分子生物學(xué)第17講

1、會(huì)計(jì)學(xué)1分子生物學(xué)第分子生物學(xué)第17講講第1頁/共68頁相對(duì)位置：第2頁/共68頁調(diào)控形式n（一）半乳糖代謝n1，半乳糖代謝相關(guān)的酶n（1）半乳糖激酶n（2）半乳糖轉(zhuǎn)移酶n（3）半乳糖表異構(gòu)酶第3頁/共68頁n2，代謝步驟n（二）gal操縱元n1，gal操縱元組成n（1）結(jié)構(gòu)基因（galK，galT，galE）n（2）調(diào)節(jié)基因（galR）n（3）P/O位點(diǎn)第4頁/共68頁n2， gal操縱元的啟動(dòng)子（圖89）n（1）gal P1n（2）gal P2第5頁/共68頁n（三）cAMP-CAP對(duì)galP1和gal P2的控制n1 ， g a l 啟 動(dòng) 子 的cAMP-CAP結(jié)合位點(diǎn)n（1）位置：-

2、76-47n（2）序列特點(diǎn)（圖810）第6頁/共68頁n2，cAMP-CAP對(duì)S1轉(zhuǎn)錄的激活及對(duì)S2轉(zhuǎn)錄的阻遏對(duì)galP1對(duì)galP2第7頁/共68頁n（四）Gal阻遏蛋白的作用機(jī)制n1，gal阻遏蛋白的作用位點(diǎn)n2， gal阻遏蛋白可能的作用機(jī)制n（1） gal阻遏蛋白與galOE結(jié)合，可能通過以下途徑發(fā)揮作用第8頁/共68頁n（） gal阻遏蛋白與galOI結(jié)合可能導(dǎo)致兩個(gè)操作子之間的DNA形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，兩個(gè)阻遏蛋白通過相互作用而強(qiáng)化了阻遏效應(yīng)第9頁/共68頁n（五）gal操縱元雙啟動(dòng)子的意義n1，半乳糖的雙重作用n（1）作為細(xì)菌的碳源n（2）UDPGal是細(xì)菌細(xì)胞壁的重要前體n2，雙啟動(dòng)

3、子的作用n（1）galP1保證細(xì)菌可以利用半乳糖作為碳源n（2）galP2保證有葡萄糖存在時(shí)，細(xì)菌可以合成UDPGal第10頁/共68頁n二、阿拉伯糖操縱元：具有雙重功能（正調(diào)控和負(fù)調(diào)控）的調(diào)節(jié)蛋白n(一)阿拉伯糖代謝酶基因的操縱元n1，阿拉伯糖調(diào)控元n（1）三個(gè)參與阿拉伯糖代謝的酶的基因的操縱元n（2）調(diào)控元：由一個(gè)調(diào)節(jié)基因控制幾個(gè)操縱元的系統(tǒng)第11頁/共68頁n2，araBAD操縱元的組成n（1）結(jié)構(gòu)基因n（ 2 ） 操 縱 元 結(jié) 構(gòu)（圖8-11）n（二）araBAD操縱元的調(diào)控第12頁/共68頁n1，araC基因產(chǎn)物及其結(jié)合位點(diǎn)n（ 1 ） a r a C 基 因 對(duì)araBAD正調(diào)控

4、的遺傳學(xué)證據(jù)n（2）AraC蛋白的2種形式n（3）AraC結(jié)合位點(diǎn)第13頁/共68頁n2，對(duì)araBAD操縱元起調(diào)控作用的因素n（1）Crep 對(duì)araBAD 及araC的作用nA，Crep 與araO1結(jié)合nB，Crep 與araO2結(jié)合n（2）Cind對(duì)araBAD 及araC的作用n（3）cAMP-CAP是araBAD和araC表達(dá)的正調(diào)控因子第14頁/共68頁n3，araBAD操縱元的調(diào)控（圖812）n（1）無AraC及cAMP-CAP時(shí)，araC轉(zhuǎn)錄，但很快會(huì)被Crep所阻遏（自身調(diào)控）n（2）有AraC，無cAMP-CAP時(shí)，araBAD和araC均不轉(zhuǎn)錄n（3）有AraC，阿拉伯

5、糖及cAMP-CAP時(shí)，araBAD轉(zhuǎn)錄n（4）Cind 和cAMP-CAP促進(jìn)araBAD轉(zhuǎn)錄的機(jī)制促進(jìn)RNA聚合酶與araBAD的結(jié)合并形成開放性啟動(dòng)子復(fù)合物第15頁/共68頁n 三、 色氨酸操縱元：可阻遏系統(tǒng)n（一） trp操縱元的結(jié)構(gòu)n1， 結(jié)構(gòu)基因及其編碼的酶n2，前導(dǎo)序列n3，終止子n4，調(diào)節(jié)基因第16頁/共68頁n（二）Trp操縱元的阻遏調(diào)控n1，Trp的作用Trp有兩方面的作用n（1）對(duì)已有的酶起反饋 抑 制 （ f e e d b a c k inhibition）n（2）作為trp無活性的阻遏蛋白的輔阻遏物第17頁/共68頁n2，TrpR的作用n（1）TrpR的活性形式n（

6、2）TrpR的作用機(jī)制第18頁/共68頁第五節(jié) 基因表達(dá)的時(shí)序調(diào)控第19頁/共68頁聚合酶相互作用而實(shí)現(xiàn)的第20頁/共68頁n一、噬菌體基因表達(dá)特點(diǎn)概述n（一）噬菌體基因組構(gòu)成n1，基因構(gòu)成n（1）轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的基因感染初期噬菌體均利用宿主的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，隨后噬菌體合成一些自身編碼的蛋白質(zhì)，對(duì)宿主的RNA聚合酶進(jìn)行替代或修飾，其結(jié)果是使轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)優(yōu)先轉(zhuǎn)錄噬菌體的mRNA。噬菌體傾向于使用宿主的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)第21頁/共68頁n（2）DNA復(fù)制相關(guān)基因噬菌體常利用宿主的復(fù)制體系成分，這些基因與復(fù)制的起始有關(guān)，有的噬菌體基因組編碼DNA聚合酶和某些復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)第22頁/共68頁n（3）噬菌體顆粒

7、結(jié)構(gòu)和裝配相關(guān)基因通常，噬菌體的頭部和尾部需要許多種蛋白質(zhì)，因此，噬菌體晚期功能區(qū)構(gòu)成了基因組的最大部分第23頁/共68頁n2，遺傳圖譜的特點(diǎn)噬菌體的遺傳圖譜的組織常常反映其基因表達(dá)的順序。在噬菌體中，操縱元的作用被發(fā)揮到極致。編碼功能相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因聚集成簇，使得少數(shù)幾個(gè)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)就可以控制整個(gè)基因組的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)最經(jīng)濟(jì)的調(diào)控第24頁/共68頁n（二）溶菌周期的分期n1，早期感染（early infection）：指噬菌體DNA進(jìn)入宿主到噬菌體DNA復(fù)制開始的一段時(shí)間。這一時(shí)期主要是產(chǎn)生DNA復(fù)制所需的酶第25頁/共68頁n2，晚期感染（late infection）：指噬菌體DNA復(fù)制開始

8、到細(xì)菌裂解，釋放后代噬菌體顆粒的一段時(shí)間。在這段時(shí)期，噬菌體完成DNA的復(fù)制、噬菌體顆粒的蛋白組分的合成。除此還需要合成組裝蛋白和溶菌蛋白，幫助組裝噬菌體顆粒和最終釋放子代噬菌體第26頁/共68頁n（三）噬菌體基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)式控制q噬菌體的基因表達(dá)是在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的級(jí)聯(lián)式控制進(jìn)行的。前一個(gè)階段的基因表達(dá)是后一個(gè)階段基因表達(dá)所必需的。在每個(gè)階段有一個(gè)或多個(gè)基因產(chǎn)物作為后續(xù)階段的調(diào)節(jié)物。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)可以是新的RNA聚合酶、新的亞基和抗終止因子等第27頁/共68頁n1，第一階段的基因表達(dá)噬菌體感染第一個(gè)階段的基因表達(dá)要依賴宿主的轉(zhuǎn)錄體系。這些基因常被成為早期基因（early genes），在噬菌體中稱為

9、極早期基因（immediate early genes）。這些基因的啟動(dòng)子和宿主基因的啟動(dòng)子是沒有區(qū)別的。通常這個(gè)階段只表達(dá)少數(shù)幾個(gè)基因，其中總有一個(gè)基因編碼下一批基因表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)第28頁/共68頁n2，第二階段的基因表達(dá)這個(gè)階段表達(dá)的基因被稱為遲早期基因或中期基因。這批基因通常在早期基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)一出現(xiàn)就開始表達(dá)。此時(shí)宿主的基因表達(dá)常常被抑制第29頁/共68頁n3，晚期基因表達(dá)當(dāng)噬菌體DNA復(fù)制開始，晚期基因開始表達(dá)。其轉(zhuǎn)錄是在第二階段合成的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的控制下進(jìn)行的第30頁/共68頁n二、枯草桿菌中亞基的更迭n（一）枯草桿菌噬菌體SPO1早、中晚期基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換n1，SPO1

10、生活史n（1）早期：侵染侵染后45minn（2）中期：侵染45min至812minn（3）晚期：侵染812nin后第31頁/共68頁n2，SPO1早、中、晚期基因表達(dá)過程中亞基的替換（圖816）n（1）含55的RNA聚合酶全酶負(fù)責(zé)早期基因的轉(zhuǎn)錄早期基因產(chǎn)物gp28：分子量28KDa的亞基gp28取代55與核心酶結(jié)合，使RNA聚合酶識(shí)別中期基因的啟動(dòng)子不同亞基的替換取決與核心酶結(jié)合的親和力第32頁/共68頁n（2）含gp28的RNA聚合酶全酶負(fù)責(zé)中期基因的轉(zhuǎn)錄gp33、gp34表達(dá)，并取代gp28（以及55）與核心酶結(jié)合，使RNA聚合酶識(shí)別晚期基因的啟動(dòng)子第33頁/共68頁n（3）以gp3 3-

11、gp34為亞基的RNA聚合酶全酶負(fù)責(zé)晚期基因的轉(zhuǎn)錄第34頁/共68頁n（二）枯草桿菌子孢子生成過程中亞基的替換第35頁/共68頁n1，枯草桿菌不同生長時(shí)期亞基的替換n（1）營養(yǎng)生長時(shí)期含55的全酶：識(shí)別營養(yǎng)生長有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和孢子形成最初所需要的基因28含量很少32含量不到總量的1第36頁/共68頁n（2）營養(yǎng)耗竭及孢子形成反應(yīng)時(shí)期含28的全酶：負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄孢子生成的信號(hào)探測(cè)基因，以及起始孢子形成反應(yīng)的基因第37頁/共68頁n（3）孢子形成早期37代替55，含37的全酶能識(shí)別早期孢子形成基因的啟動(dòng)子 32負(fù)責(zé)識(shí)別某些基因的啟動(dòng)子第38頁/共68頁n（4）孢子形成中、晚期29代替37，含29的聚合酶

12、負(fù)責(zé)中、晚期孢子形成基因的轉(zhuǎn)錄第39頁/共68頁n2，不同亞基識(shí)別不同的啟動(dòng)子每種亞基識(shí)別的啟動(dòng)子都有各自的結(jié)構(gòu)特征n4，不同亞基的作用機(jī)制 亞基可能直接識(shí)別啟動(dòng)子的特性第40頁/共68頁n二、T7噬菌體生長過程中用噬菌體RNA聚合酶代替寄主的RNA聚合酶n（一）T7 噬菌體概況n1，T7噬菌體的特點(diǎn)是感染大腸桿菌的烈性噬菌體由二十面體的頭部和非常小的尾部構(gòu)成基因組由39936bp的線狀雙鏈DNA組成，編碼50個(gè)基因第41頁/共68頁n2， T7 噬菌體生長周期生長周期：可分為早期階段和晚期階段，30C時(shí)為25分鐘生長周期的特點(diǎn)：DNA注射非常緩慢，是基因調(diào)控的手段之一生長周期可分為早期階段和

13、晚期階段第42頁/共68頁n（二）T7 噬菌體的基因n1， T7 噬菌體基因及其產(chǎn)物n（1）早期及晚期基因（圖819）早期基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物I：第一組（早期）基因?qū)儆跇O早期基因，在噬菌體進(jìn)入細(xì)菌后由宿主的RNA聚合酶表達(dá)。其產(chǎn)物中有干擾宿主基因表達(dá)的酶和噬菌體RNA聚合酶。后者負(fù)責(zé)部分早期和整個(gè)晚期基因的表達(dá)第43頁/共68頁晚期基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物II：編碼與DNA復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)晚期基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物III：編碼與噬菌體顆粒的結(jié)構(gòu)和組裝有關(guān)的蛋白質(zhì)第44頁/共68頁n（2） T7 噬菌體基因的啟動(dòng)子位置和終止位點(diǎn)（圖819）早期啟動(dòng)子：A1、A2和A3，由大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別第二組啟動(dòng)子：10

14、個(gè)第三組啟動(dòng)子：5個(gè)復(fù)制啟動(dòng)子： OL， OR終止位點(diǎn)：TE，T ， T7末端第45頁/共68頁n（3）T7噬菌體基因mRNA的合成及轉(zhuǎn)錄后處理（圖820）T7噬菌體mRNA有宿主RNA酶III能夠識(shí)別的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可以被RNA酶III切割釋放出各個(gè)基因的mRNA第46頁/共68頁n2，T7噬菌體RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子（表86）n（1） T7噬菌體RNA聚合酶識(shí)別的序列23bp（-17+6）的高度保守序列n（2） T7噬菌體的弱啟動(dòng)子 OL，第二組啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：有27個(gè)堿基不同于一致序列第47頁/共68頁n（3） T7噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子第三組啟動(dòng)子， OR結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：與一致序列相同第48頁/共6

15、8頁n（三）T7 噬菌體基因表達(dá)的調(diào)控n1，早期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物I的形成n（1）寄主RNA合成體系負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄早期基因n（2）重要的早期基因基因0.3：產(chǎn)物能抑制寄主的限制酶基因0.7：產(chǎn)物為蛋白激酶，能使宿主RNA聚合酶因磷酸化而失活基因1：產(chǎn)物為T7 RNA聚合酶第49頁/共68頁n2，第組基因的表達(dá)n（1）基因2產(chǎn)物為宿主RNA聚合酶抑制劑n（2） 3.5基因產(chǎn)物參與DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的抑制同時(shí)也負(fù)責(zé)細(xì)胞的裂解（又稱T7溶菌酶）第50頁/共68頁n（3）T7 噬菌體對(duì)寄主RNA合成體系的接管0.7，1，2基因產(chǎn)物作用的結(jié)果使宿主的轉(zhuǎn)錄體系關(guān)閉，噬菌體建立自己的轉(zhuǎn)錄體系第51頁/共68頁n3，第類啟動(dòng)子

16、的轉(zhuǎn)錄n（1）可能由于基因3.5產(chǎn)物的作用，這個(gè)階段轉(zhuǎn)錄水平下降n（2）只有第III類強(qiáng)啟動(dòng)子才能起始轉(zhuǎn)錄第52頁/共68頁第53頁/共68頁n（4）阻遏蛋白操縱子：編碼起調(diào)控作用的基因第54頁/共68頁噬菌體的早、晚期基因的表達(dá)（圖6-17）PL：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物L(fēng)1，編碼抗終止蛋白NPR：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R1，編碼調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)CrotL1，tR1：均依賴于因子第55頁/共68頁n2，遲早期基因n（1）啟動(dòng)子PL：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物L(fēng)2，翻譯產(chǎn)物PR：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R2 ，R3，第56頁/共68頁依賴于因子第57頁/共68頁n（1）啟動(dòng)子PR：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物R4， R5，編碼噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白和溶菌酶等n tR， tR4第58頁/共

17、68頁n（三） 噬菌體的阻遏蛋白及其作用n1，Cro蛋白與操作子結(jié)合的親和力： OL3 OL2 OL1， OR3 OR2 OR1第59頁/共68頁SOS Response第60頁/共68頁n一、噬菌體基因表達(dá)特點(diǎn)概述n（一）噬菌體基因組構(gòu)成n1，基因構(gòu)成n（1）轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的基因感染初期噬菌體均利用宿主的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，隨后噬菌體合成一些自身編碼的蛋白質(zhì)，對(duì)宿主的RNA聚合酶進(jìn)行替代或修飾，其結(jié)果是使轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)優(yōu)先轉(zhuǎn)錄噬菌體的mRNA。噬菌體傾向于使用宿主的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)第61頁/共68頁n2，晚期感染（late infection）：指噬菌體DNA復(fù)制開始到細(xì)菌裂解，釋放后代噬菌體顆粒的一段時(shí)間。在這段時(shí)期，噬菌體完成DNA的復(fù)制、噬菌體顆粒的蛋白組分的合成。除此還需要合成組裝蛋白和溶菌蛋白，幫助組裝噬菌體顆粒和最終釋放子代噬菌體第62頁/共68頁n（2）含gp28的RNA聚合酶全酶負(fù)責(zé)中期基因的轉(zhuǎn)錄gp33、gp34表達(dá)，并取代gp28（以及55）與核心酶結(jié)合，使RNA聚合酶識(shí)別晚期基因的啟動(dòng)子第63頁/共68頁n2， T7 噬菌體生長周期生長周期：可分為早期階段和晚期階段，30C時(shí)為25分鐘生長周期的特點(diǎn)：DN