ARMS技術(shù)介紹

1、ARMS技術(shù)的介紹（the amplification refractory mutation system）一、ARMS技術(shù)的原理二、ARMS技術(shù)的特點(diǎn)三、MGB探針及原理四、MGB探針的特點(diǎn)五、ARMS技術(shù)的應(yīng)用六、ARMS實(shí)例：-地中海貧血位點(diǎn)主要內(nèi)容一、ARMS技術(shù)的原理基本原理：TaqDNA聚合酶缺少3-5外切酶活性。在一定條件下PCR引物3末端的錯(cuò)配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少，針對不同的已知突變，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊锟梢酝ㄟ^PCR方法直接達(dá)到區(qū)分突變型和野生型基因的目的。突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)（ARMS-PCR(amplification refractory mutation system)），又名

2、等位基因特異PCR(allele specific PCR，ASPCR)。ARMS技術(shù)針對引物3端進(jìn)行等位基因特異性的區(qū)分。 兩種引物形式：“normal”野生型引物，擴(kuò)增時(shí)會(huì)被突變的模板阻滯；“mutant”突變型引物，擴(kuò)增時(shí)會(huì)被野生型模板阻滯。 一般情況下，通過引物3端單個(gè)堿基的突變來區(qū)分等位基因效果并不理想。所以ARMS技術(shù)在大多數(shù)情況下還會(huì)人為的增加引物3端附近的堿基的突變以達(dá)到區(qū)分等位基因的效果。N-6N-4N-2NN-3以kappa casein基因的一個(gè)突變位點(diǎn)為例二、ARMS技術(shù)的特點(diǎn) 2.1 ARMS技術(shù)具有高特異性高特異性。 由于ARMS所用的引物是從一段序列在3末端及其附

3、近人為的加入錯(cuò)配的突變位點(diǎn)的一套引物組合中，通過篩選出來的能夠區(qū)分單個(gè)位點(diǎn)等位基因的引物，就保證了其高度的特異性:2.2 ARMS技術(shù)具有高靈敏性高靈敏性 檢測限可以達(dá)到100copies/mL，對于腫瘤組織檢測限可以達(dá)到0.5%的突變率。以BRAF V600E為例ARMS直接測序2.3 檢測時(shí)耗短，成本低，結(jié)果直觀好判讀 ARMS結(jié)合QPCR或者電泳技術(shù)，均只需進(jìn)行一次PCR反應(yīng)，時(shí)耗短。 ARMS技術(shù)需要優(yōu)化的僅僅是上游引物，這相對于使用MGB探針的熒光定量PCR技術(shù)來說，成本低而且結(jié)果直觀好判讀。三、Taqman MGB探針及其原理Taqman MGB（Taqman minor groo

4、ve binder）探針由普通taqman探針和MGB基團(tuán)兩部分組成。Taqman-MGB RT-PCR原理4.1 MGB探針的高Tm值由于MBG基團(tuán)對DNA雙鏈小溝具有高的親和性，因此在PCR反應(yīng)中，MGB探針相較于普通探針Tm值要高很多，通常要高出10-20。四、MGB探針的特點(diǎn)4.2 MGB探針的特異性和靈敏性MGB探針具有高的Tm值，可以很好的克服GC含量較低的模板的在探針設(shè)計(jì)時(shí)的困難，等位點(diǎn)突變序列間的Tm值相差很大，提高了檢測的特異性。同時(shí)，MGB探針包括一個(gè)不發(fā)熒光的猝滅基團(tuán)（NFQ），它能真正消除傳統(tǒng)猝滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光，提高信噪比，從而提供檢測靈敏性。檢測下限可達(dá)到50co

5、pies。4.3 MGB探針結(jié)果判讀定量實(shí)驗(yàn)：一對引物，一條MGB探針。一般用于目標(biāo)位點(diǎn)的定量分析。定性實(shí)驗(yàn)：一對引物，一對探針。一般用于等位基因突變位點(diǎn)的分型。主要使用等位點(diǎn)分型點(diǎn)陣來分析。ARMS和MGB探針的比較比較項(xiàng)目ARMSMGB需要的引物探針一對引物，一條普通taqman探針一對引物，一對taqman MGB探針SNP位置SNP位點(diǎn)位于上游引物3位點(diǎn)SNP位點(diǎn)在探針序列中前期優(yōu)化成本及時(shí)長優(yōu)化上游引物，序列固定，成本較低，優(yōu)化時(shí)間較短優(yōu)化探針序列，序列不固定，成本較高，優(yōu)化時(shí)間較長結(jié)果判讀根據(jù)CT差值或CT值有無來判讀通過等位點(diǎn)分型點(diǎn)陣，根據(jù)點(diǎn)陣分布判讀特異性來源多條上游引物篩選出

6、最優(yōu)引物探針組合；CT差值15保證等位位點(diǎn)間的差異通過等位位點(diǎn)序列退火溫度Tm值差異保證盡量消除了非特異擴(kuò)增靈敏性來源前期優(yōu)化時(shí)，通過控制模板量（100-1000copies）保證檢測的下限采用NFQ作為淬滅基團(tuán)，消除背景信號(hào)，增強(qiáng)靈敏度成品試劑盒成本只需一條探針，且探針價(jià)格較低，成品試劑盒的成本低需要兩條探針，且探針價(jià)格較貴，成品試劑盒的成本高五、ARMS技術(shù)的應(yīng)用5.1 ARMS技術(shù)結(jié)合電泳和QPCR技術(shù)。目前采用電泳分析仍是主流，結(jié)合QPCR的還較少。毛細(xì)管電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳目前國內(nèi)用ARMS技術(shù)拿證的試劑盒有三個(gè)：1、產(chǎn)品名稱：人KRAS基因突變檢測試劑盒(Taqman-ARMS法) 注冊號(hào)：國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400363號(hào)生產(chǎn)單位：蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司2、產(chǎn)品名稱：人EGFR基因突變檢測試劑盒(Taqman-ARMS法) 注冊號(hào)：國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400362號(hào)