海洋生物藥理活性化合物分離純化研究實(shí)例

1、Stelletta grubiiSchmidt 星芒海綿素星芒海綿素A抗腫瘤活性抗腫瘤活性異馬拉巴烷型三萜異馬拉巴烷型三萜新鮮樣品50kg淡水洗滌（除鹽）切成小塊50L塑料桶，95乙醇浸泡提取4 weeks 3 times減壓濃縮流浸膏10L二氯甲烷萃取萃取物2kg懸浮于90甲醇水溶液石油醚萃取水相萃余物90甲醇水相萃余物石油醚萃取物1.5kg80甲醇水溶液加水稀釋CCl4萃取萃取物250g200300目硅膠柱層析二氯甲烷甲醇梯度洗脫Frac1 Frac2 Frac3 Frac4 Frac5Frac10硅膠柱層析（石油醚乙酸乙酯3：1洗脫 石油醚丙酮1：1洗脫）RP-HPLC制備分離（65甲醇

2、洗脫, 3mL/min）化合物1化合物2 化合物3 化合物4目標(biāo)為低極性成分目標(biāo)為低極性成分2.鯊肝醇鯊肝醇3.尿嘧啶尿嘧啶4.胸腺嘧啶脫氧核苷胸腺嘧啶脫氧核苷化合物化合物1星芒海綿素星芒海綿素A黃色針晶黃色針晶異馬拉巴烷型三萜異馬拉巴烷型三萜n草苔蟲又名苔蘚蟲、草苔蟲又名苔蘚蟲、海席子、假珊瑚及群海席子、假珊瑚及群蟲等，屬草苔蟲科蟲等，屬草苔蟲科bugulidae真體腔動真體腔動物，是海洋底棲動物物，是海洋底棲動物中的重要一種。中的重要一種。n總合草苔蟲總合草苔蟲 Bugula neritina (Linnaeus)n采集地：南海的采集地：南海的3個個不同海域不同海域新鮮樣品12噸風(fēng)干樣品2

3、00kg95乙醇500L加熱提取2 hour 3 times減壓濃縮混懸水溶液20L乙酸乙酯萃?。?：1，5次） 萃取物1.2kg（抗腫瘤活性有效部位）水相萃余物粗總合草苔蟲總酯組分進(jìn)一步精制的總酯組分硅膠柱層析石油醚丙酮5:11:1梯度洗脫多次SephadexLH-20層析：二氯甲烷：甲醇1:1；正己烷：二氯：甲醇4:5:1；正己烷：二氯：甲醇10:10:1及其他系統(tǒng)200300目硅膠柱層析二氯甲烷甲醇梯度洗脫TLC檢測bryostatinRP-HPLC制備分離85甲醇洗脫, 2mL/min228nm檢測活性跟蹤分離進(jìn)一步精制的總酯組分ODS反相硅膠柱層析50100甲醇梯度洗脫活性成分2.5

4、g45681011161819一系列草苔蟲內(nèi)酯類化合物n總草苔蟲內(nèi)酯體外抗癌活性總草苔蟲內(nèi)酯體外抗癌活性n活性篩選結(jié)果表明，總草苔蟲內(nèi)酯對活性篩選結(jié)果表明，總草苔蟲內(nèi)酯對K562人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞株具有超強(qiáng)的抑制人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞株具有超強(qiáng)的抑制作用，作用， 110-18 m mg/ml；對；對U937人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株也有較強(qiáng)的抑制人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株也有較強(qiáng)的抑制活性，活性， 平均為平均為1.7m mg/ml.nBryostatin 19體外抗癌活性結(jié)果體外抗癌活性結(jié)果nbryostatin 19對U937人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株具有極強(qiáng)的殺滅作用極強(qiáng)的殺滅作用(2.810-3mg

5、/m1)，同時對HL-60人早幼粒細(xì)胞白血病和K562人紅白細(xì)胞白血病等細(xì)胞株均有顯著的抑制作用。n柔荑軟珊瑚柔荑軟珊瑚Nephthea spn軟珊瑚亞目，軟珊瑚亞目，Nephtheidae科，多觸手科，多觸手n采自中國南海西沙群島采自中國南海西沙群島永興島永興島n由中國南海海洋研究所由中國南海海洋研究所鄒仁林研究員鑒定鄒仁林研究員鑒定新鮮樣品6kg95乙醇室溫浸泡提取10 day 5 times減壓濃縮褐色膏狀物74.3g65乙酸乙酯洗脫組分A多次柱層析重結(jié)晶100200目硅膠快速柱層析石油醚乙酸乙酯梯度洗脫水洗，剪碎75乙酸乙酯洗脫組分B多次重結(jié)晶甾醇1甾醇2nMTT法體外抗腫瘤活性法體外

6、抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明：實(shí)驗(yàn)表明：n兩種甾醇化合物對肝癌細(xì)胞兩種甾醇化合物對肝癌細(xì)胞(BEL-7402)、小鼠白血瘤細(xì)胞小鼠白血瘤細(xì)胞(P388)、人結(jié)腸癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞(LOVO)和人乳腺癌細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞(MCF)表現(xiàn)出抑制表現(xiàn)出抑制活性?；钚?。n海藻是海洋生物中的一大類群，相關(guān)化學(xué)和活性海藻是海洋生物中的一大類群，相關(guān)化學(xué)和活性成分的研究主要集中在紅藻和褐藻；盡管綠藻代成分的研究主要集中在紅藻和褐藻；盡管綠藻代謝產(chǎn)物也具有較好的生物活性，但是可能由于其謝產(chǎn)物也具有較好的生物活性，但是可能由于其種群相對較少同時含有大量種群相對較少同時含有大量色素色素，因此相關(guān)報(bào)道，因此相關(guān)報(bào)道很少。很少

7、。n為了尋找具有特殊結(jié)構(gòu)的化合物供活性篩選，筆為了尋找具有特殊結(jié)構(gòu)的化合物供活性篩選，筆者首次對廣泛分布于我國南海海域的綠藻基根硬者首次對廣泛分布于我國南海海域的綠藻基根硬毛藻毛藻Chaetomorpha basiretorsa Setchell進(jìn)進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究行了比較系統(tǒng)的研究n基根硬毛藻Cbasiretorsa Setchell采自廣東省湛江市硇洲島，由中國科學(xué)院海洋研究所夏邦美研究員鑒定。新鮮樣品100200kg風(fēng)干樣品14.3 kg95乙醇浸泡提取減壓濃縮膏狀物574 g乙酸乙酯萃取 萃取物370 g水相萃余物Sephadex LH-20柱層析石油醚:氯仿:甲醇5:5:1洗脫硅膠

8、柱層析石油醚乙酸乙酯梯度洗脫TLC檢測化合物I35mgII35mgIII528mgIV12mg粉碎一般每次35天，3次以上蒸餾水懸浮可先用石油醚萃取除葉綠素組分A1 A2A3A4A5A6A75:1色素主組分Sephadex LH-20柱層析，石油醚:氯仿:甲醇5:5:1洗脫色素主組分反復(fù)硅膠柱層析石油醚:丙酮8:1HPLC純化75甲醇反復(fù)硅膠柱層析石油醚:丙酮20:1化合物V26mgVI18mgn4個無環(huán)二萜：n7，11，15-trimethyl-3-methylene-hexadecan-1，2-diol (I)n3，7，11，15-tetramethyl-hexadecan-1，3-dio

9、l ()n2個長鏈脂肪族化合物：nPhytol (III)nPhytenal (IV)n甘油-1-軟脂酸酯 (V)n十六烷-3-烯酸 (VI)n藥理活性：藥理活性：n用用MTT法對上述化合物在人腫瘤細(xì)胞法對上述化合物在人腫瘤細(xì)胞KB、Bel-7402、PC-3M、KeTr3和和MCF-7上進(jìn)行了細(xì)胞毒活性測試，結(jié)上進(jìn)行了細(xì)胞毒活性測試，結(jié)果表明，化合物果表明，化合物I對人腫瘤細(xì)胞對人腫瘤細(xì)胞KB、KeTr3和和MCF-7人腫人腫瘤細(xì)胞株顯示一定的選擇性毒性，瘤細(xì)胞株顯示一定的選擇性毒性，IC50分別為分別為3.42、2.38、1.78m mgmL。n另外，用另外，用MTT法對上述化合物在犬血管

10、平滑肌細(xì)胞模型上法對上述化合物在犬血管平滑肌細(xì)胞模型上進(jìn)行增殖抑制活性測試，以胰島素為陽性對照，并對結(jié)果進(jìn)行增殖抑制活性測試，以胰島素為陽性對照，并對結(jié)果進(jìn)行組間進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，在檢驗(yàn)，結(jié)果表明，在0125 mgmL質(zhì)量濃質(zhì)量濃度下，同陽性對照組吸光度值相比較，化合物度下，同陽性對照組吸光度值相比較，化合物I、III和和的吸光度值呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異的吸光度值呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P005)，表明以，表明以上化合物具有一定的抑制犬血管平滑肌細(xì)胞增殖活性。上化合物具有一定的抑制犬血管平滑肌細(xì)胞增殖活性。菌株A01059250mL三角瓶100mL種子培養(yǎng)基葡萄糖10g大豆粉10g酵母膏1

11、0g可溶性淀粉5gKH2PO4 0.5g天然陳海水1000mLpH 7.228C 150rpm48h種子發(fā)酵培養(yǎng)基大豆粉10g玉米粉10g可溶性淀粉5gKH2PO4 0.5g天然陳海水1000mLpH 7.26%接種量28C 150rpm6 days發(fā)酵液8000rpm離心10min菌絲體上清液乙酸乙酯萃取萃余水相萃取液減壓濃縮活性提取物HPLC分析HPLC半制備 活性追蹤活性色譜峰分析條件為：流動相為甲醇-水，甲醇由30在20 min內(nèi)線性升到60，然后再20 min線性升到100，流速1 ml/min，檢測波長220 nm。根據(jù)分析條件確定Waters Delta Prep4000半制備液相色譜儀對各組分進(jìn)行制備的流動相條件為：waters NovaPak C18 (25 mmx200 mm,6 mm)；流動相為甲醇-水，甲醇由35保持15 min后，15 min內(nèi)線性升到90，然后再保持10 min，流速15ml/min，檢測波長220nm，室溫。活性物質(zhì)活性物質(zhì)(結(jié)構(gòu)待定結(jié)構(gòu)待定)n活性檢測活性檢測n采用紙片