徐敏-低氧誘導(dǎo)因子1在缺氧性疾病中的作用研究

1、 低氧誘導(dǎo)因子1在缺氧性疾病中的作用研究徐敏，聶時南*江蘇 南京 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)科 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院 210002通訊作者：聶時南，E-mail:shn_nie，南京市中山東路305號南京軍區(qū)南京總醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)科，電話織細(xì)胞處于氧濃度正常的微環(huán)境中是其產(chǎn)生能量以發(fā)揮生理功能所必需的。然而，在疾病（如急慢性心血管疾病、肺部疾病及腫瘤等）中細(xì)胞微環(huán)境往往是缺氧狀態(tài)。人們對于哺乳動物氧調(diào)節(jié)的認(rèn)識源于缺氧誘導(dǎo)促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）的研究，從而發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞低氧反應(yīng)的核心因子HIF-1。低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia in

2、ducible factor-1，HIF-1）作為調(diào)節(jié)細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)的核轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)一系列基因的表達，介導(dǎo)血管生成、紅細(xì)胞生長、血管內(nèi)皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素及大部分糖酵解的酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，為組織細(xì)胞提供充足的氧和營養(yǎng)以適應(yīng)低氧反應(yīng)。本文僅針對HIF-1在缺血性疾病、炎癥和腫瘤中的研究進展做一簡要綜述。1、HIF-1的結(jié)構(gòu)概述HIF-1為異源二聚體的核轉(zhuǎn)錄因子，幾乎在所有細(xì)胞生物中表達1，由存在于細(xì)胞質(zhì)中氧濃度敏感的亞基和存在于細(xì)胞核中構(gòu)建性表達的亞基組成。亞基主要結(jié)構(gòu)特征是氨基端存在一堿性螺旋環(huán)螺旋（bHLH）構(gòu)型，其后有一保守的PAS結(jié)構(gòu)域2，兩者均有結(jié)合DNA和促使亞基二聚化的功能；

3、羧基末端有氧依賴的降解區(qū)域(ODDD)和反式轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(TAD)，前者可被脯氨酸羥化酶2 (PHD-2)羥基化，后者可調(diào)節(jié)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性。亞基羧基端轉(zhuǎn)錄激活域（CTAD)，可與CREB 結(jié)合蛋白 (CBP) 和p300兩轉(zhuǎn)錄共激活因子相互作用， 是發(fā)揮HIF-1轉(zhuǎn)錄活性所必需的。亞基是芳烴受體轉(zhuǎn)運蛋白（ARNT）的基因產(chǎn)物，非氧依賴的蛋白，在細(xì)胞核中結(jié)構(gòu)性表達。2、HIF-1的調(diào)節(jié)2.1 低氧應(yīng)答的機制細(xì)胞微環(huán)境氧濃度正常時，氧分壓敏感的PHD識別HIF-1中ODDD區(qū)Pro402或Pro 564并將其羥基化，為希佩爾-林道腫瘤抑制蛋白(pVHL)識別，之后形成功能性E3泛素-蛋白連

4、接酶復(fù)合物，進行泛素依賴的蛋白酶解。另一控制HIF-1活性的為氧濃度敏感的天冬酰胺?；u化酶FIH(factor inhibiting HIF)，羥基化HIF-1蛋白，阻斷其介導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄及共激活因子p300與CBP的招募3，從而抑制HIF轉(zhuǎn)錄活性。然而在低氧濃度時，PHD/FIH介導(dǎo)的羥基化受阻，HIF-1蛋白穩(wěn)定、活化，累積后進入細(xì)胞核與HIF-1結(jié)合形成HIF-1復(fù)合物， 并招募共激活子p300/CBP結(jié)合到保守的A/GCGTG缺氧反應(yīng)元件（HRE)，誘導(dǎo)靶基因的表達。PHD2和PHD3基因亦存在HRE, 可形成負(fù)反饋環(huán)。 2.2 非氧濃度依賴的調(diào)節(jié)組織細(xì)胞處于正常氧濃度時，亦存在許

5、多激活HIF-1的刺激因素，往往為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，與缺氧刺激形成鮮明對比，作用于亞基的轉(zhuǎn)錄翻譯水平，如蛋白激酶C（PKC）增加HIF-1轉(zhuǎn)錄的效率。PKC信號通路能激活S6核糖體蛋白，磷酸化的S6蛋白可識別HIF-1mRNA，大大提升HIF-1mRNA翻譯效率，使其產(chǎn)生速率遠(yuǎn)大于蛋白酶解速率，從而增加HIF-1復(fù)合物在細(xì)胞核的水平。亦有研究表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K) -Akt-mTOR信號通路可磷酸化4E-BP1，調(diào)節(jié)HIF-1翻譯過程，增加其蛋白合成4。多種細(xì)胞因子可激活PI3K信號通路如胰島素樣生長因子1(IGF-1)、表皮生長因子（EGF）及脂多糖等，影響血管平滑肌細(xì)胞及核巨噬細(xì)胞

6、中HIF-1的激活5, 6。2.3 HIF-1的自身修飾HIF-1亞基自身直接的磷酸化作用增加HIF-1活性，其機制可能是通過阻斷蛋白酶體/VHL的識別。HIF-1自身磷酸化鮮少知道，僅體外實驗發(fā)現(xiàn)p42/p44有絲分裂原激活的蛋白激酶可磷酸化該蛋白7。3、HIF-1的主要生物學(xué)效應(yīng)HIF-1與含有低氧反應(yīng)元件和順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的靶基因結(jié)合，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子及酶的表達，以應(yīng)對低氧環(huán)境。HIF-1可上調(diào)VEGF、FLT-1、ANGII等基因表達影響血管生成，VEGF是最有效及表皮特異性的血管生成調(diào)節(jié)因子，促進內(nèi)皮細(xì)胞向缺氧區(qū)域遷移，形成新的血管，供應(yīng)缺氧區(qū)域含氧量充足的

7、血液；誘導(dǎo)EPO刺激紅細(xì)胞再生以提高機體血液攜氧能力；iNOS、血紅素氧合酶(HO1)用于合成NO和CO，影響血管緊張度。HIF-1還可誘導(dǎo)Clutl、Glut3、LDH-A、醛縮酶、烯醇化酶、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)等多種酶缺氧時促進糖酵解從而增加ATP產(chǎn)量1, 8。Krick et al. 9報道肺泡內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1過度表達導(dǎo)致凋亡增加；其還可影響凋亡前基因NiP3及抑癌因子P53。 4、HIF-1與缺氧性疾病4.1 HIF-1在缺血性疾病中的研究在心肌缺血的治療案例中，HIF-1的上調(diào)可刺激血管生成和血流增加，涉及血管生成的基因如VEGF, 基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP

8、2), 組織蛋白酶D (CATHD)和角蛋白(KRT)，均為HIF-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的靶點。近期研究中，用缺乏ODDD結(jié)構(gòu)域的HIF-1DNA注射給老鼠，明顯增加傷口或者缺血區(qū)域的血液供應(yīng)，表明 HIF-1表達水平的增加有助于供給病灶缺血部分血液和營養(yǎng)物質(zhì)10。在鼠心肌梗塞模型中，給予HIF-1混合物可誘導(dǎo)鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，減少缺血損傷；該混合物包含的DNA結(jié)合域來源于HIF-1的二聚化域和HSV VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活域 11；用siRNA 抑制PHD2亦可減少鼠心肌梗塞的面積，另外在保護心肌抵抗缺血再灌注損傷方面，PHD的小分子抑制劑很可能成為臨床有效的治療靶點12-14。因而，HIF-1的

9、在缺血性疾病中的研究有重要臨床價值，為不能實施手術(shù)的缺血病人帶來希望。4.2 HIF-1有助于炎癥反應(yīng)和氧含量的恢復(fù) Cramer等15證明HIF-1是髓系細(xì)胞新陳代謝所必需的。HIF-1蛋白在體內(nèi)過表達誘導(dǎo)局部炎癥增加；選擇性基因敲除髓系細(xì)胞HIF-1基因，可減弱細(xì)胞聚集、遷移和殺菌應(yīng)答的能力。骨髓細(xì)胞對于HIF-1的依賴與糖酵解相關(guān)，缺乏該基因細(xì)胞不能有效的產(chǎn)生ATP, 無法快速遷移到損傷組織或破壞外來入侵者15。除此，HIF-1的表達在骨髓細(xì)胞分化成單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有著重要的作用16?？梢?，HIF-1在炎癥反應(yīng)中有著重要的作用13, 17，為將來拓寬抗炎藥物研究領(lǐng)域提供理論依據(jù)。4.3

10、 HIF-1在腫瘤中的研究進展眾多研究發(fā)現(xiàn)HIF-1在食管癌、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞中過表達，并且在多種轉(zhuǎn)移瘤中亦有HIF-1表達量顯著增加，可見腫瘤的發(fā)生發(fā)展與HIF-1的表達密切相關(guān)。如前所述，HIF-1調(diào)控多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。腫瘤組織中，隨著腫瘤細(xì)胞不斷生長，其體積變大，導(dǎo)致腫瘤中央血供不足而缺氧壞死，從而誘導(dǎo)HIF-1表達，調(diào)控血管生成相關(guān)因子的基因表達，促進血管生成18。腫瘤細(xì)胞缺血缺氧，誘導(dǎo)產(chǎn)生的HIF-1還可調(diào)控多種糖代謝和糖酵解相關(guān)的酶，為細(xì)胞的快速生長提供能量19。同時，研究表明，HIF-1在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞凋亡中都發(fā)揮著重要作用。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移

11、方面，HIF-1可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達增加，促使胞外基質(zhì)降解；還可導(dǎo)致上皮型鈣粘素（e-cadherin，E-cad）與鏈接素（-catenin，-cat）表達下降，使得細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)間粘附降低，腫瘤細(xì)胞得以轉(zhuǎn)移。研究報道HIF-1還可促進腫瘤細(xì)胞的凋亡，但其具體機制仍有待進一步研究。腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境機制的研究中還發(fā)現(xiàn)microRNAs與HIF-1存在相互作用，參與調(diào)節(jié)缺氧環(huán)境下腫瘤的生長20。Kulshreshtha等2007年首次報道，低氧可誘導(dǎo)miRNAs的表達，其啟動子區(qū)域包含低氧反應(yīng)元件，簡稱HRM

12、s，如表達上調(diào)的miR-210、-155、-327/373和-10b 21，以及表達下調(diào)的miR-20b22、miR-200b23。 Kelly et al發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)的miR-210可減少HIF-1羥基化增加其穩(wěn)定，抑制甘油3磷酸脫氫酶樣1 (GPD1L)；抑制E2F3和MNT（c-Myc拮抗劑）表達，加速G1/S轉(zhuǎn)換，促進細(xì)胞增殖24。miR-21則靶向PTEN和激活A(yù)kt 、ERK1/2 信號通路，上調(diào)HIF-1和VEGF，誘導(dǎo)腫瘤血管生成。因此，促進某些HRMs的表達或者通過抗轉(zhuǎn)錄療法抑制某些HRMs可成為應(yīng)對腫瘤細(xì)胞抗藥性和抗放射性的策略及未來抗癌治療的靶點。近期發(fā)現(xiàn)HIF-1基因的

13、單核苷酸多態(tài)性在多種癌癥臨床病理特征的研究有助于腫瘤的診斷。人HIF-1基因定位在染色體14q21-24，其N-TAD基因存在兩種多態(tài)性，命名為C1772T和G1790A，它們分別導(dǎo)致蛋白脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸，丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸25。研究表明這些變異的存在使HIF-1相比于野生型具有更高的轉(zhuǎn)錄活性。近期一篇Meta分析26結(jié)果表明HIF-1基因C1772T多態(tài)性和癌癥的組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增加性風(fēng)險相關(guān)；G1790A多態(tài)性與較大的腫瘤大小的增加性風(fēng)險和邊界淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險相關(guān)。因而，HIF-1多態(tài)性可能為癌癥潛在的診斷因素。結(jié)語隨著在HIF-1研究的不斷深入，從HIF-1mRNA轉(zhuǎn)錄，蛋白翻譯、亞基二聚化、DNA結(jié)合活性、HIF-1轉(zhuǎn)錄活性方面功能予以干預(yù)，使得探究治療缺氧性疾病的新途徑逐漸成為可能。盡管在動物缺血模型和人類臨床試