細胞電生理學及膜片鉗技術

1、cell electrophysiology & patch clamp techniques 1991 Nobel基金會的頒獎評語： 膜片鉗技術點燃了細胞和分子水平的生理學研究的革命之火，為細胞生理學的研究帶來了一場革命性的變化，它和基因克隆技術并駕齊驅，給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。2、膜片鉗技術及其應用、膜片鉗技術及其應用 3、離子通道藥理學、離子通道藥理學1、細胞電生理學、細胞電生理學OUTLINE 細胞電生理學細胞電生理學 Electrophysiology細胞生理學：揭示細胞的生理過程，用電生細胞生理學：揭示細胞的生理過程，用電生理方法記錄生物電活動理方法記錄生物電活

2、動測量測量離子、離子通道離子、離子通道細胞興奮細胞興奮生物電信號生物電信號細胞生理學細胞生理學膜的膜的“流動鑲嵌模型流動鑲嵌模型”細胞膜和離子學說建立（細胞膜和離子學說建立（Hodgkin，et al . 1946年年 ）磷脂雙層的磷脂雙層的屏蔽作用屏蔽作用Na-K 泵泵K+o Na+i離子通道 (ion channels)(ion channels) 離子通道是細胞膜上的一種特殊整合蛋白，對某離子通道是細胞膜上的一種特殊整合蛋白，對某些離子（些離子（K K+ +、NaNa+ +、CaCa2+2+等等）能）能選擇通透選擇通透，其功能是，其功能是細細胞生物電活動胞生物電活動的基礎。的基礎。 特性

3、：特性：通透性（permeation） 選擇性（selectivity） 門控性（gating） 研究技術：研究技術： 膜片鉗技術和分子克隆技術膜片鉗技術和分子克隆技術 配體門控通道配體門控通道 陽離子通道：乙酰膽堿、谷氨酸、五羥色胺受體陽離子通道：乙酰膽堿、谷氨酸、五羥色胺受體 陰離子通道：甘氨酸和陰離子通道：甘氨酸和氨基丁酸受體氨基丁酸受體 乙酰膽堿受體乙酰膽堿受體 電壓門控通道電壓門控通道：鉀、鈉、鈣離子通道鉀、鈉、鈣離子通道電壓門控鉀離子通道電壓門控鉀離子通道 環(huán)核苷酸門控通道環(huán)核苷酸門控通道 氣味分子與氣味分子與G蛋白偶聯型受體結合，激活腺苷酸環(huán)化酶，蛋白偶聯型受體結合，激活腺苷酸環(huán)

4、化酶，產生產生cAMP，開啟，開啟cAMP門控陽離子通道（門控陽離子通道（cAMP-gated cation channel），引起鈉離子內流，膜去極化，產生神經），引起鈉離子內流，膜去極化，產生神經沖動，最終形成嗅覺或味覺。沖動，最終形成嗅覺或味覺。 機械門控通道機械門控通道 一類是牽拉活化或失活的離子通道，另一類是剪切力敏一類是牽拉活化或失活的離子通道，另一類是剪切力敏感的離子通道，前者幾乎存在于所有的細胞膜，研究較多感的離子通道，前者幾乎存在于所有的細胞膜，研究較多的有血管內皮細胞、心肌細胞以及內耳中的毛細胞等，后的有血管內皮細胞、心肌細胞以及內耳中的毛細胞等，后者僅發(fā)現于內皮細胞和心肌

5、細胞者僅發(fā)現于內皮細胞和心肌細胞 水通道水通道 2003年諾貝爾化學獎：年諾貝爾化學獎： Pete Agre、 Roderick MacKinnon2、膜片鉗技術及其應用、膜片鉗技術及其應用3、離子通道藥理學、離子通道藥理學 1、細胞電生理學、細胞電生理學OUTLINE 電生理學研究簡史： 二千年前，觀察到電鰩魚放電現象。 1825年，Nobili發(fā)明了電流計，用其證實了肌肉有電流存在。 1912年，Bridge 確定了AP的“全或無”現象。同年，Oxford提出了突觸的概念及反射弧的生理學研究，獲1932年Nobel獎。 1937年，Hodgkin和Huxley在槍烏賊巨大神經軸突細胞內實現

6、細胞內電記錄，獲1963年Nobel獎。 1946年，凌寧和Gerard創(chuàng)造拉制出尖端直徑小于1m的玻璃微電極，并記錄了骨骼肌的電活動。玻璃微電極的應用使的電生理研究進行了革命性的變化。 Voltage clamp（電壓鉗技術）由Cole和Marmont 發(fā)明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正開始了定量研究，建立了HH模型（膜離子學說),是近代興奮學說的基石。 1948年，Katz利用細胞內微電極技術記錄到了終板電位；1969年，又證實NM接觸后的Ach以“量子式”釋放，獲1976年Nobel獎。 1976年，德國的Neher和Sakmann發(fā)明Patch Clamp（膜片鉗）。

7、并在蛙橫紋肌終板部位記錄到乙酰膽堿引起的通道電流。 1980年，Sigworth、 Hamill、Neher等在記錄電極內施加負壓吸引，得到了10100 G的高阻封接(giga seal)，大大降低記錄噪聲，實現了單根電極既鉗制膜電位又記錄單通道電流。獲1991年Nobel獎。History of Ion Channel Study 1955年，Hodgkin和Keens應用電壓鉗(Voltage clamp)在研究神經軸突膜對鉀離子通透性時發(fā)現，放射性鉀跨軸突膜的運動很像是通過許多狹窄空洞的運動，并提出了“通道”的概念。 1963年，描述電壓門控動力學的Hodgkin-Huxley模型（簡稱

8、H-H模型），榮獲諾貝爾醫(yī)學/生理學獎。 1976年，Neher和Sakmann建立膜片鉗(Patch clamp)技術。 1983年10月，Single-Channel Recording一書問世，奠定了膜片鉗技術的里程碑。 1991年， Neher和Sakmann的膜片鉗技術榮獲諾貝爾醫(yī)學/生理學獎。1963年諾貝爾生理學/醫(yī)學獎發(fā)現了發(fā)現了神經細胞膜的周邊和中央部分與興奮和抑神經細胞膜的周邊和中央部分與興奮和抑制有關的離子機制制有關的離子機制艾克爾斯艾克爾斯Sir John Carew Eccles澳大利亞澳大利亞澳大利亞國家大學澳大利亞國家大學1903年年-1997年年 霍奇金霍奇金A

9、lan Lloyd Hodgkin英國英國英國劍橋大學英國劍橋大學1914年年-1998年年赫克斯利赫克斯利Andrew Fielding Huxley英國英國英國倫敦大學英國倫敦大學1917年年-The Nobel Prize in Physiology or Medicine (1991) Erwin Neher Bert Sakmann 1/2 of the prize 1/2 of the prize Federal Republic of Germany Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fr Biophysikalisc

10、he Chemie, Goettingen, Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fr medizinische Forschung, Heidelberg, Federal Republic of Germany b. 1944b. 1942膜片鉗技術 膜片鉗技術：從一小片(約幾平方微米) 膜獲取電子學方面信息的技術，即保持跨膜電壓恒定電壓鉗位，從而測量通過膜離子電流大小的技術。通過研究離子通道的離子流， 從而了解離子運輸、信號傳遞等信息?；驹?利用負反饋電子線路,將微電極尖端所吸附的一個至幾個平方微米的細胞膜的電位固定在一定水

11、平上,對通過通道的微小離子電流作動態(tài)或靜態(tài)觀察,從而研究其功能。 膜片鉗技術實現膜電位固定的關鍵是在玻璃微電極尖端邊緣與細胞膜之間形成高阻（ 10 ）密封,使電極尖端開口處相接的細胞膜片與周圍環(huán)境在電學上隔離,并通過外加命令電壓鉗制膜電位。 由于玻璃微電極尖端管徑很小,其下膜面積僅約12,離子通道數量很少,一般只有一個或幾個通道,經這一個或幾個通道流出的離子數量相對于整個細胞來講很少,可以忽略,也就是說電極下的離子電流對整個細胞的靜息電位的影響可以忽略,那么,只要保持電極內電位不變,則電極下的一小片細胞膜兩側的電位差就不變,從而實現電位固定。膜片鉗技術的優(yōu)點 膜片鉗技術實現了小片膜的孤立和高阻

12、封接的形成，由于高阻封接使背景噪聲水平大大降低，相對地增寬了記錄頻帶范圍，提高了分辨率。另外,它還具有良好的機械穩(wěn)定性和化學絕緣性。而小片膜的孤立使對單個離子通道進行研究成為可能。膜片鉗記錄的各種模式 根據膜片與電極之間的關系，可將膜片記錄主要分為種模式 。首先建立的單通道記錄法（Single channel recording）是細胞吸附式，其后又建立了膜內面向外和膜外面向外的模式；還有一種是全細胞記錄法（hole cell recording）的全細胞式。現在又發(fā)展了開放的細胞吸附式膜內面向外和穿孔囊泡膜外面向外的模式 ，以及穿孔膜片的模式。細胞吸附膜片(cell-attached pat

13、ch mode) 一種將微電極吸附在細胞膜上對單離子通道電流進行記錄的模式。優(yōu)點是不破壞細胞的完整性, 內環(huán)境保持正常。缺點是不能人為直接地控制細胞內環(huán)境條件，不能確切判明細胞內電位。即使在浴液中加入刺激物質，也不能到達與電極內液接觸的膜片的細胞外面。但是，如果膜片離子通道對浴液中的刺激物有反應，則可以說明這種刺激物是經過某些細胞內第二信使的介導間接地起作用。內面向外膜片(inside-out patch) 在細胞吸附模式高阻封接形成后,將微管電極提起,使吸附的膜片從胞體上被切割下來，就得到“內面向外”膜片。此種模式，可直接且自由地經浴液介導而調控細胞內液的條件，并可在和細胞活動無關的形式下觀

14、察到單一離子通道的活動。但是，由于胞質滲漏，可能丟失某種通道調控因子，離子通道活動出現run-down （或run-up）現象。全細胞記錄式(hole-cell recording) 在細胞吸附模式下繼續(xù)以負壓抽吸使電極管內細胞膜破裂,電極胞內液與胞內液直接相通,而與浴槽液絕緣,這種形式記錄膜片以外部位的全細胞膜的離子電流。它既可記錄膜電位又可記錄膜電流。其中膜電位可在電流鉗情況下記錄,或將玻管連到標準高阻微電極放大器上記錄。外面向外膜片(outside-out patch) 在全細胞模式上將微管電極向上提起,可得到切割分離的膜片，斷端游離部分自行融合成脂質雙層,此時高阻封接仍然存在。而膜外側

15、面接觸浴槽液。用這種模式，可自由改變細胞外液的情況下，記錄單一離子通道的電流活動。開放細胞吸附膜內面向外模式（open cell-attached inside-out mode） 將細胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜進行機械地破壞，經破壞孔調控細胞內液，并在細胞吸附狀態(tài)下進行內面向外的單一離子通道記錄。這種方法的細胞體積越大，破壞部位離被吸附膜片越遠或破壞孔越小，都可導致細胞因子外流變慢。穿孔膜片模式（perforated patch mode） 為克服全細胞模式的胞質滲漏問題，Horn和Marty將與離子親和的制霉菌素（或二性霉素）經膜片微電極灌流到含類甾醇的細胞膜片上，形成只允許一價離子

16、通過的孔，用此法在膜片上做很多導電性孔道借此對全細胞膜電流進行記錄。因為此模式的胞質滲漏極為緩慢，局部串聯阻抗較全細胞模式高，所以鉗制速度很慢，故也稱為緩慢全細胞模式。穿孔囊泡膜外面向外模式(perforated vesicle outside-out mode) 穿孔膜片模式將電極向上提起，便在微電極尖端處形成一個膜囊泡（膜內面向外膜片斷端融合封閉而成）。如果條件較好，此膜囊泡內不僅有細胞質因子還可有線粒體等細胞器存在。所以在有比較接近正常的細胞內信號傳遞條件和代謝條件的基礎上，可能記錄到膜外面向外模式的單一離子通道。 過去認為，膜片鉗只能在培養(yǎng)細胞或酶解的細胞上進行，這樣得到的細胞膜表面比

17、較光滑，才能夠形成高阻封接，但缺點是組織的正常三維結構被破壞，并且對神經中樞內突觸特有的傳遞機能的研究無法展開。于是，一些學者建立了組織切片膜片鉗技術（Slice patch），就能在哺乳動物腦片制備上做全細胞記錄。組織切片膜片鉗技術（Slice patch） 1992年，在腦片膜片鉗技術上，美國Ferster 實驗室首次報道在在體貓的視皮層用膜片鉗全細胞記錄研究了視刺激誘發(fā)的興奮性和抑制性突觸后電位相互影響及節(jié)律性膜電位的變化規(guī)律。 1993年，德國的Dodt和Sakmann合作，利用紅外電視顯微鏡監(jiān)視，使得膜片鉗記錄不但能夠在神經元胞體及其樹突上進行，而且可同時在這兩個不同的部位作膜片鉗記

18、錄。 為研究化學門控性通道性質，我國學者秦達意采用 oil-gate concentration jump method，配合膜片鉗記錄和分析離子通道在各種化學條件下的開放與關閉以及激活與失活的動態(tài)過程。膜片鉗技術的應用 分辨單通道電流,直接觀察通道的開閉過程; 區(qū)分離子通道的離子選擇性及其門控特性(如區(qū)分電壓、化學或門控性通道),發(fā)現新的離子通道及亞型; 在記錄單個通道電流()和全細胞電流()的基礎上,可分別計算出細胞膜上的通道數()和開方概率(),依公式=; 用以檢測某些遞質能否打開通道(外面向外膜片),或是否接受第二信使的調控(內面向外膜片); 研究腺苷酸環(huán)化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶等活性變化,以及細胞膜上信使物質二酰甘油花生四烯酸等對離子通道型受體的調節(jié)機制(應用全細胞鉗或外面向外膜片); 研究受體的激活態(tài)、失活態(tài)和靜息態(tài)的功能； 研究不同離子強度對通道特性的影響及細胞內信使物質如1,4,5-三磷酸肌醇、環(huán)腺苷酸(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、Ca2+等對離子通道型受體的調節(jié)機制(內面向外膜片)。 研究藥物對電壓和化學內控性通道的影響。 Neher等首創(chuàng)將膜片鉗技術與Fura 2 熒光測鈣技術結合,同時進行如細胞內熒光強度、細胞膜離子通道電流及細胞膜電容等多指標變化的快速交替測定,這樣便可得出同一事件過程中,多種因素