蛋白質分分離純化和表征2010

1、第七章 蛋白質的分離純化和表征一、蛋白質的酸堿性質二、蛋白質的分子大小與分子量的測定三、膠體性質與蛋白質的沉淀四、蛋白質的變性與復性五、蛋白質分離純化的一般原則六、蛋白質的分離純化方法 七、蛋白質的含量測定與純度一、蛋白質的酸堿性質 蛋白質分子中有很多酸性和堿性解離基團，是具有兩性解離性質的化合物。各種解離基團的解離度與溶液的pH有關，pH越低，堿性解離度越大，蛋白質分子帶正電荷越多，負電荷越少；pH升高，則解離情況相反。 等電點（pI）: 在特定pH條件下，某種蛋白質分子所帶正負電荷相等，靜電荷為零，這一pH 稱為該蛋白質的等電點（pI）。幾種蛋白質等電點幾種蛋白質等電點 等電等電pH并不是

2、一個恒定的值，它會因溶液并不是一個恒定的值，它會因溶液中鹽的種類和離子強度的影響而有所不同。中鹽的種類和離子強度的影響而有所不同。 等離子點等離子點(isoionic piont): 蛋白質在純水蛋白質在純水溶液中的帶電狀態(tài)則沒有其他離子干擾，完全由溶液中的帶電狀態(tài)則沒有其他離子干擾，完全由H+的解離和結合來決定，這種條件下的等電點稱為等的解離和結合來決定，這種條件下的等電點稱為等離子點。等離子點是蛋白質的特征性常數(shù)。離子點。等離子點是蛋白質的特征性常數(shù)。二、蛋白質的分子大小與分子量的測二、蛋白質的分子大小與分子量的測定定蛋白質的分子量的范圍：蛋白質的分子量的范圍：6 610103 31 11

3、0106 6 Da Da。（一）根據(jù)化學組成測定最低相對分子量 用化學分析方法測出蛋白質中某一微量元素的含量。并假設蛋白質分子中含有一個被測元素的原子，則可由此計算出蛋白質的最低分子量。 例：肌紅蛋白和血紅蛋白含鐵量均為0.335%,計 算二者的相對分子質量。 最低相對分子量 x 100 =鐵的百分含量 鐵的原子量0.335 55.8x 100=16700測定蛋白質相對分子量的原理和方法也可以利用蛋白質中含量特少的aa，用同樣的原理計算蛋白質的最低分子量。（二）滲透壓法測定相對分子量（二）滲透壓法測定相對分子量 滲透壓法測定Mr操作簡單， Mr在10-100 kDa時較準，但不能區(qū)別蛋白質分子

4、是否均一 。 滲透壓公式： Mr =RTlimc0c(c=質量濃度，g/mol)滲透壓法測定Mr法的缺點：不能確定溶液蛋白質分子是否均一。（三）沉降分析測定（三）沉降分析測定Mr 在強大的離心場中，如果蛋白質溶液的密在強大的離心場中，如果蛋白質溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白質會發(fā)生沉度大于溶液密度，溶液中的蛋白質會發(fā)生沉降。降。 沉降速度決定于蛋白質的分子量、分沉降速度決定于蛋白質的分子量、分子密度、分子形狀和溶劑的密度、粘度。子密度、分子形狀和溶劑的密度、粘度。 沉降系數(shù)（沉降系數(shù)（20,w）：單位離心場強度）：單位離心場強度時的沉降速度。定義時的沉降速度。定義110-13秒（斯維得秒

5、（斯維得貝格單位）。貝格單位）。 Mr = RTSD(1V) 沉降速度法其中:S:是沉降系數(shù)D:是擴散系數(shù):是溶劑的密度 v:是蛋白質的偏微分比容。 將純的分析樣品放于離心池中，進行 低速度長時間 離心，樣品顆粒沉降形成濃度差， 而擴散又使樣品 顆粒由高濃度區(qū)向低濃度區(qū)擴散, 最終達到沉降與擴 散的平衡狀態(tài)。Mr = 2RTln(C2/C1)2(1V)(x22x12) 沉降平衡法（四）凝膠過濾法測定（四）凝膠過濾法測定Mr 凝膠過濾（層析）可按照蛋白質分子量大小凝膠過濾（層析）可按照蛋白質分子量大小進行分離的技術進行分離的技術，同時可以測定蛋白質分子量。同時可以測定蛋白質分子量。蛋白質通過凝膠

6、柱的速度即洗脫體積與其分子量有關:先測得幾種標準蛋白質的Ve Ve （VeVe為洗脫體積） ，并以其分子量對數(shù)對VeVe作圖得一直線，再測出待測樣品的VeVe，查標準曲線即可確定分子量，并以其分子量對數(shù)對VeVe作圖得一直線，再測出待測樣品的VeVe，查標準曲線即可確定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM測V V測（五）（五）SDS-PAGE法測定法測定Mr 聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測蛋白質混合樣品，主要是根用它分離、檢測蛋白質混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質各組分的電泳遷移率的不同。這據(jù)各蛋白質各組分的電泳遷移率的不同

7、。這種差異就蛋白質分子本身而言，主要與其所種差異就蛋白質分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關。帶凈電荷以及分子量和形狀有關。 當電泳體系中含有一定濃度的十二烷當電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（基硫酸鈉（SDS）時，則得電泳遷移率的大）時，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質的分子量，從而可直接由小只取決于蛋白質的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質的分子量。電泳遷移率推算出蛋白質的分子量。 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDS-PAGE）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD300200

8、10080605040302010Migration (Rf)Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis1蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性 蛋白質顆粒大小屬于膠體粒子的范圍(1-100 nm)。又由于其分子表面有許多極性基團，親水性極強，易溶于水成為穩(wěn)定的親水膠體溶液。 蛋白質親水膠體的穩(wěn)定性主要取決于兩個因素： l 雙電層l 水化層 a. 丁達爾效應 b. 布朗運動 c. 不能透過半透膜三、膠體性質與蛋白質的沉淀2蛋白質的沉淀 蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的，相對的。假若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和雙電層，蛋白質親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮結沉淀

9、現(xiàn)象，這既是所謂的蛋白質沉淀作用。 鹽析法（salting out） ： 中性鹽（NH4SO4，NaSO4，NaCl等） 蛋白 質脫去水化層。 優(yōu)點：不引起蛋白質變性。 鹽溶（salting in）：稀鹽溶液中蛋白質溶解度增 加的現(xiàn)象。 有機溶劑沉淀法： 極性有機溶劑（甲醇，乙醇，丙酮）脫去水 化層以及降低介電常數(shù) 而增加帶電質點間的相 互作用。 條件：低溫操作，縮短時間。 重金屬鹽沉淀法：當溶液pHpI,蛋白質顆粒帶負電荷,易與重金屬離子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等) 生成沉淀。 生物堿試劑和某些酸類沉淀法： 生物堿試劑能引起生物堿沉淀的一類試劑。 當溶 液pHpI,蛋白質顆粒

10、帶負電荷,易與重金屬離子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等) 生成沉淀。 生物堿試劑和某些酸類沉淀法： 生物堿試劑能引起生物堿沉淀的一類試劑。 當溶 液pHpI時,蛋白質顆粒帶正電荷 易與生物堿試劑, 酸根負離子反應沉淀 用途：臨床除去體液中干擾測定的蛋白質l 旋光值改變l 特性粘度增加l 溶解度降低l 擴散系數(shù)降低l 結晶能力喪失l 易于沉淀，若加熱還會凝固。但若遠離等電點 則不一定沉淀l 變性后蛋白質肽鍵暴露而更加易于消化3.變性后蛋白質的表現(xiàn)凝膠過濾法 凝膠過濾（層析）是按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。 凝膠顆粒內部具有多孔網狀結構，被分

11、離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在柱內經過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N, N-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )m聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDS-PAGE）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration (Rf)Pha