎng)的哺乳類細胞中特異性抑制內(nèi)源和外源基因的表達14o將siRNA裝入表達載體，使其在細胞內(nèi)表達發(fā)火RNA(hRNA成為shRNAFire等首次發(fā)現(xiàn)了雙鏈RNAt夠?qū)е禄虺聊默F(xiàn)象來源于對線蟲caenorhabditiselegans的研究15。在小鼠和人的體外培養(yǎng)細胞中，利用RNA技術(shù)可成功地阻斷基因的表

10、達，實現(xiàn)了細胞水平的基因敲除16。國內(nèi)許楊等17研究表明，干擾RNA9顯著抑制肝癌細胞內(nèi)源性c-myc基因的表達。因此，采用RNA干擾技術(shù)，抑制具有mycS因重排的DLBCL中瘤細胞中的mycS因表達可能會取得較好的效果。Myc基因作為一種原癌基因，通過調(diào)節(jié)RUNX3CD47PDL1等分子的表達在多種月中瘤的發(fā)展中起到重要作用。本課題旨在研究myc基因重排、PDL1在DLBCL患者中的表達情況，探討myc基因可通過調(diào)節(jié)PDL-1的表達進而促進DLBCL增殖，并影響荷瘤小鼠存活時間，使用干擾RNA可抑制DLBCL細胞myc基因，從而為治療DLBCL潛在的靶向藥物參考文獻：1 .Sabattini

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18、gL,ConklinDS,etal.GerminetransmissionofRNAiinmice.NatStructBiol.2003.10:91-92.17. 許楊等，干擾RNA對HepG2肝癌細胞內(nèi)源性myc表達的抑制作用。中華月中瘤雜志；2004年8月第26卷第8期。二、研究內(nèi)容產(chǎn)研究目標、研究內(nèi)容、創(chuàng)新之處和擬解決的關(guān)鍵問題【研究內(nèi)容】一、DLBCL組織中myc基因和PDL-1表達的進一步驗證及與預(yù)后的關(guān)系；國內(nèi)外相關(guān)研究已經(jīng)提示myc基因及PDL-1在一定比例的DLBCL患者癌組織中存在不同程度地表達，和DLBCL的發(fā)生相關(guān)，為了進一步驗證推測，可收集大約200例的樣本，并評估m(xù)y

19、c基因和PDL-1表達與患者治療療效、生存時間的關(guān)系。1、DLBCL組織標中檢測myc基因和PDL-1表達，從本院病理科獲取200例DLBCL標本（包含隨訪資料），通過免疫組織化學及FISH檢測等方法，檢測DLBCL組織和癌旁組織中myc和PDL-1在mRNA和蛋白水平的表達，評估腫瘤組織和癌旁組織中myc和PDL-1表達的差異。并將上述指標在50例新鮮DLBCL患者癌組織標本中進一步驗證。2、根據(jù)1中的檢測分析，獲得myc和PDL-1在DLBCL患者的表達情況，通過前瞻性研究、回顧性研究等手段分析患者腫瘤組織和血漿中分析兩者與患者治療療效的關(guān)系，評價myc和PDL-1與患者生存時間的相關(guān)性。

20、二、Myc可調(diào)節(jié)PDL-1的表達，并最終促進DLBCL細胞增殖的機制研究；在第一部分中明確了DLBCL中一部分患者存在myc基因陽性，PDL-1高表達，且myc基因陽性及PDL-1高表達與DLBCL的預(yù)后相關(guān)，接下來在細胞實驗中驗證myc調(diào)節(jié)PDL-1表達并促進DLBCL細胞增殖的作用。1、通過Lipofectamine2000脂質(zhì)體將myc基因轉(zhuǎn)染至人B細胞淋巴瘤細胞株中，檢測轉(zhuǎn)染效率，并設(shè)置空白對照組、陰性對照組和myc轉(zhuǎn)染組三組，使用MTTffl胞增殖實驗檢測細胞增殖情況，Transwell法檢測細胞遷移能力，劃痕實驗測細胞的遷移距離，流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡率，RT-PCRt檢

21、測PDL1mRN照錄水平,Westernblot法檢測蛋白的表達水平。2、將一部分myc基因陽性的細胞株分為三組，第一組進行培養(yǎng)后直接檢測PDL1mRN及PDL1蛋白含量；第二組加入JQ1進行培養(yǎng)后檢測PDL1mRN版PDL1蛋白含量；第三組在第三部分詳述。三、干擾RNA對B細胞淋巴瘤細胞內(nèi)源性c-myc表達的抑制作用研究；上述兩部分已經(jīng)明確了myc基因陽性及PDL-1高表達與DLBCL的預(yù)后相關(guān)，且myc可通過調(diào)節(jié)PDL-1在RNA及蛋白水平的表達，接下來在細胞實驗中研究干擾RNA是否可抑制c-myc基因的表達。1、質(zhì)粒：含c-myc的一段特異序列的Psilencer-c-myc載體，由中國

22、醫(yī)學科學院腫瘤研究所細胞生物室構(gòu)建并提供。Psilencer-c-myc表達載體5'端為特定的RNA聚合酶III啟動子（U6）,中間為shRNA對應(yīng)的序列，3'端為聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止序列。此Psilencer-c-myc表達載體可在細胞內(nèi)表達shRNA。2、轉(zhuǎn)染：B細胞淋巴瘤細胞采用脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染。實驗組加入Psilencer-c-myc,對照組加入Psilencer3天后收集細胞，提取RNA、蛋白進行檢測。3、定量PCR:用trizol提取實驗組與對照組細胞中的總RNA。定量RNA和cDNA,并分別加入30ngcDNA擴增c-myc、histone基因。4、Westernblo

23、t及圖像分析：Psilencer-c-myc轉(zhuǎn)染B細胞淋巴瘤細胞3天后收集細胞，加入細胞裂解液，Westernblot法對myc蛋白進行檢測，運用BIO-RAD公司的Quatitiveone4.4.1軟件對Westernblot結(jié)果進行分析。5.細胞周期和凋亡細胞分析：收集轉(zhuǎn)染后第3天的細胞，進行PI染色，經(jīng)流式細胞儀測定細胞周期和凋亡細胞。采用PrapoptoticKit中的AnexinV標記早期凋亡細胞，DAPI著染細胞核，熒光顯微鏡進行檢測并照相。四、myc表達對DLBCL細胞增殖及荷瘤小鼠存活時間的影響；通過上述二部分研究，明確了myc可通過調(diào)節(jié)PDL1的表達進而促進DLBCL細胞增殖

24、的分子生物學機制，接下來要進一步研究該通路對DLBCL的細胞生物學功能及荷瘤小鼠存活時間的影響，為將myc作為潛在療效判斷指標提供理論依據(jù)。1、通過Lipofectamine2000脂質(zhì)體將myc基因轉(zhuǎn)染至人B細胞淋巴瘤細胞株中，檢測轉(zhuǎn)染效率，并設(shè)置陰性對照組和myc轉(zhuǎn)染組兩組，檢測PDL1mRN股PDL1蛋白含量，2、使用上述兩種細胞系制作裸鼠荷瘤槿型.分別觀察兩組小鼠的總牛存時間.研究myc表送與荷囑小鼠存活時間的關(guān)系；3、取出2中的裸鼠荷瘤，使用免疫組化檢測檢測PDL-1表達的改變。通過以上研究，明確myc通過上調(diào)PDL-1表達促進DLBCL細胞增殖的機制研究表達對DLBCL治療的作用以

25、及闡明其影響腫瘤生物學行為的分子生物學機制，為DLBCL的個體化治療提供新的藥物靶點和理論基礎(chǔ)?！狙芯磕繕恕?1)明確myc基因是DLBCL發(fā)生的重要原因。(2)證明myc能夠通過上調(diào)PDL-1表達促進DLBCL細胞增殖；為DLBCL的臨床診治特別是靶向治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。(3)證明干擾RNA對B細胞淋巴瘤細胞內(nèi)源性c-myc表達有抑制作用，從而為治療提供理論依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵科學問題】(1) myc在DLBCL發(fā)生中的作用。(2) myc可通過調(diào)節(jié)PDL-1的表達進而促進DLBCL增殖，并影響荷瘤小鼠存活時間。(3) 使用干擾RNA可抑制DLBCL細胞myc基因，為治療DLBCL潛

26、在的靶向藥物?！緞?chuàng)新之處】(1)首次明確myc基因可以促進DLBCL細胞增殖，其機制是促進PDL-1表達，抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，并最終促進DLBCL發(fā)生及增殖；(2)首次探討干擾RNA在DLBCL中對抑制內(nèi)源性myc基因的表達及對細胞增殖的影響，說明干擾RNA可作為腫瘤基因治療的基本策略。、擬采取的研究方法、技術(shù)路線【研究方法】1、從病理科標本庫中篩選DLBCL勺石蠟標本，通過免疫組織化學及FISH等方法檢測myc基因與PDL-1表達水平；收集DLBC味后新鮮組織標本，將上述指標在新鮮月中瘤組織中進一步驗證；其次，將已經(jīng)收集的DLBCL患者新鮮組織標本，檢測myc基因與PDL-1表達情況；最后，通過前瞻性研究、回顧卜t研究等手段分析患者月中瘤組織中myc基及PDL-1與患者治療療效的關(guān)系，評價myc基因與PDL-1表達水平及活性與患者生存時間的相關(guān)性。2、通過Lipofectamine2000脂質(zhì)體將myc基因轉(zhuǎn)染至人B細胞淋巴瘤細胞株中，檢測轉(zhuǎn)染效率，并設(shè)置空白對照組、陰性對照組和myc轉(zhuǎn)染組