中樞系統(tǒng)(解剖學)研究方法進展

1、 顯示腦血管、主要核團和纖維束、腦室等。塑化標本用于斷 面解剖學。 固定、切片、染色 1.H.E染色 2. 硝酸鹽鍍?nèi)荆簷C制不清(顯示神經(jīng)元輪廓和突起的行向)。 3. Nissl法：堿性染料-核酸結(jié)合(焦油紫、甲苯胺藍、培花青等)。 生化學+組織學：固定良好，稱量準確，器皿潔凈，嚴格操作。 1. 酶組化：底物 (有色)原位沉淀 四氮唑鹽或金屬(鉛、鈷、銅) (1)膽堿能神經(jīng)元的檢測：乙酰硫膽堿 硫膽堿 鐵氰化物 亞鐵氰化物 (2)NO能神經(jīng)元的檢測： 還原輔酶A 藍色沉淀 硝基四氮唑藍酶AchECu 棕色沉淀+(黃遞酶)NOS 自發(fā)熒光和誘發(fā)熒光： 紫外光 標本 激發(fā)濾片 物鏡 吸收濾片 目鏡

2、1. 單胺熒光組化：(1)甲醛誘發(fā)熒光：(2)乙醛酸誘發(fā)熒光：CA 四氫異喹啉 雙氫異喹啉 5HT 四氫-咔啉 二氫-咔啉FAorGA蛋白催化H+(綠色熒光)FAorGA蛋白催化H+(黃色熒光)1.原理：抗原抗體反應。 重鏈 N端 可變區(qū) 抗體活性部分 Fab段 輕鏈 C端 穩(wěn)定區(qū) 抗原決定簇 Fc段C端FcFabN端重鏈輕鏈C區(qū)V區(qū)C區(qū)抗原第一抗體F標記物直接法抗原第一抗體間接法第二抗體F標記物2. PAP法的原理注意事項： 1)一抗的特異性要強，效價要高。 2)二抗的量要足(雙橋PAP法)。 3)PAP復合體與一抗來自同一動物種屬。 4)要設(shè)對照試驗(吸收試驗、置換試驗、交叉試驗)。 5)

3、提高染色質(zhì)量的措施：H2O2甲醇液去內(nèi)源性HRP；Triton X-100增加通透性；酶消化，微波重新釋放抗原?；驹恚猴@示標記物改酶標為熒光素(異硫氰酸熒光素 FITC、四甲基異硫氰酸羅達明TRITC)，在熒 光顯微鏡下觀察。 AB直接直接(A)和間接和間接(B)免疫熒光法原理示意圖免疫熒光法原理示意圖1. 原理：是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和力與免疫反應結(jié)合 起來的技術(shù)。 這些物質(zhì)包括：植物凝集素與糖類，生物素與親合素，葡萄球菌A蛋白與IgG，陽離子與陰離子，激素與受體。2. ABC法的原理(Avidin Biotin-peroeidase Complex)親合素生物素過氧化物酶復合體3.

4、 ABC法的優(yōu)點： (1)靈敏度高； (2)非特異性著色較少； (3)使用和操作較簡便。4. SABC法的原理(Strept Avidin Biotin-enzyme Complex): 鏈酶親合素生物素酶復合物親合素鏈酶親合素分子中含寡糖不含糖鏈等電點高(1010.5)等電點不高(66.5)非特異性染色+(與人源性凝集素樣蛋白質(zhì)結(jié)合；與細胞膜、核起反應)1. 原理：是用堿基序列已明了的，并被同位素標記的核酸探針與組織或細胞中待測的核酸雜交，對待測核酸進行定性、定位和相對定量的技術(shù)。多用于蛋白質(zhì)合成的動態(tài)變化、遞質(zhì)共存、亞核和追蹤定性等方面的研究。cDNAmRNA(轉(zhuǎn)錄)多肽鏈蛋白質(zhì)RNA聚合

5、酶反轉(zhuǎn)錄酶tRNA核糖體G C T A(DNA)C G A TG C U A(RNA)C G A U2. 注意事項：戴手套；器械高壓消毒；固定的要求更嚴格；標本制備過程中盡量避免RNA酶的污染。1. 原理：神經(jīng)元軸漿運輸：順行、逆行。2. 種類： (1)游離HRP： (2)結(jié)合HRP：麥芽凝集素HRP(Wheat Germ agglutininHRP) 霍亂毒素HRP(Cholera toxinHRP) 為酶標配體。 優(yōu)點：靈敏度高，用量小，顯示充分，降解時程長。(3)主要步驟： HRP的引入存活。最佳存活期(日)(束路長度毫米/350毫米)+1日固定取材。 切片。 組織化學反應： DAB法

6、成色劑+H2O2(二氨基聯(lián)苯胺) TMB法(四甲基聯(lián)苯胺) HRP+H2O2 HRP H2O2絡(luò)合物 HRP H2O2+(CHR)H2 CHR +2H2O2吲哚胺聚合體 吩嗪多聚體壓力注射法電泳法(HRP溶液接正電極，實驗動物接負電極)1. 原理：2. 特點： (1)種類多，熒光顏色各異。 (2)標記神經(jīng)細胞的部位各異。 (3)可單、雙、多標記，用以研究軸突分支投射。 (4)切片易褪色，熒光顯微鏡的濾片要齊全。1. 原理：將3H、14C標記的氨基酸注入神經(jīng)組織，被神經(jīng)元胞體吸收后參與神經(jīng)細胞的蛋白質(zhì)合成，然后合成的物質(zhì)隨軸漿運輸至末梢，借助放射性同位素發(fā)出的射線使膠片或乳膠感光，經(jīng)顯影、定影后

7、就能產(chǎn)生黑色的銀粒，從而可確定神經(jīng)元的纖維投射區(qū)。2. 特點： (1)順行追蹤。 (2)不存在過路纖維 攝取干擾的問題。3. 基本步驟：1. 原理：利用某些化學性神經(jīng)毒物質(zhì)選擇性地損毀特定性質(zhì)的神經(jīng)元胞體或末梢，引起神經(jīng)的順行潰變或逆行潰變(變性)。 2. 單胺能毒劑： NA CA 5-HT5,6-或5,7-DHT(5,6-或5,7-雙羥色胺， 為5-HT的同系物) 對神經(jīng)元細胞膜上胺攝取機制中的載體有高的親和力，進入胞體后自行氧化，形成對細胞毒性很強的苯醌類化合物而導致細胞潰變，染色質(zhì)溶解、核偏心，胞體膨脹死亡。電鏡下線粒體膨脹、溶解、基質(zhì)電子密度增高，突觸囊泡分解、消失。 對其敏感性：末梢

8、軸突胞體6-OH-DA(6羥多巴胺，為去甲腎上腺素的同系物) 1. 用電子束代替光源。 2. 成像部分：用電磁透鏡代替光鏡中的聚光器、物鏡和目鏡。 (電子射線發(fā)生曲折) (可見光發(fā)生曲折) 3. 觀察部分：電子流熒光屏可見熒光 1. 固定、取材、修塊(1mm3)、后固定(1%餓酸2h)。 2. 脫水。 3. 包埋：樹脂類，不同溫度聚合，保證硬度適宜。 4. 切片：超薄切片(玻璃刀、鉆石刀，銅網(wǎng))。 5. 電子染色：增加對比度(鉛、鈾)。 吸附重金屬強部位透過的電子熒光屏弱光暗區(qū) 吸附重金屬弱部位透過的電子熒光屏強光亮區(qū) 一部分電子穿透 電子束標本 另一部分電子將樣品表面原子的外層電子打落 “二

9、次電子” 收集、成像主要方法步驟： (1)灌注、取材。 (2)再固定及脫水。 (3)置換：用醋酸異戊酯置換酒精，用液態(tài)的CO2置換無水液體。 (4)臨界點干燥。 (5)噴金：真空噴鍍儀(防止放電，防止電子束損傷，增強反差，限定于樣品表面)。(醋酸異戊酯) 是一種使抗原或抗體在超微結(jié)構(gòu)水平上定位的方法，是免疫細胞化學與電鏡技術(shù)的有機結(jié)合。1. 主要步驟： 包埋前染色(振動切片、平板包埋、解剖顯微鏡下精確取材后，用502膠水粘貼在環(huán)氧樹酯柱上作超薄切片。 包埋后染色(鎳網(wǎng)或金網(wǎng)上作免疫細胞化學染色，抗體顯示系統(tǒng)多用膠體金技術(shù)，雙重染色的結(jié)果可以用兩種不同直徑的膠體金顆粒顯示)。2. 用途與評價：

10、可用于超微結(jié)構(gòu)水平上神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的定性，研究神經(jīng)元之間聯(lián)系的性質(zhì)，以及遞質(zhì)共存等，包埋前染色對組織的抗原性保存較好，但不適于可溶性物質(zhì)的細胞內(nèi)定位，包埋后染色，則與此相反。 (Laser Scanning Confocal Microseope, LSCM)激光束做光源，為高能量、密度的相干光，光敏度高。 共聚焦：光源針孔 檢測針孔 (1)提高分辨率和敏感性。 (2)實現(xiàn)三維重建。微動步進馬達控制載物臺升降“細胞CT”。 (3)擴大信息范圍。 (4)客觀準確地記錄熒光強度，以數(shù)據(jù)代替+、+。 (5)熒光攝影方便，如是紫外光下照射30秒，熒光亮度降低50%。 (6)可同時顯示多種標記物。三色同顯，雙標、三標(三個獨立的PMT)定量熒光測定，細胞內(nèi)離子測定，細胞間通訊的研究，神經(jīng)細胞和細胞器的三維圖像重組等等。樣品(對樣本內(nèi)焦平面上的第一點進行掃描)焦平面上的光(一) HRP+ICC(二)