食物中維生素B12的測定方法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上食物中維生素B6 的測定方法微生物法1.原理維生素B6在酸性介質(zhì)中對熱比較穩(wěn)定，但在堿性介質(zhì)中對熱不穩(wěn)定。測量維生素B6比較經(jīng)典的方法是"微生物法"它的優(yōu)點(diǎn)是：1.特異性高、精密度好、操作簡單（不需要特殊設(shè)備，易于推廣，樣品不需要進(jìn)行一系列的提純步驟）、準(zhǔn)確度高。它的缺點(diǎn)是：耗時長、必須經(jīng)常保存菌種、試劑較貴。2.適用范圍GB/T 17407-1998，適用于藥物、食物及飼料的檢測3.儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱電熱手提式壓力蒸汽消毒器液體快速混合器離心機(jī)722光柵分光光度計(jì)硬質(zhì)玻璃試管4.試劑（1） 0.22mol/L硫酸：于2000ml燒杯中加入700m

2、l水，加入12.32ml H2SO4，用水稀釋至1000ml。（2） 0.5mol/L硫酸：于2000ml燒杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀釋至1000ml。（3） 10mol/L氫氧化鈉：溶200g NaOH于水中，稀釋至500ml。（4） 0.1mol/L氫氧化鈉：取10ml 10mol/L NaOH，用水稀釋至1000ml。（5） 溴甲酚綠：0.04%溶液，稱取0.1g溴甲酚綠于研缽中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋到250ml。（6） 培養(yǎng)基：稱取吡哆醇Y培養(yǎng)基5.3g，溶解于100ml蒸餾水中。（7） 100u

3、g/ml吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取122mg鹽酸吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)溶于1L25%乙醇中，保存于4冰箱中，穩(wěn)定1個月。（8） 1ug/ml吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)中間液：，取1ml吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液，稀釋至100ml。（9） 瓊脂培養(yǎng)基：吡哆醇Y培養(yǎng)基5.3g，瓊脂1.2g，稀釋至100ml。（10） 1.5MOL/l生理鹽水：取9gNaCl溶于1000ml水中。5.菌種的制備與保存5.1儲備菌種的制備與保存：以卡爾斯伯酵母菌 ATCC No.9080簡稱SC?純菌種接入2個或多個瓊脂培養(yǎng)基管中，在30±0.5恒溫箱中培養(yǎng)18-20小時，取出后置于冰箱中保存，至多不超過兩星期。保存兩周以上的菌種，不能立即用作制備

4、接種用的種子液，一定要在使用前每天移種一次，連續(xù)23天，方可使用，否則生長不好。5.2種子培養(yǎng)液的制備：加0.5ml 50ng/ml的VB6標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液于尖管中，加入5ml基本培養(yǎng)基，塞好棉塞，于壓力蒸汽消毒器內(nèi)（高壓鍋）151b壓力下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保留數(shù)星期之久。6.操作步驟整個步驟要避光（1） 樣品制備：取樣0.510g（VB6含量不超過10ng）放入100ml三角瓶中，加0.22mol/LH2SO472ml。放入高壓蒸汽鍋121下水解5個小時，取出，于水中冷卻，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4調(diào)PH值至4.5，用溴甲酚綠做指示劑。（指示劑由黃-

5、黃綠色），將三角瓶內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至100ml，濾紙過濾，保存濾液即樣液于冰箱內(nèi)備測定（保存期不超過36小時）。（2） 接種液的制備：使用前一天，將卡爾斯伯酵母菌菌種由儲備菌種管移種于已消毒的種子培養(yǎng)液中，可同時接種兩管，在30±0.5的恒溫箱中培養(yǎng)18-20小時。取出離心10分鐘（3000rpm）傾去上部液體，用已消毒的生理鹽水淋洗2次，再加10ml消毒過的生理鹽水，將離心管置于液體快速混合器上混合，使菌種成為混懸體，將此液倒入已消毒的注射器內(nèi)，立即使用。3.樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取標(biāo)準(zhǔn)儲備液2ml稀釋至200ml成為中間液，從中間液中取5ml稀釋至10

6、0ml作為工作液，濃度為50ng/ml，3組試管各加0，0.02，0.04，0.08，0.12，和0.16ml工作液，再加5ml吡哆醇Y培養(yǎng)基，混勻，加棉塞。（3） 試樣的測定：在試管中分別加入0.05，0.10，0.20ml樣液，再加入5ml吡哆醇Y培養(yǎng)基，用棉塞塞住試管，將制備好的標(biāo)準(zhǔn)曲線和試樣測定管放入高壓鍋（121，15磅/英寸2）高壓10min，冷至室溫備用。（4） 接種和培養(yǎng)：每管接種一滴接種液，于30±0.5恒溫箱中培養(yǎng)18-22小時（5） 測定：從恒溫箱中取出后，用722分光光度計(jì)測量，用空白管調(diào)零。550nm波長下，測定各管的吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)管所含VB6的濃度為橫坐

7、標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制VB6標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用測定管得到的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到測定管內(nèi)所含VB6的量。7.計(jì)算各樣管的吡哆醇含量A為：A（ng/ml）=（x1/V1+x2/V2+x3/V3）/3則樣品的吡哆醇含量為：mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104每個樣品各測定管的吡哆醇含量為x1，x2，x3；取液量分別為V1，V2，V3樣品重W（g）取液量V（ml），定容至100ml8.注意事項(xiàng)（1） 所有步驟需要避光處理（2） 培養(yǎng)時每管必須在同一溫度，培養(yǎng)時間以18-24hour為宜。（3） 本實(shí)驗(yàn)所有用水皆采用蒸餾

8、水。食品中維生素B6的測定【GB/T 174071998】 本標(biāo)準(zhǔn)方法系在參考了美國公職分析家協(xié)會分析方法手冊（AOAC）公定分析方法及國外有關(guān)資料的基礎(chǔ)上，經(jīng)過系統(tǒng)研究而制定出來的。本方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、不需特殊儀器，易于推廣應(yīng)用。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國衛(wèi)生部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所負(fù)責(zé)起草；青海省衛(wèi)生防疫站和昆明醫(yī)學(xué)院參加起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：周瑞華、楊曉莉、王光亞。本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)解釋。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用微生物法測定食品中維生素B6的含量。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中維生素B6的測定。2原理卡爾斯伯(Saccharomyces

9、Carlsbrgensis)酵母菌需在有維生素B6存在的條件下才能生長，在一定條件下維生素B6的量與其生長呈正比關(guān)系。用比濁法測定該菌在樣品液中生長的混濁度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較得出樣品中維生素B6的含量。本方法檢出限為0.1ng。3試劑和培養(yǎng)基本實(shí)驗(yàn)所用的水均為蒸餾水。所用的試劑均需分析純。3.10.22mol/L硫酸溶液：取12.3mL相對密度為1.84的硫酸加水稀釋至1000mL。3.24mol/L、1mol/L及0.1mol/L氫氧化鈉溶液。3.325%(V/V)乙醇溶液。3.4維生素B6標(biāo)準(zhǔn)儲備液(0.1mg/mL)：精確稱取0.1220g經(jīng)干燥恒重的鹽酸吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)品，用25%乙醇定容至

10、1000mL。冰箱中保存。3.5維生素B6標(biāo)準(zhǔn)中間液(1.0g/mL)：吸取5.00mL維生素B6標(biāo)準(zhǔn)儲備液于500mL容量瓶中，用25%乙醇定容。冰箱中保存。3.6維生素B6標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(50ng/mL)：臨用時吸取5.00mL維生素B6標(biāo)準(zhǔn)中間液于100mL容量瓶中，用蒸餾水定容。3.7瓊脂3.8吡哆醇Y培養(yǎng)基(Pyridoxine Y medium Difc 00951152)：稱取5.3g吡哆醇Y培養(yǎng)基，用水稀釋至100mL。用時現(xiàn)配。3.9瓊脂培養(yǎng)基：稱取5.3g吡哆醇Y培養(yǎng)基、1.2g瓊脂于燒杯中，加入維生素B6標(biāo)準(zhǔn)中間液2mL(3.5)，加水至100mL，于水浴中加熱溶解，趁熱盡快

11、分裝入試管中，每管35mL，塞上棉塞，于121高壓滅菌5min。制成的斜面培養(yǎng)基，于4冰箱內(nèi)保存。3.10生理鹽水：稱取0.9g氯化鈉溶解于100mL水中。每次使用前，分別倒入24支15mL試管中，每支約10mL，塞上棉塞于121高壓滅菌5min，備用。3.110.04%溴甲酚綠溶液：稱取0.1g溴甲酚綠于小研缽中，加1.4mL 0.1 mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250mL。4儀器和設(shè)備4.1實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。4.2電熱恒溫培養(yǎng)箱。4.3壓力蒸氣消毒鍋。4.4液體快速混合器。4.5離心機(jī)。4.6分光光度計(jì)。4.7耐熱硬質(zhì)玻璃試管：12mm(i.d)

12、5;160mm。5菌種與培養(yǎng)液的制備及保存5.1儲備菌種的制備：以卡爾斯伯酵母菌純菌種(Saccharomyces Carlsbrgensis中科院微生物所No.AS：2.1419)接入23支瓊脂培養(yǎng)基管中，在30恒溫箱中培養(yǎng)1820h，取出，于冰箱中保存不超過兩周。保存數(shù)周以上的儲備菌種，不能立即做制備接種液用，必須在使用前每天移種一次，連續(xù)23次，才可使用。5.2種子培養(yǎng)液的制備：加5mL吡哆醇Y培養(yǎng)基及維生素B6標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.2mL(3.6)于試管中塞上棉塞，于121高壓滅菌5min，放冷，于冰箱中保存。每次制備24管備用。6操作步驟6.1種子液的制備：需無菌操作。用接種環(huán)從新鮮瓊脂斜面

13、培養(yǎng)基上取下卡爾斯伯酵母菌轉(zhuǎn)種到種子培養(yǎng)液(5.2)中塞上棉塞，以45°傾斜度于30溫度下培養(yǎng)1820h，在1500r/min下離心510min，棄去上清液，用滅菌生理鹽水洗菌種兩次，再用滅菌鹽水5mL稀釋該菌種，使成混濁液，即接種液。6.2樣品提取液的制備稱取樣品0.510g(維生素B6含量不超過10ng)放入100mL三角瓶中，加72mL 0.22mol/L硫酸溶液，用瓷坩堝蓋于瓶口，于121高壓水解樣品5h，取出冷卻后，加約10mL4mol/L氫氧化鈉，以滇甲酚綠作外指示劑，調(diào)節(jié)pH值至4.5(指示劑由藍(lán)綠色變?yōu)辄S綠色)。將三角瓶內(nèi)容物移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用

14、濾紙過濾后，濾液于冰箱中保存?zhèn)溆?保存期不宜超過36h)。6.3樣品試液管的制備每支試管中分別加入0.05，0.10，0.20mL的樣品提取液，每個樣品需做兩組，再加入5mL吡哆醇Y培養(yǎng)基。6.4標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備每支試管中分別加入維生素B6標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16mL(相當(dāng)于維生素B60，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0ng)，然后各加入5mL吡哆醇Y培養(yǎng)基。6.5滅菌樣品管(6.3)和標(biāo)準(zhǔn)管(6.4)混勻后，塞上棉塞，于121高壓滅菌5min。6.6接種和培養(yǎng)待試管冷至室溫后，在無菌條件下操作，用注射器在每支試管中接種一滴種子液，混勻后，于30溫箱

15、內(nèi)培養(yǎng)1820h。6.7測定將培養(yǎng)后的標(biāo)準(zhǔn)系列管和樣品管，在液體快速混合器上混勻后立即測定混濁度。用分光光度計(jì)于550nm波長下以標(biāo)準(zhǔn)系列的空白管調(diào)零點(diǎn)，分別讀取各管的光密度值。7計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)系列的含量(ng)為橫坐標(biāo)，以所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)系列的光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用樣品的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出每管中維生素B6含量，再折算成每毫升樣品中維生素B6含量。c(u1十u2十u3)/3(2)式中：X樣品中維生素B6的含量，mg/100g；c樣品提取液中維生素B6的濃度，ng/mL；各樣品測定管中維生素B6的濃度，ng/mL；V樣品提取液的定容總體積，mL；m樣品質(zhì)量，g；100/106折算成每1

16、00g樣品中維生素B6毫克數(shù)。8結(jié)果的重復(fù)性同一實(shí)驗(yàn)室同時或連續(xù)2次測定結(jié)果相對偏差絕對值10%。GB/T 5009.154-20035菌種與培養(yǎng)液的制備及保存5.1儲備菌種的制備：以卡爾斯伯酵母菌純菌種(Saccharomyces Carlsbrgensis中科院微生物所No.AS：2.1419)接入23支瓊脂培養(yǎng)基管中，在30恒溫箱中培養(yǎng)1820h，取出，于冰箱中保存不超過兩周。保存數(shù)周以上的儲備菌種，不能立即做制備接種液用，必須在使用前每天移種一次，連續(xù)23次，才可使用。5.2種子培養(yǎng)液的制備：加5mL吡哆醇Y培養(yǎng)基及維生素B6標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.2mL(3.6)于試管中塞上棉塞，于121高壓

17、滅菌5min，放冷，于冰箱中保存。每次制備24管備用。6操作步驟5.2.2接種液的制備：需無菌操作。使用前一天，將卡爾斯伯酵母菌菌種由儲備菌種管移種于已消毒的種子培養(yǎng)液中，可同時制備兩個管，以（45°傾斜度）于30溫度下培養(yǎng)1820h，在1500r/min下離心510min，棄去上清液，用滅菌生理鹽水洗菌種兩次，再用滅菌鹽水5mL稀釋該菌種，使成混濁液，即接種液。6.2樣品提取液的制備稱取樣品0.510g(維生素B6含量不超過10ng)放入100mL三角瓶中，加72mL 0.22mol/L硫酸溶液，用瓷坩堝蓋于瓶口，于121高壓水解樣品5h，取出冷卻后，加約10mL4mol/L氫氧化

18、鈉，以滇甲酚綠作外指示劑，調(diào)節(jié)pH值至4.5(指示劑由藍(lán)綠色變?yōu)辄S綠色)。將三角瓶內(nèi)容物移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用濾紙過濾后，濾液于冰箱中保存?zhèn)溆?保存期不宜超過36h)。6.3樣品試液管的制備每支試管中分別加入0.05，0.10，0.20mL的樣品提取液，每個樣品需做兩組，再加入5mL吡哆醇Y培養(yǎng)基。6.4標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備每支試管中分別加入維生素B6標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16mL(相當(dāng)于維生素B60，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0ng)，然后各加入5mL吡哆醇Y培養(yǎng)基。6.5滅菌樣品管(6.3)和標(biāo)準(zhǔn)管(6.4)混勻后，塞上棉塞，于

19、121高壓滅菌5min。6.6接種和培養(yǎng)待試管冷至室溫后，在無菌條件下操作，用注射器在每支試管中接種一滴種子液，混勻后，于30溫箱內(nèi)培養(yǎng)1820h。6.7測定將培養(yǎng)后的標(biāo)準(zhǔn)系列管和樣品管，在液體快速混合器上混勻后立即測定混濁度。用分光光度計(jì)于550nm波長下以標(biāo)準(zhǔn)系列的空白管調(diào)零點(diǎn)，分別讀取各管的光密度值。7計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)系列的含量(ng)為橫坐標(biāo)，以所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)系列的光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用樣品的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出每管中維生素B6含量，再折算成每毫升樣品中維生素B6含量。c(u1十u2十u3)/3(2)式中：X樣品中維生素B6的含量，mg/100g；c樣品提取液中維生素B6的濃度

20、，ng/mL；各樣品測定管中維生素B6的濃度，ng/mL；V樣品提取液的定容總體積，mL；m樣品質(zhì)量，g；100/106折算成每100g樣品中維生素B6毫克數(shù)。8結(jié)果的重復(fù)性同一實(shí)驗(yàn)室同時或連續(xù)2次測定結(jié)果相對偏差絕對值10%。微生食物中維生素B12的測定方法微生物測定法1.原理維生素B12對于Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）的正常生長是必需的，在一定生長條件下，Lactobacillusleichmannii的生長與繁殖速度和溶液中維生素B12的含量成一定的線性關(guān)系，利用濁度法或光密度法測定細(xì)菌生長和繁殖的強(qiáng)度可間接地測定食物樣品中維生素B12的含量。本方

21、法最低檢出限0.001ng。2.適用范圍本方法參考"Official Methods of Analysis of theAssociationof official AnalyticalChemists"、"MethodsofVitamin Analysis"以及"Methodsofthe Microbiological Analysis ofSelectedNutrients"。本方法適用于測定食物及飼料中的維生素B12含量。3.試劑本試驗(yàn)所用水均為蒸餾水，所用試劑均需分析純試劑。3.1 甲苯3.2 檸檬酸（C6H8O7·

22、;3H2O）3.3 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）3.4 焦亞硫酸鈉（Na2S2O5）3.5 抗壞血酸（生化試劑）3.6 無水葡萄糖3.7 無水乙酸鈉3.8 L-胱氨酸（生化試劑）3.9 D,L-色氨酸（生化試劑）3.10 10mol/L氫氧化鈉溶液：稱取200g氫氧化鈉溶于適量水中，定容至500ml。3.11 （1+4） 乙醇溶液：200ml無水乙醇與800ml水充分混勻。3.12 酸解酪蛋白：稱取50g不含維生素的酪蛋白于500ml燒杯中，加200 ml3mol/L鹽酸，121高壓水解6小時。將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，在沸水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀，如此反復(fù)3次，以

23、去除鹽酸。以溴酚藍(lán)作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.5。加20g活性炭，振搖，過濾，如果濾液不呈淡黃色或無色，可用活性炭重復(fù)處理。濾液加水稀釋至500ml，加少許甲苯于冰箱中保存。（該試劑也可從Difco公司購得，產(chǎn)品號為No.0288-15-6。）? 酸解的目的是為了消除酪蛋白中的維生素，確?；九囵B(yǎng)基中不含待測定的維生素B12，但有時酸水解不一定徹底，所以一定要選用不含維生素的酪蛋白粉（Sigma公司），這樣可較好地確保酸解酪蛋白中不含維生素B12。3.13 腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液：稱取硫酸腺嘌呤（純度為98%）、鹽酸鳥嘌呤（生化試劑）以及尿嘧啶各0.1g于250ml燒

24、杯中，加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉淀產(chǎn)生，加鹽酸數(shù)滴，再加熱，如此反復(fù)，直至冷卻后無沉淀產(chǎn)生為止，以水稀釋至100ml。加少許甲苯于冰箱中保存。3.14 維生素溶液：稱取25mg核黃素，25mg鹽酸硫胺素，0.25mg生物素，50mg尼克酸，用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000ml。3.15 維生素溶液：將50mg對氨基苯甲酸，25mg泛酸鈣，100mg鹽酸吡哆醇，100mg鹽酸吡哆醛，20mg鹽酸吡哆胺，5mg葉酸溶于（1+4）乙醇溶液，并定容至1000ml。3.16 甲鹽溶液：稱取25gKH2PO4、25gK2HPO4溶于500ml水中，加5滴

25、濃鹽酸。3.17 乙鹽溶液： 稱取10gMgSO47H2O、0.5gNaCl、0.5gMnSO44H2O，0.5gFeSO47H2O溶于水并定容至500ml，加5滴濃鹽酸。3.18 黃嘌呤溶液：稱取1.0g黃嘌呤溶于200ml水中，70加熱條件下，加入30mlNH4OH（2+3）L-天冬酰胺溶于水中，并定容至100ml。3.19 吐溫80溶液：將25g吐溫-80溶于乙醇并定容至250ml。3.20 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液（均使用棕色試劑瓶）（1）3.20.1維生素B12標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（100ng/ ml）：稱取50g（精度0.01mg天平）維生素B12暗紅色針狀結(jié)晶，用（1+4）的乙醇溶液定容至5

26、00ml，儲存在24條件下。（2）3.20.2維生素B12標(biāo)準(zhǔn)中間液（1ng/ml）：取1ml儲備液用（1+4）的乙醇定容 至100ml.貯存于24條件下。（3）3.20.3 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.02ng/ ml）：取1ml中間液用水定容至50ml，用時現(xiàn)配。? 維生素B12見光易分解，因此在配制標(biāo)準(zhǔn)液時要盡量避光，并且一定要使用棕色試劑瓶。3.21 基本培養(yǎng)基：將下列試劑混合于500ml燒杯中，加水至200ml，以溴甲酚紫作外指 示劑，用10mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH為6.06.1，用水稀釋至250ml。酸解酪蛋白25ml腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液5ml天冬胺酰溶液5ml吐溫-80

27、溶液5ml甲鹽溶液5ml乙鹽溶液5ml維生素溶液5ml維生素溶液5ml黃嘌呤溶液5ml抗壞血酸1.0gL-胱氨酸0.1gD,L-色氨酸0.1g無水葡萄糖10.0g無水乙酸鈉8.3g該培養(yǎng)基也可從Difco公司購得，產(chǎn)品號為No.0457-15-1。? 由于國內(nèi)某些試劑純度不夠，所以自行配制的培養(yǎng)基較渾濁，嚴(yán)重影響到最后的濁度測定結(jié)果，因此建議最好使用進(jìn)口培養(yǎng)基。3.22 瓊脂培養(yǎng)基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g無水葡萄糖，2g無水磷酸二氫鉀，100ml番茄汁，10ml吐溫-80溶液，每500ml液體培養(yǎng)基加5.07.5g瓊脂，加熱溶解，用10mol/L氫

28、氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.56.8，然后定容至1000ml，分裝于試管中，于121高壓滅菌10分鐘，取出后豎直試管，待冷卻至室溫后于冰箱保存。3.23 生理鹽水：稱取9.0g氯化鈉溶于1000ml水中，。每次使用時分別倒入24支試管中，每支約加10ml，塞好棉塞，于121高壓滅菌10分鐘，備用。3.24 0.4g/L溴甲酚紫指示劑：稱取0.1g溴甲酚紫于小研缽內(nèi)，加1.6ml 0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。4.儀器與設(shè)備4.1 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備4.2 電熱恒溫培養(yǎng)箱4.3 壓力蒸汽消毒器4.4 液體快速混合器4.5 離心機(jī)4.6 硬質(zhì)玻璃試管：20

29、mm×150mm5.菌種與培養(yǎng)液的制備與保存5.1 儲備菌種的制備：Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）接種于直面瓊脂培養(yǎng)管中，在37±0.5恒溫箱中培養(yǎng)1624小時，取出后放入冰箱中保存。每周至少傳種二次以上。在實(shí)驗(yàn)前一天必須傳種一次。?Lactobacillusleichmannii （ATCC7830）的生命力不強(qiáng)，每周一定要至少傳代2-3次，否則極易死亡!5.2 種子培養(yǎng)液的制備：加2ml 0.02ng/ml維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液和3ml基本培養(yǎng)基于10ml離心管中，塞好棉塞，于121高壓滅菌10分鐘，取出冷卻后于冰箱中保存。每次制備

30、兩管，備用。? 加入離心管中的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液要適量，過少會阻礙Lactobacillus Leichmanni的生長，過多會使零管中的光密度值增大，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般2-3ml即可。6. 操作步驟6.1 接種液的配制：使用前一天，將已在瓊脂管中生長1624小時的L.leichmannii 接種于種子培養(yǎng)液中，在37±0.5培養(yǎng)1624小時，取出后離心10分鐘（3000rpm），棄去上清液，用已滅菌的生理鹽水淋洗2次，再加入3ml滅菌生理鹽水，混勻后，將此液倒入已滅菌的注射器中，立即使用。6.2 水解液的制備：稱取1.3g無水磷酸二氫鈉、1.2g檸檬酸及0.1g焦亞硫酸

31、鈉（Na2S2O5），溶于水中并定容至100ml，用時現(xiàn)配。6.3 稱取適量樣品，至于100ml三角瓶中，加70ml水解液，混勻，于121高壓滅菌10分鐘，取出冷卻至室溫，過濾，然后以溴甲酚紫為外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為6.06.1，將水解液移至100ml容量瓶中，定容至刻度。為保證最后樣品測定管中的Na2S2O5的濃度0.03mg/ml，因此要做適當(dāng)?shù)南♂尅? 測定管中Na2S2O5的濃度一定要小于0.03mg/ml，過多會抑制L.Leichmannii的生長，因此在稱取樣品時要考慮到后來的稀釋倍數(shù)，避免由于稀釋倍數(shù)過大造成測定管中的維生素B12含量過低，無法檢出。? 實(shí)驗(yàn)所用的所有試管必須在烤箱中180-200條件下干熱滅菌2-3小時。6.4 樣品試管的制備：每組平行樣品管中分別加入1.0、2.0、3.0、4.0ml樣品水解液，并用水稀釋至5ml，然后再加入5ml基本液體培養(yǎng)基。6.5 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備：每組試管中分別加