課題2　土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

1、課題背景課題背景尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2 重要的農(nóng)業(yè)重要的農(nóng)業(yè)氮肥氮肥。只有被土壤中細(xì)菌分解為只有被土壤中細(xì)菌分解為NHNH3 3才能被植物吸收利用才能被植物吸收利用脲酶脲酶CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3 課題課題2 2 土壤分解尿素的細(xì)菌的分土壤分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)離與計(jì)數(shù) 1.從土壤中分離出從土壤中分離出 2.統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)樣品中究竟含有樣品中究竟含有課題目的課題目的一、研究思路一、研究思路(一一)篩選菌種篩選菌種尋找耐高溫的尋找耐高溫的DNA聚合酶聚合酶耐高溫耐高溫的酶的酶耐高溫耐高溫生物體生物體耐高溫耐高溫環(huán)境（熱泉、火山口）環(huán)境（熱泉、火山口）

2、尋找尋找尋找尋找Taq細(xì)菌細(xì)菌篩選原理篩選原理人為提供人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件的條件( (包括營(yíng)包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、養(yǎng)、溫度、pHpH等等) )，同時(shí)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。生長(zhǎng)。思考思考: 1. 該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？源和氮源的分別是什么物質(zhì)？碳源碳源：葡萄糖、尿素：葡萄糖、尿素氮源氮源：尿素：尿素2.2.從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？培養(yǎng)基？固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基 3. 此配

3、方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？此配方能否篩選出產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌？為什么？原則上能。只有產(chǎn)生原則上能。只有產(chǎn)生脲酶脲酶的細(xì)菌能的細(xì)菌能利用尿素作為氮源利用尿素作為氮源而生存。而生存。（二）如何對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)？（二）如何對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)？方法方法 常用常用稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法來來統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)樣品中的樣品中的活菌活菌數(shù)。數(shù)。原理原理 1 1個(gè)菌落個(gè)菌落1 1個(gè)活菌個(gè)活菌101102103104105106選擇菌落數(shù)在選擇菌落數(shù)在3030300300的平板上計(jì)數(shù)。的平板上計(jì)數(shù)。需培養(yǎng)計(jì)算出需培養(yǎng)計(jì)算出三個(gè)或三個(gè)以上三個(gè)或三個(gè)以上的平板的平板菌落菌落, ,求求平均數(shù)平均數(shù)。統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)

4、際數(shù)目統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低低。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)看課本看課本P22，并討論你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如，并討論你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯(cuò)在哪？果有問題，錯(cuò)在哪？ 第一位同學(xué)：沒有第一位同學(xué)：沒有重復(fù)實(shí)驗(yàn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布（至少涂布3 3個(gè)平板）個(gè)平板）第二位同學(xué)：第二位同學(xué)：A A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計(jì)算平均值計(jì)算公式：計(jì)算公式：某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106 的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1ml） ( )A. 2.34108B. 2.34109C. 234D

5、. 23.4 B每克樣品中的菌株數(shù)每克樣品中的菌株數(shù) =（CV）M閱讀閱讀P22P222323頁頁“（三）設(shè)置對(duì)照（三）設(shè)置對(duì)照”一段討論教材中提出一段討論教材中提出的問題。的問題。排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，提排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。(1)A(1)A同學(xué)出現(xiàn)此結(jié)果的可能原因？同學(xué)出現(xiàn)此結(jié)果的可能原因？(2)(2)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，幫助設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，幫助A A同學(xué)排除上述兩個(gè)可能同學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素？影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素？這個(gè)實(shí)例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，這個(gè)實(shí)例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不

6、可少對(duì)照的設(shè)置是必不可少實(shí)驗(yàn)流程：實(shí)驗(yàn)流程：樣品稀釋涂布平板樣品稀釋涂布平板微生物的培養(yǎng)與觀察微生物的培養(yǎng)與觀察 菌落計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù)二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤取樣土壤取樣制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基（一）土壤取樣（一）土壤取樣從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤(rùn)土壤中取樣。從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤(rùn)土壤中取樣。先鏟去先鏟去表層土表層土3cm3cm左右左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。封中。（二）制備培養(yǎng)基（二）制備培養(yǎng)基制備制備選擇培養(yǎng)基（尿素為唯一氮源）選擇培養(yǎng)基（尿素為唯一氮源）制備制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目

7、應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對(duì)照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。（三）樣品稀釋涂布平板（三）樣品稀釋涂布平板稀釋倍數(shù)為稀釋倍數(shù)為 10101 1 10106 6。每個(gè)稀釋度均用。每個(gè)稀釋度均用3 3個(gè)選擇培養(yǎng)基個(gè)選擇培養(yǎng)基和和1 1個(gè)蛋白胨培養(yǎng)基個(gè)蛋白胨培養(yǎng)基。（四）微生物的培養(yǎng)與觀察（四）微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。 培養(yǎng)不同微

8、生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。不同種類的細(xì)菌形成的菌落，在大小、形狀、光不同種類的細(xì)菌形成的菌落，在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的特澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，征，菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據(jù)菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據(jù)。菌落菌落1 1、取土用的、取土用的小鐵鏟小鐵鏟的盛土樣的的盛土樣的信封信封在使用前都需要在使用前都需要滅菌滅菌。2 2、應(yīng)在、應(yīng)在火焰旁火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶稱取土壤。在火焰附近將

9、稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。中，塞好棉塞。3 3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁火焰旁操作。操作。注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。三、操作提示三、操作提示四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1. 1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落？是否篩選出菌落？ 對(duì)照的培養(yǎng)皿對(duì)照的培養(yǎng)皿無菌落說明培養(yǎng)基沒有污染無菌落說明培養(yǎng)基沒有污染。 牛肉膏培養(yǎng)基的牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目多余選擇培養(yǎng)基的菌菌落數(shù)目多余選擇培養(yǎng)基的菌落數(shù)目落數(shù)目

10、，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 2. 2.獲得某一稀釋度下，菌落數(shù)獲得某一稀釋度下，菌落數(shù)3030300300的平板，的平板，在這以稀釋度下是否至少有兩個(gè)平板的菌落數(shù)相在這以稀釋度下是否至少有兩個(gè)平板的菌落數(shù)相接近？接近？ 相接近，說明操作成功。相接近，說明操作成功。方法：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基方法：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果如果pHpH升高，指示劑將變紅。升高，指示劑將變紅。濾膜法濾膜法 以測(cè)定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目為例。將已知以測(cè)定飲用水中大

11、腸桿菌的數(shù)目為例。將已知體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)液基上體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)液基上培養(yǎng)。在該培養(yǎng)基上，大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色。培養(yǎng)。在該培養(yǎng)基上，大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色。可以根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目，計(jì)算出水樣中可以根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目，計(jì)算出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌的數(shù)量。微生物計(jì)數(shù)微生物計(jì)數(shù)鞏固練習(xí)1.1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.A.培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌 B.B.培養(yǎng)真菌培養(yǎng)真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物

12、加以區(qū)別2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是別是( )( ) A.COA.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素C CD D3.3.下列說法不正確的是（下列說法不正確的是（ ）A.A.科學(xué)家從科學(xué)家從70708080度熱泉中分離到耐高溫的度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNATaqDNA聚聚 合酶。合酶。B.B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5 5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1M1、M2M2、 M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值。作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值。C.C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果