(完整版)無菌檢查法-藥典2010第三部-附錄XIIA

1、附錄 XII A 無菌檢查法無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的生物制品、 醫(yī)療器具、 原料、 輔料及其他品種是 否無菌的一種方法。 若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定， 僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā) 現微生物污染。無菌檢查應在潔凈度萬級下的局部潔凈度百級的單向流空氣區(qū)域內或隔離系統(tǒng)中進行， 其全過程應嚴格遵守無菌操作， 防止微生物污染， 防止污染的措施不得影響供試品中微生物 的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游 菌和沉降菌的測試方法 的現行國家標準進行潔凈度驗證。 隔離系統(tǒng)應按相關的要求進行驗 證，其內部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試

2、驗環(huán)境進行監(jiān)控。無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經過無菌技術的培訓。培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備： 培養(yǎng)基按以下處方制備， 亦可用按該處方生產的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。 配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應保存在225避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般可在 3 周內使用；若保存于密閉容器中，一般可在1 年內使用。1、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基酪胨（胰酶水解）15.0g酵母浸出粉5.0g葡萄糖5.0g氯化鈉2.5gL-胱氨酸0.5g新配制的 0.1%刃天青溶液1.0mL硫乙醇酸鈉0.5g（或硫乙醇酸0.3mL)瓊脂0.75g水1000mL除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，

3、調 pH 值為弱堿性，煮沸，濾 清，加入水葡萄糖和刃天青溶液， 搖勻，調 pH 值使滅菌后為 7.1 ±0.。2分裝至適宜的容器中， 其裝量與容器高度的比例應符合培養(yǎng)結束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2 ，滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5 ，否則，須經1000 水浴加熱至粉紅色消失（不超過 20 分鐘）后，迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被 污染。2、改良馬丁培養(yǎng)基胨5.0g磷酸氫二鉀酵母浸出粉2.0g硫酸鎂葡萄糖20.0g水除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調1.0g0.5g1000mLpH 值約為 6.8，煮沸；加入 putao

4、tang 溶解后，搖勻，濾清，調 pH值使滅菌后為 6.4 ±0.，2 分裝，滅菌。3、選擇性培養(yǎng)基按上述硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法， 在培養(yǎng)基滅菌或使用前加 入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法驗證試驗。4、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基胨10.0g氯化鈉5.0g牛肉浸出粉3.0g水1000mL取上述成分混合， 微溫溶解，調 pH值為弱堿性，煮沸，濾清，調 pH值使滅菌后為 7.2 ±0.，2 分裝，滅菌。5、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法，加入 14.0g 瓊脂，調 pH 值使滅菌后為 7.2 ±0.，2 分裝，滅菌。6、改良馬

5、丁瓊脂培養(yǎng)基按改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法， 加入 14.0g 瓊脂，調 pH 值使滅菌后為 6.4 ± 0.，2分裝， 滅菌。培養(yǎng)基的適用性檢查 無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基應符合 培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。 本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無 菌檢查同時進行。培養(yǎng)基的無菌性檢查 每批培養(yǎng)基隨機抽取不少于 10 支（瓶），5 支（瓶） 置 3035、 另 5 支（瓶）置 2025 培養(yǎng) 14 天，均應無菌生長。靈敏度檢查菌種 培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過 5 代（從菌種保藏中心獲得的 冷凍干燥菌種為第 0 代），試驗用菌種應采用適

6、宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌 株的生物學特性。金黃色葡萄球菌（ staphylococcus aureus） CMCC（ B） 26003 銅綠假單胞菌（ Pseudomonas aeruginosa ） CMCC（ B） 10104 枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis ） CMCC（B） 63501 生孢梭菌（ Clostridium sporogenes ） CMCC（ B）64941 白色念珠菌（ Candida albicans）CMCC（F） 98001 黑曲霉（ Aspergillus niger ）CMCC（ F） 98003菌液制備 接種金黃色葡萄球菌

7、、 銅綠假單胞菌、 枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉 湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中， 3035培養(yǎng) 1824 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊 脂培養(yǎng)基上， 2025培養(yǎng) 2448 小時，上述培養(yǎng)物用 0.9%氯化鈉溶液制成每 1mL 含菌數小 于 100CFU（菌落形成單位） 的菌懸液。 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上， 2328培養(yǎng) 57天，加入 35mL 無菌的含 0.05%（ml/ml ）聚山梨酯 80的 0.9%氯化鈉溶液， 將孢子洗脫。 然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內， 用無菌

8、的含 0.05%（ml/ml ） 聚山梨酯 80 的 0.9%氯化鈉溶液制成每 1ml 含孢子數小于 100CFU 的包子懸液。菌懸液在室溫下放置應在 2 小室內使用，若保存于 28可在 24 小時內使用。黑曲霉 孢子懸液可保存在 28，在驗證過的貯存期內使用。培養(yǎng)基接種 取每管裝量為 12mL 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 9 支，分別接種小于 100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2 支，另 1 支不接種，作為空白對照，置 3035培養(yǎng) 3 天；取每管裝量為 9mL 的改良馬丁培養(yǎng)基 5 支，分別 接種小于 100CFU的白色念珠菌、 黑曲霉各 2 支，另一支不接種

9、， 作為空白對照， 置 2025 培養(yǎng) 5 天。逐日觀察結果。結果判定 空白對照管應無菌生長， 若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好， 判斷該培養(yǎng)基的靈 敏度檢查符合規(guī)定。稀釋液、沖洗液及制備方法 稀釋液、沖洗液配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。（1）稱取蛋白胨 1.0g，加水 1000mL，微溫溶解， 濾清，調 pH 值至 7.1 ± 0，.2分裝，滅菌。（2）pH7.0 氯化鈉 -蛋白胨緩沖液， 稱取磷酸二氫鉀 3.56g 、磷酸氫二鈉 7.23g、氯化鈉 4.30g 、 蛋白胨 1.0g，加水 1000mL，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。（3）0.9%氯化鈉溶液稱取氯化鈉 9.0g，加水

10、溶解使成 1000mL，過濾，分裝，滅菌（僅用于上述 2 種溶液不適合時使用） 。根據供試品的特性可選用其它經驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、 沖洗液。如需要， 可 在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。方法驗證試驗當建立產品的無菌檢查法時是， 應進行方法的驗證， 以證明所采用的方法適合于該產品 的無菌檢查。若該產品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時， 檢查方法應重新驗證。驗證時，按 “供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。菌種及菌液制備 同培養(yǎng)基靈敏度檢查薄膜過濾法 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾， 沖洗， 在最后一 次的沖

11、洗液中加入小于 100CFU 的試驗菌，過濾。將培養(yǎng)基加至濾筒內。另取一裝有同體積 培養(yǎng)基的容器， 加入等量試驗菌， 作為對照， 細菌置 3035、真菌置 2025培養(yǎng) 35 天， 逐日觀察各濾筒內試驗菌的生長情況。直接接種法 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 8 管，分別接 入小于 100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2 管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4 管，分別接入小于 100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各 2 管。其中 1 管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定量的供試品量，另 1 管作為對照，細菌置 3035、真菌置 2025培養(yǎng) 3

12、5 天，逐日觀察各濾筒內試驗菌的生長情況。結果判定 與對照管比較，如含供試品的各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試 品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計， 照此檢查方法和檢查 條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長， 則說明供試品的改檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用， 可采用增加沖洗量、 增加培養(yǎng)基的用 量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法， 消除供試品的抑菌作用， 并重新進行方法 驗證試驗。驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。供試品的無菌檢查抽驗數量 系指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量 （支或瓶） 。成品每亞批均

13、應進 行無菌檢查。 除另有規(guī)定外， 原液、半成品及成品按表 1 規(guī)定， 上市產品監(jiān)督檢驗按表 2 規(guī) 定。接種量 系指每個最小包裝的最小取樣量（ mL 或 g）。除另有規(guī)定外，接種供試品量 按表 3 規(guī)定。若采用直接接種法， 按接種量要求等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改 良馬丁培養(yǎng)基中 兩種培養(yǎng)基的接種支（瓶）數之比為 2：1；若采用薄膜過濾法，應采用三 聯薄膜過濾器， 其中兩聯加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基， 另一聯加入改良馬丁培養(yǎng)基。 只要供 試品特性允許，應將所有容器內的內容物全部過濾。陽性對照 以金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌。 供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng) 基接種的樣品量。 陽性

14、對照試驗的菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查項下金黃色葡萄球菌菌液制 備方法， 加菌量小于 100CFU。陽性對照液可在供試品無菌檢查培養(yǎng) 14天后，取其中 1 份硫 乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，加入小于100CFU 陽性對照菌，作為陽性對照。陽性對照置3035培養(yǎng) 4872 小時應生長良好。陰性對照 供試品無菌檢查時， 應取相應溶劑、 稀釋液和沖洗液同法操作， 作為陰性對 照。陰性對照不得有菌生長。無菌試驗過程中，若需要使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性， 且對微生物生長無毒性。無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。 供試品的無菌檢查所采用的檢查方法和

15、檢驗條件應與驗證的方法相同。操作時， 用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒。如果供試品容器內有一定的 真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無 菌操作啟開容器，取出內容物。供試品處理及接種培養(yǎng)基 除另有規(guī)定外，按下列方法進行。1、薄膜過濾法采用封閉式薄膜過濾器，濾膜孔徑應不大于0.45 m，直徑約為 50mm。根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試品溶液過濾前先將少量的沖洗液過濾， 以濕潤濾膜。 油類供試品， 其濾膜和 過濾器在使用前應充分干燥。 為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率， 應注意保持供試品溶液及沖洗

16、液 覆蓋整個濾膜表面。 供試品溶液經濾膜過濾后， 若需要沖洗液沖洗濾膜， 每張濾膜每次沖洗 量一般為 100mL，總沖洗量不得超過 1000mL，以避免濾膜上的微生物受損傷。水溶液供試品 取規(guī)定量，每支（瓶）供試品裝量為 5mL 及以下者，全部轉移至含適 量稀釋液的無菌容器內， 混勻， 立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液 沖洗濾膜，沖洗次數一般不少于 3 次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法驗證試驗。沖洗后， 2 個濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各100mL ，另一濾器中加入改良馬丁培養(yǎng)基。水溶性固體供試品 取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽說明復溶，然后照水溶 液供試品項下的

17、方法操作。非水溶性供試品 取規(guī)定量，混合溶于含聚山梨酯 80 或其他適宜乳化劑的稀釋液 300mL 的無菌容器內， 充分混合， 立即過濾。用含 0.1%1%聚山梨酯 80 的沖洗液沖洗濾膜， 沖洗次數一般不少于 3 次。加入含或不含聚山梨酯 80 的培養(yǎng)基。其他照水溶液供試品項下 的方法操作。可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品 取規(guī)定量，混合至適量的無菌十四 烷酸異丙酯中， 劇烈振搖， 使供試品充分溶解。 如果需要可適當加熱， 但溫度不得超過 44， 并趁熱迅速過濾。 對仍然無法過濾的供試品， 于含有適量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試品 溶液中加入不少于 100mL 的稀釋液，充分振搖萃

18、取，靜置，取下層水相作為供試品溶液過 濾，過濾后濾膜沖洗及加入培養(yǎng)基照非水溶性供試品項下的方法操作。無菌氣（噴）霧劑供試品 取規(guī)定量， 將各容器置至少 -20的冰室冷凍至少約 1 小時。 以無菌操作迅速在容器上端鉆一小孔釋放拋射劑后再無菌開啟容器， 并將供試品溶液轉移至 無菌容器中，然后照水容額或非水溶性制劑供試品項下的方法操作。裝有藥物的注射器供試品 取規(guī)定量，將注射器中的內容物（若需要可吸入稀釋液或 標簽所示的溶劑溶解）直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾， 然后按水溶性供試品項下方法操作。同時應采用直接接種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。2、直接接種法 直接

19、接種法適用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品。 取規(guī)定量供試品， 等量分 別接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基中 （2 中培養(yǎng)基的接種支數或瓶數之比為 2：1）。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積，不得大于培養(yǎng) 基體積的 10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15mL，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于 10mL.培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗證試驗?；鞈乙旱确浅吻逅芤汗┰嚻?取規(guī)定量，等量分別接種至各管培養(yǎng)基中。 固體供試品 取規(guī)定量，加入適宜的稀釋劑溶解，或按標簽說明復溶后混合，等量分 別接種至各管培養(yǎng)基中。非水溶性供試品 取規(guī)定量，混合，加入適量的聚

20、山梨酯 80 或其他適宜的乳化劑及稀 釋劑使其乳化；等量分別接種至各管培養(yǎng)基中，或等量分別直接接種至含聚山梨酯80 或其他適宜乳化劑的各管培養(yǎng)基中。培養(yǎng)及觀察 將上述接種后的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基平均分成兩份，一份置 3035培養(yǎng) 14 天；另一份與接種后的改良馬丁培養(yǎng)基置2025培養(yǎng) 14 天，培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現渾濁，培養(yǎng) 14 天后， 不能從外觀上判斷有無菌生長， 可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基中及營養(yǎng)瓊脂斜面 和改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上， 細菌培養(yǎng) 2天，真菌培養(yǎng) 3 天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基 及營養(yǎng)瓊脂和改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上是否有菌，必要時做菌種鑒定。結果判定 陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則試驗無效。 若供試品管均澄清， 或雖顯渾濁但經確證無菌生長， 判供試品符合規(guī)定； 若供試品觀眾 任何一管顯渾濁并確證有菌生長， 判供試品不符合規(guī)定， 除非能充分證明試驗結果無效， 即 生長的微生物非供