目基因篩選與DNA文庫(kù)構(gòu)建

1、目的基因的獲得1.基因文庫(kù)（gene library）；2.從物種的基因組或cDNA中PCR 擴(kuò)增；3. 人工合成基因。準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因 基因文庫(kù)（Gene library）： 由大量的含有基因組DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體, 稱之為基因文庫(kù)。 一個(gè)完全的基因文庫(kù)，應(yīng)該能夠保證從中篩選到目的基因。 即 Genomic library 基因組 DNA 文庫(kù)： 指將某生物體的全部基因組 DNA 用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的 DNA 片段，與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落。 按照外源DNA的片段：基

2、因組 DNA 文庫(kù)和cDNA文庫(kù) 包含基因的全部信息，如編碼區(qū)，非編碼區(qū)，內(nèi)含子和外顯子、啟動(dòng)子及調(diào)控序列cDNA文庫(kù): complementary DNA 互補(bǔ)DNA 由某一生物的特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA，它們所構(gòu)成的重組DNA克隆群體，則稱之為cDNA基因文庫(kù)。 反映了基因表達(dá)普，對(duì)研究基因表達(dá)，調(diào)控及基因互作非常有用?；蚪M DNA 文庫(kù)的構(gòu)建程序：1、載體的制備；2、高純度大分子量基因組 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提?。?、HMW DNA 的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離（PFGE size sel

3、ection）；4、載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；5、重組克隆的挑取和保存。 構(gòu)建噬菌體文庫(kù)，連接產(chǎn)物不用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化宿主，而是采用包裝蛋白進(jìn)行包裝并侵染宿主。 文庫(kù)的代表性和隨機(jī)性代表性 文庫(kù)中所有克隆所攜帶的 DNA 片段重新組合起來(lái)可以覆蓋整個(gè)基因組，即可以從該文庫(kù)中分離任何一段 DNA 。 采用酶切或隨機(jī)切割的方法來(lái)消化染色體 DNA ，以保證克隆的隨機(jī)性，保證每段 DNA 在文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率均等； 增加文庫(kù)總?cè)萘俊Ｍ庠雌未笮『椭亟M克隆數(shù)量1976年L.Clark, J.Carbon提出了一個(gè)完全的基因文庫(kù)所需克隆的計(jì)算公式 n=ln(1-p)/ln(1-f)n: 一

4、個(gè)完全基因文庫(kù)所應(yīng)包含的重組體克隆數(shù)p: 所期望的目的基因在基因文庫(kù)中出現(xiàn)的幾率f: 插入片段的平均大小與基因組DNA大小的比值哺乳動(dòng)物 3109kb若p=99% 平均克隆片段20kb f=20kb/3109 n=690773.2E.coli 4，639，221bp p=99% f=20kb/4600kb n=1056.9 p=99% f=10kb/4600kb n=2116一、用于構(gòu)建基因文庫(kù)的載體第一節(jié) 基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建可裝載的外源DNAPlasmid 10kb Phage 0-23kbCosmid 45kbBAC 100kbYAC 300kb-1.2Mb 粘粒克隆所需的克隆子數(shù)是p

5、hage的一半，如需700000時(shí)，cosmid需350000個(gè)。 噬菌體改建的，利用了噬菌體的包裝效率高和雜交篩選背景低的優(yōu)點(diǎn)； 經(jīng)改造的質(zhì)粒載體或人工染色體，其主要優(yōu)點(diǎn)在于可容納超過(guò) 100kb 以上的外源片段。YAC可用于克隆500kb以上，甚至幾Mb的DNA片段BAC 可減少DNA分子間的重組置換型載體coscosRLCentral stuffer1 phage vectors 目前用EMBL系列, 2001，DASH， Charon 38-40，GEM-11 等置換型載體，插入片段的最大值可達(dá)20-24kb有利于分子雜交進(jìn)行篩選 43kb ，左臂、右臂和填充片段的大小分別為 20kb

6、、 9kb 和 14kb ?？寺?DNA 片段的大小為 9-23kb 。2Cosmid vector（柯斯質(zhì)粒） 由噬菌體的cos序列、質(zhì)粒的復(fù)制序列及抗生素抗性基因 所有cosmid vector均可用于構(gòu)建文庫(kù)。cos序列：噬菌體DNA的包裝序列T4噬菌體DNA連接酶多連體分子二、用phage構(gòu)建文庫(kù)1總DNA的提取DNA初始長(zhǎng)度應(yīng)至少是用于克隆的片段的4倍，否則有效片段較少，因此DNA至少應(yīng)大于100kb（cosmid200kb） 2載體臂的制備 購(gòu)買 載體制備、純化 限制酶消化 BamHI / EMBL XhoI / GEM-11載體臂的純化（梯度離心：蔗糖 或NaCl） 梯度離心的收

7、獲量大，而agarose回收量小 回收無(wú)填充片段 聚乙二醇沉淀，除去碎片置換型載體coscosRLCentral stuffer3基因組DNA的消化 一般采用Sau3AI消化 回收20-24kb （ agarose法 or 梯度離心） 有些載體可做不完全補(bǔ)平4連接/包裝 連接形成較長(zhǎng)的多聯(lián)體，包裝成粘粒（4 6個(gè)月穩(wěn)定）5擴(kuò)增和保存重組phage可在E.coli中擴(kuò)增，所得文庫(kù)可被長(zhǎng)時(shí)間利用和貯存，可用于多個(gè)不同基因的篩選6在宿主菌上形成噬菌斑7帶有目的外源DNA序列的phage重組體的鑒定8對(duì)選出的重組phage進(jìn)行噬斑純化，再對(duì)外源DNA進(jìn)行分析 載體的去磷酸化，提高連接和包裝效率 雙酶切

8、消化載體 （EMBL系列，2001，XDASH，Charson 40,35,34）EMBL 3A: SalI BamHI EcoRI - E1 B1-S1 連接反應(yīng)中，應(yīng)測(cè)定外源片段與載體的比例 phage 108pfu/g DNA若用BamHI和EcoRI雙酶切，可用異丙醇沉淀或其它柱層析法去除小片段，使非重組體的數(shù)目降低2個(gè)數(shù)量級(jí)，結(jié)合其它方法如Spi篩選可再降低2-3個(gè)數(shù)量級(jí) 基因組DNA片段3凹端的不完全補(bǔ)平-GATC-CTAG- GATC-CTAG -Sau3AI-GA GATC-CTAG AG-KlenowdATP /dGTP-CTCGAG-GAGCTC-XhoIKlenowdCT

9、P /dTTP-CTC TCGAG-GAGCT CTC-互補(bǔ)GEM-11基因組DNAVector 三、重組體的篩選和分析 噬斑原位雜交將噬菌體以一定密度鋪于平板，并影印到固相膜上要從哺乳動(dòng)物DNA文庫(kù)里篩選出目標(biāo)基因，哺乳動(dòng)物基因組復(fù)雜度為3109bp，必須篩選幾十萬(wàn)個(gè)噬斑平皿直徑 (mm)總面積(cm2)底層瓊脂量 (ml)指示細(xì)菌量 (ml)頂層瓊脂量 （ ml）噬 斑 最 大 數(shù) 目(噬 斑 數(shù) /平 板 )9063.9300.12.515000150176.7800.36.550000不同大小的培養(yǎng)皿所能容納的噬斑數(shù)目. 雜交篩選 用探針. 純化. 分析 /Southern雜交，酶切S

10、equencing/ 其它方法，如免疫學(xué)方法四、亞基因組文庫(kù)的構(gòu)建用基因組DNA的特定部分所構(gòu)建的基因文庫(kù)質(zhì)粒 DNA，線粒體DNA, 特定限制性片段在有雜交探針的情況下，可通過(guò)Southern雜交，先找出目標(biāo)基因所在的限制性片段的大小，然后用相應(yīng)大小的限制性DNA片段構(gòu)建出基因文庫(kù)，這樣可減少篩選的壓力。例如 將基因組DNA用多種限制性內(nèi)切酶切割， 通過(guò)Southern雜交 則 將SpeI切割的基因組DNA中的8.3kb片段回收，用于構(gòu)建DNA文庫(kù)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因在8.3kb SpeI片段上哺乳動(dòng)物 3109kb 若p=99% 平均20kb n=690773.2E.coli 4639221bp

11、p=99% 平均10kb n=2134若用占 總DNA 1/10 區(qū)域的限制性片段, 則 n = 69075 若用占 總DNA 1/10 區(qū)域的限制性片段(10kb)， 則 n = 199 一、cDNA克隆用的mRNA第二節(jié) cDNA文庫(kù)的構(gòu)建1. mRNA的完整性 指導(dǎo)合成高分子量蛋白質(zhì)的能力 無(wú)細(xì)胞翻譯體系（源于網(wǎng)織紅細(xì)胞） 哺乳動(dòng)物總mRNA可編碼 10100kDa蛋白 指導(dǎo)合成目的多肽的能力 利用免疫沉淀和SDS-PAGE mRNA的大小 500bp8kb 大部分 1.52kb 總mRNA制劑指導(dǎo)合成cDNA第一鏈長(zhǎng)分子的能力 合成的cDNA也應(yīng)為上述范圍 脫氧胸苷酸12-18聚體ol

12、igo(dT) 12-18 引物可刺激cDNA第一鏈的放射性活度摻入量至少增加30倍2mRNA的豐度 高豐度mRNA 珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白 在特定細(xì)胞中占50-90% 低豐度mRNA0.5% 被稱為低豐度或稀有mRNA文庫(kù)應(yīng)足夠大，鑒定和分離困難3mRNA的富集 按大小對(duì)mRNA進(jìn)行分級(jí)分離 分離不同大小的mRNA（先變性，如氫氧化甲基汞，后梯度離心，蔗糖） 體外翻譯，檢測(cè)每份中的比活 cDNA的分離級(jí)分離近年來(lái)多采用此方法，特別是大mRNA，可避免降解mRNA, agarose分離大小易辯 多聚核糖體的免疫學(xué)純化法用抗體來(lái)純化合成的目的多肽的多聚核糖體 免疫親和柱/A蛋白-Sepha

13、rose柱，單克隆抗體把正在合成新生鏈的多聚核糖體結(jié)合到A蛋白-spharose柱上，隨后用EDTA解離下來(lái)，通過(guò)oligo(dT)層析分離mRNA。 此法分離的mRNA只占總mRNA的0.01-0.05% 并非都可用，根據(jù)材料來(lái)源特異性來(lái)選擇 反轉(zhuǎn)錄酶 AMV (42) M-MuLV (37) RNase H RNase H弱 長(zhǎng)mRNA 引物 oligo(dT) 12-18 一般要求濃度高 模板 氫氧化甲基汞預(yù)處理，減弱鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu) RNase 抑制劑AAAAAAAmRNA53TTTTTTTT二、cDNA第一鏈的合成cDNA1自身引導(dǎo)法三、cDNA第二鏈的合成2. 置換合成法 有效 無(wú)須進(jìn)

14、一步純化 不需用S1酶，否則會(huì)導(dǎo)致cDNA的大量損失問(wèn)題： 如何脫帽以便進(jìn)入載體 5端cDNA不能合成（少幾個(gè)Nt） 有可能仍形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)3. 第二鏈引導(dǎo)合成Okayama-Berg方法4. 引物-銜接頭合成法四、ds cDNA的分子克隆1.同聚物加尾問(wèn)題： 只對(duì)質(zhì)粒有效，文庫(kù)不易保存和復(fù)制。 尾的長(zhǎng)短不一 (100dA/dT, 20dG/dC) 同聚尾結(jié)合的質(zhì)粒：cDNA雜合分子轉(zhuǎn)化E.coli的效率隨宿主不同而不同。2合成接頭和銜接頭cDNA合成接頭(含酶切位點(diǎn))酶切NotI, SalI與載體連接Optional: methylation 接頭中含稀有位點(diǎn)，如NotI, SalI(100k

15、b一次)先甲基化ds cDNA，再連接接頭用銜接頭替換接頭用銜接頭替換接頭3. 其他方法(1) mRNA-cDNA雜交體克隆mRNAcDNAAAAAAAAARNA 末端加尾效率只及DNA的1/10合成第一鏈后, 加尾, 與帶dT尾的載體退火, 在宿主體內(nèi), 可除去RNA, 代之以DNA優(yōu)點(diǎn): 無(wú)須合成第二鏈, 序列完整 但效率 1/10(2) 依次連加不同接頭(3) RACE random amplification of cDNA ends cDNA克隆是常出現(xiàn)丟失末端序列的現(xiàn)象，需較長(zhǎng)時(shí)間獲得全長(zhǎng)cDNA克隆 篩選文庫(kù)時(shí)一般只能回收一個(gè)或幾個(gè)cDNA克隆， 而RACE可產(chǎn)生大量獨(dú)立克隆mR

16、NAcDNATTTTTTTT-QI-QOAAAAAAAA. 經(jīng)典RACE3末端克隆TTTTTTTT-QI-QO反轉(zhuǎn)錄QOPCRGSP1QIGSP2根據(jù)已經(jīng)得到的不完整的cDNA的序列設(shè)計(jì)引物 GSP1和GSP2PCRcDNA克隆中, 得到了不完整的片段, 可采用此方法獲得3末端和5末端的序列5末端克隆mRNAAAAAAAAGSP1GSP1AAAAAQ1-Q2- TTTTTTQ1/ GSP1 PCR反轉(zhuǎn)錄Q2/ GSP2 PCRGSP2獲得的cDNA 克隆片段AAAAAAAGSP1反轉(zhuǎn)錄連接RNA寡聚物NNNNNNNNB. 新RACE(4) 其他與cDNA第二鏈合成有關(guān)的方法，如 Okayama

17、-Berg方法和引物-銜接頭合成法五、cDNA克隆用的載體1gt10和gt11gt10: 可用核酸探針 克隆0-6kb EcoRI 插入后載體變cI- cI+在hflA中發(fā)生溶原GenBank: U02447gt11：表達(dá)載體，可用免疫探針 克隆0-7.2kb 可表達(dá)融合蛋白LacZE.coli C600 allowing growth of parental and recombinant phageC600hfl represses parental phage growth 50-100-fold, recombinant phage form clear plaques and par

18、ental phage form turbid plaquesE.coli LE392 allowing growth of parental and recombinant phageY1090 as the host, 42C形成噬斑適合用免疫學(xué)探針篩選2. ORF8 9kb 可用于定向克隆3其它gt18，19，20，21，22，23，ZAP第三節(jié) 基因克隆的策略基因克隆的本質(zhì)從文庫(kù)中篩選目標(biāo)克隆，重點(diǎn)在“篩選”常見篩選工具: 探針狹義: 核酸, 抗體廣義: 還包括其他篩選手段 抗性基因: antibiotics抗性基因, 抗重金屬活性一、功能篩選 分解基因: 苯環(huán)化合物, 分解酶 功能活

19、性：殺蟲，酶 啟動(dòng)子/復(fù)制子利用目標(biāo)基因的特定功能進(jìn)行篩選Amp ori MCSTet gene without promoterVector 將目標(biāo)DAN切割成小片段, 插入MCS在Tet 平板上篩選抗性菌落, 可得到promoter其他標(biāo)記: gfp, Kan質(zhì)粒復(fù)制單位的克隆Amp ori MCS目標(biāo)宿主可用的抗性gene 將目標(biāo)DAN切割成小片段, 插入MCS在抗性平板上篩選抗性菌落, 可得到質(zhì)粒復(fù)制單位 功能缺失在獲得相應(yīng)突變體的前提下以此突變體作為宿主在野生型的DNA導(dǎo)入后檢測(cè)回復(fù)突變?nèi)?營(yíng)養(yǎng)缺陷型 相關(guān)的基因二、核酸探針 同源DNA探針高度保守的基因 rRNA基因鄰近種屬的相應(yīng)基

20、因相應(yīng)基因的序列比較 合成寡核苷酸蛋白質(zhì)N-末端aa序列簡(jiǎn)并探針degeneracy選取簡(jiǎn)并程度低的aa序列 綜合合成可能的話 設(shè)計(jì)一對(duì), 用PCR產(chǎn)物作探針根據(jù)密碼子的使用頻率, 合成猜測(cè)體探針 設(shè)計(jì)兩組簡(jiǎn)并探針, 用第二個(gè)探針對(duì)第一次篩選的陽(yáng)性克隆子作第二次雜交三、免疫在可獲得PT后, 制備抗體, 用于篩選四、高表達(dá)基因高豐度mRNA, 如 用苯肼作了貧血處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中,血紅蛋白mRNA的含量占絕大多數(shù)五(1)、差別雜交五(2)、扣除雜交T cell (TCR)B cell mRNAmRNAcDNAcDNA: mRNA 雜交體過(guò)量通過(guò)羥基磷灰石柱, 吸附雜交分子T cell (TCR

21、)特異的cDNA 流出cDNA 第二鏈合成生物素標(biāo)記生物素結(jié)合蛋白柱六、mRNA差別顯示mRNA 3末端 有12中可能的序列 以此12種引物引導(dǎo)cDNA第一鏈合成引物: 5-T11MN 或5-T12MN M=A, G, or C 以10核苷酸隨機(jī)引物引導(dǎo)cDNA第二鏈合成(PCR) 可產(chǎn)生50-100條100-500bp DNA條帶 12種錨定引物和20種隨機(jī)引導(dǎo)組成240組引物, 產(chǎn)生約20000 DNA條帶Sequencing gel對(duì)兩個(gè)相近品種的mRNA作上述處理, 比較它們產(chǎn)生DNA擴(kuò)增條帶的差異, 找到 單方具有的特異DNA條帶, 則可能找到特異性表達(dá)的基因, 回收并克隆特異性的條

22、帶, 分析其序列, 以此條帶為探針克隆全長(zhǎng)基因。七、酵母雙雜交系統(tǒng)用于分離與某一已知蛋白發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)基因GAL4蛋白： 酵母半乳糖苷酶基因gal的轉(zhuǎn)錄激活因子，該蛋白結(jié)合在gal基因上游激活區(qū)(UAS)可啟動(dòng)gal基因的轉(zhuǎn)錄 GAL4蛋白：可分為兩個(gè)區(qū)域 DNA-BD: DNA結(jié)合域, N-末端 1-147aa AD: 轉(zhuǎn)錄激活域， C-末端 768-881aa 融合蛋白：DNA-BD域 / X蛋白X蛋白與靶蛋白Y 可發(fā)生作用構(gòu)建融合表達(dá)文庫(kù)AD域 / cDNAhost當(dāng)文庫(kù)中的某個(gè)重組子裝載有蛋白Y的cDNA時(shí)，可能啟動(dòng)LacZ(HIS)報(bào)告基因的表達(dá) Invitrogen Hybrid Hunter 五、其它 Tn插入缺失 分子標(biāo)記（略）六、PCR在cDNA克隆中的應(yīng)用1. RACE 等獲得的cDNA 克隆片段, 并補(bǔ)平末端2、cDNA第二鏈的擴(kuò)增CCCCAAAATTTTT-mRNAAAAATTTTT-CCCCAAAA-TTTTT-GGGGPCR擴(kuò)增出ds cDNA加入合成的引物mRNAmRNA-CCCCAAAA-TTTTT-GGGG用合成的引物 合成cDNA第一鏈, 加入polyC尾3. PCR-Select cDNA Subtraction Cl