環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)

1、環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 目 錄1. 顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察2-32 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法4-53培養(yǎng)基的配制和滅菌6-104微生物接種技術(shù)11-135微生物大小的測(cè)定14-156水中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)16實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察一、 目的1.掌握顯微鏡的使用方法。2.通過實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)觀察微生物形態(tài)的基本方法，了解細(xì)菌、真菌和放線菌的形態(tài)特征。二、 原理微生物都是個(gè)體微小的生物，用肉眼不能看到它們的個(gè)體，所以觀察它們的形態(tài)必須在顯微鏡下進(jìn)行，另外微生物細(xì)胞具有較高的透明性，所以有些微生物（尤其是細(xì)菌和放線菌）需經(jīng)過染色后才能觀察清楚，細(xì)菌個(gè)體很小，其大小以微米計(jì)，所以需要在油鏡下觀察。放線菌

2、和霉菌的個(gè)體一般呈絲狀，并且明顯地分為基質(zhì)菌絲和氣生菌絲。成熟的個(gè)體還具有各種形態(tài)的孢子。因此觀察內(nèi)容包括基質(zhì)菌絲、氣生菌絲和孢子的形態(tài)，并注意它們的區(qū)別。三、 材料和用品1、 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、解剖針、刀片2、 細(xì)菌和真菌玻片標(biāo)本、霉菌試管培養(yǎng)物3、 染色液：石炭酸復(fù)紅染色液 呂氏美蘭染色液 乳酸石炭酸棉蘭染色液四、 微生物形態(tài)觀察(一) 細(xì)菌形態(tài)觀察1、 將細(xì)菌示范片置于鏡臺(tái)上，用標(biāo)本夾住。2、 在低倍鏡下，調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器和細(xì)調(diào)節(jié)器，使物像清楚；然后調(diào)節(jié)推進(jìn)器，使觀察對(duì)象處于接物鏡的正下方，調(diào)節(jié)入射光強(qiáng)度，使明亮度適宜，認(rèn)真觀察標(biāo)本。最后將觀察對(duì)象移至視野中心，準(zhǔn)備在高倍鏡下觀

3、察。3、 將高倍接物鏡頭轉(zhuǎn)至正下方，轉(zhuǎn)換接物鏡時(shí)，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相接損壞鏡頭。調(diào)節(jié)入射光強(qiáng)度，使明亮度適宜，再用調(diào)節(jié)器調(diào)至物像清楚，認(rèn)真觀察標(biāo)本。再將觀察部位移至視野中心，準(zhǔn)備油鏡觀察。4、 油鏡觀察方法(1)用粗調(diào)節(jié)器將鏡頭提起約1厘米，將油鏡頭轉(zhuǎn)至正下方。 (2)在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴一滴香柏油(3)一面從側(cè)面觀察，一面用粗調(diào)節(jié)器將鏡頭器小心調(diào)節(jié)至幾乎與標(biāo)本相接觸。調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)特別小心，注意不能使鏡頭接觸標(biāo)本片，用力過猛不僅會(huì)壓碎玻片，也會(huì)損壞鏡頭。 (4)一邊從目鏡觀察，一邊調(diào)節(jié)光線強(qiáng)度，使明亮度適宜；然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距，直至能清楚地觀察到物像，再認(rèn)真觀察，記下觀察結(jié)

4、果。 (二) 真菌形態(tài)觀察 1. 玻片標(biāo)本觀察 2. 霉菌試管培養(yǎng)物觀察(1)于潔凈的載玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蘭染色液，用解剖針從菌落的邊緣處取少量帶有孢子的菌絲于染液中，再細(xì)心地把菌絲挑散開，然后用蓋玻片蓋上，注意不要產(chǎn)生氣泡。(2)置顯微鏡下觀察，先在低倍鏡下觀察，必要是再換高倍鏡觀察。(3)記錄觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、繪圖說明所觀察的細(xì)菌和霉菌的形態(tài)特征，并比較細(xì)菌和霉菌形態(tài)上的異同。 實(shí)驗(yàn)二 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法一、 目的1.明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理2.學(xué)習(xí)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法二、 原理利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢

5、子懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)室的容積一定（0.1mm3），可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和。血球計(jì)數(shù)板有兩個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分9個(gè)大方格，中間的大方格為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種為16*25型，一種為25*16型。三、 器材和用品顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片 無菌毛細(xì)管 釀酒菌懸液四、操作步驟1. 稀釋 將釀酒酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。2. 鏡檢記數(shù)室在加樣前，先對(duì)記數(shù)板的記數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能

6、進(jìn)行記數(shù)。3. 加樣品將清潔干燥的血球記數(shù)板蓋上蓋波片，再用無菌的細(xì)口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)行計(jì)數(shù)室，一般進(jìn)行計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。 4. 顯微鏡計(jì)數(shù)靜止五分鐘后，將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5-10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格（可選4個(gè)角和中央的中格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作兩個(gè)菌

7、體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的值來計(jì)算樣品的含菌量。5. 清洗血球計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭上用水柱沖洗，洗完后晾干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告和思考題1.結(jié)果將結(jié)果記于下表。A表示中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。AB菌數(shù)/ml二室平均值12345第一室第二室2.思考題根據(jù)你實(shí)驗(yàn)的體會(huì)，說明用血球計(jì)數(shù)板的誤差主要來自那些方面？應(yīng)如何盡量減少誤差，力求準(zhǔn)確？ 實(shí)驗(yàn)三 培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的學(xué)會(huì)一般培養(yǎng)基的制備原理、方法、掌握培養(yǎng)基及器皿的滅菌方法二、原理培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)

8、物配置而成的基質(zhì)。其中除含有水份、碳水化合物、含氮化合物和無機(jī)鹽外，有的還需要維生素。以提供微生物新陳代謝所需要的能源、碳源、N源和其它化合物，由于不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求不同，因此，需提供不同種類的培養(yǎng)基。一般培養(yǎng)基細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)放線菌常用淀粉培養(yǎng)基，培養(yǎng)霉菌常用馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌常用麥芽汁培養(yǎng)基。培養(yǎng)基除了要滿足微生物所要求的各種營(yíng)養(yǎng)條件外，還應(yīng)保證微生物所需要的其它生活條件，如適宜的酸堿度，滲透壓等，因此，對(duì)不同種類的微生物，應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到一定的pH范圍，如細(xì)菌、放線菌培養(yǎng)基為中性；霉菌、酵母菌培養(yǎng)基為弱酸性。根據(jù)研究目的的不同，可以將培養(yǎng)基制成固體，半固體和

9、液體三種形式。固體培養(yǎng)基的成分與液體相同僅在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑作支持物。通常加入1.52.0的瓊脂，半固體加入0.30.5的瓊脂作支持物，有時(shí)也可用明膠或硅膠。三、材料與用具（一） 材料：牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl；1mol/L NaOH,，1mol/L HCL（二） 用具：試管、錐形瓶、漏斗、量筒、移液管、燒杯、紗布、棉花、玻璃棒、pH試紙、漏斗架、止水夾、臺(tái)秤、硫酸紙、藥匙、防潮紙、線繩、標(biāo)簽紙、剪刀、解剖刀、鑷子、白瓷盤、鐵絲筐。四、方法（一） 培養(yǎng)基的制作方法1、 稱量：按照培養(yǎng)基的配方，準(zhǔn)確稱取各成分于燒杯中。2、 溶化：向上述燒杯中加入所需要的水量，攪動(dòng)，然后加熱使其溶解。

10、3、 調(diào)節(jié)pH值：用0.1N NaOH或1N HCl調(diào)至合適的范圍。4、 過濾：用濾紙或雙層紗布（中間夾一層脫脂棉花）趁熱過濾。5、 分裝：根據(jù)不同的需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管后三角瓶?jī)?nèi)，管（瓶）口塞上塞子。（1）液體：分裝高度以試管高度的四分之一左右為宜；（2）固體：分裝試管，每管為管高的五分之一，滅菌后制成斜面，分裝三角瓶的容量以不超過三角瓶的一半為宜。（3）半固體：分裝試管一般以管高的三分之一為宜。滅菌后垂直待凝成半固體深層瓊脂。6、 塞：培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉花，以阻止外界微 生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。7、 滅菌：高壓蒸汽滅菌，一

11、般培養(yǎng)基1.05公斤/厘米2 ，滅菌2030分鐘。圖 31 培養(yǎng)基的分裝 （二）培養(yǎng)基配制的步驟，按下列培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基。肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌用）牛肉膏 5g 瓊脂 20g蛋白胨 10g 蒸餾水 1000mlNaCl 5g pH 7.27.4 （三）、培養(yǎng)基制作注意事項(xiàng)1、加熱溶化過程中，要不斷地?cái)嚢瑁悦猸傊蚱渌腆w物質(zhì)粘在燒杯底上燒焦，以致燒杯破裂。加熱過程中所蒸發(fā)的水分應(yīng)補(bǔ)足。2、pH值須按各種不同培養(yǎng)基的要求而準(zhǔn)確測(cè)定。1、 所用器皿要潔凈，勿用鐵制或銅制器皿。2、 分裝培養(yǎng)基時(shí)，注意不得使培養(yǎng)基在瓶口或管口壁上端沾染，以免浸濕棉塞引起染菌污染;3、 培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和溫度

12、，需按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以保證殺菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。 圖32 棉 塞圖33 斜面的擺法（四）、滅菌1、 培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌（1）需滅菌的物品、棉塞等用防潮紙包好（防止鍋內(nèi)水蒸汽把棉塞淋濕），放入滅菌鍋內(nèi)，放入鍋內(nèi)的材料要擺的疏松，不可太擠，否則阻礙蒸汽流通，影響殺菌效果。 （2）關(guān)閉滅菌鍋蓋，切勿漏氣。(3)慢慢打開蒸汽口，不要使蒸汽過猛地沖入鍋內(nèi)，排除一部分冷氣，關(guān)閉排氣開關(guān)，先使夾套升溫至壓力表為0.5公斤/厘米2，再使內(nèi)層壓力升至0.5公斤/厘米2，然后開啟排氣開關(guān)，使夾套及鍋內(nèi)冷氣除盡。 （4）關(guān)閉排氣開關(guān)后，整個(gè)滅菌鍋成為密閉狀態(tài)，而蒸汽又不斷增多，這時(shí)溫度和壓力

13、都上升，當(dāng)溫度升至121，壓強(qiáng)達(dá)到1.05公斤/厘米2時(shí)，保持2030分鐘，即達(dá)到滅菌目的。 （5）滅菌完畢，關(guān)閉進(jìn)汽開關(guān)，或切斷電源，待壓力降至“0”時(shí)，打開排氣開關(guān)，注意不能打開過早，否則突然降壓致使培養(yǎng)基沸騰，使棉塞玷污，甚至沖出容器以外。 （6）打開滅菌鍋蓋，取出已滅菌的器皿及培養(yǎng)基。2、 干熱滅菌法常用于空玻璃器皿的滅菌，但凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用干熱法滅菌，進(jìn)行滅菌時(shí)，先將要滅菌器皿（培養(yǎng)皿、移液管的包裝方法見示范）包好，放入烘箱內(nèi)。調(diào)節(jié)溫度至160170維持12小時(shí)（當(dāng)溫度升至80以上后切勿打開烘箱門，以免引起玻璃器皿破裂和火災(zāi)）。滅菌后當(dāng)溫度降至3040時(shí)，

14、打開箱門，取出滅菌器皿。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告思考題1.培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應(yīng)該具備哪些條件？為什么2.培養(yǎng)基為什么要滅菌后再用？如何檢查所配好的培養(yǎng)基是無菌的？ 實(shí)驗(yàn)四 微生物接種技術(shù)一、 目的：1.掌握微生物的接種技術(shù) 二、材料與用具材料：菌種，牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，酒精燈，接種環(huán)，火柴等三、操作步驟1.平板的制作和培養(yǎng)將已滅菌的固體培養(yǎng)基融化后（水浴融化）冷到45-50（溫度過高，培養(yǎng)皿蓋上凝結(jié)水太多，菌易被沖掉或燙死；溫度過低，則培養(yǎng)基凝固，不易倒出）。右手拿培養(yǎng)基，左手把皿蓋打開一逢傾入培養(yǎng)基15-20毫升迅速蓋妥，平放桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基與土壤稀釋液充分混勻，凝固后，即成平板，將培養(yǎng)皿倒置于培

15、養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)菌即在所固定的位置長(zhǎng)成肉眼可見的菌落。2.接種方法I斜面接種技術(shù)（1） 試管先貼上標(biāo)簽，注明菌名，日期和姓名，然后將菌種斜面和欲接種斜面試管放在左手食指.中指和無名指之上，大拇指按在二管中央，菌種管口在外方，斜面稍朝上（圖41（a）（2） 先將棉塞用右手扭轉(zhuǎn)松動(dòng)，以利接種時(shí)拔出（3） 右手拿接種環(huán)末端，使其垂直于火焰中，燒紅滅菌（4） 用右手小指，無名指和手掌拔下棉塞(圖41(b)（5） 以火焰燒管口，燒時(shí)應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動(dòng)試管口，使試管口沾染的少量雜菌被燒死(圖41(c)（6） 將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸沒有長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死被接種的菌體，然后輕輕接觸菌體

16、取出少許，慢慢將接種環(huán)抽出試管圖（41（d）（7） 迅速將接種環(huán)在火旁伸進(jìn)欲接種試管，在培養(yǎng)基上輕輕劃線，劃線時(shí)要由底部到頂部，由下而上，但不要把培養(yǎng)基劃破，也不要使菌種污染管壁（41（e）（8） 燒試管口，并在火旁將塞塞上，塞棉塞時(shí)，不要用試管去通棉塞，以免試管在運(yùn)動(dòng)時(shí)污染雜菌（圖（41（f，g）（9） 將接種環(huán)在火焰上再燒紅滅菌，放下接種環(huán)后，再騰出手將棉塞塞緊（圖（41（h）II液體接種（由斜面培養(yǎng)基接入液體培養(yǎng)基內(nèi)）(1)操作方法與前相同，但要使試管向上略斜，以免液體培養(yǎng)液流出。(2)將取有菌種的接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時(shí)，要使環(huán)在液體表面與管壁接觸的部分輕輕打動(dòng)，使菌體在培養(yǎng)基中分散出來

17、，放置于37 溫箱中培養(yǎng)。III穿刺接種 將取有菌種的接種針自固體培養(yǎng)基的中心刺入，直到管底，但不可刺穿，然后拔出，塞棉塞，置37 溫箱培養(yǎng)。圖41 斜面接種 四、思考題：1. 微生物接種應(yīng)注意的問題？ 2.培養(yǎng)微生物應(yīng)考慮哪些原則？培養(yǎng)時(shí)，為什么要把已接種的培養(yǎng)皿倒置保溫培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)五 微生物大小的測(cè)定一、目的掌握用顯微測(cè)微尺測(cè)量微生物大小的基本方法。二、原理微生物細(xì)胞大小，是微生物的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。由于菌體很小，只能在顯微鏡下測(cè)量。用來測(cè)量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。鏡臺(tái)測(cè)微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片。一般將1mm等分為100格（2mm等分為2

18、00格），每格長(zhǎng)度等于0.01mm .是專用于校正目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度的。目鏡測(cè)微尺是一塊可放在接目鏡內(nèi)的隔板上的圓形小玻片，其中央刻有精確的刻度，有等分50小格或100小格兩種，每五小格有一長(zhǎng)線相隔。由于所用接目鏡放大倍數(shù)和接物鏡放大倍數(shù)的不同，目鏡測(cè)微尺每小格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度也就不同，因此，目鏡測(cè)微尺不能直接用來測(cè)量微生物的大小，在使用前必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校正，以求得在一定放大倍數(shù)的接目鏡和接物鏡下該目鏡測(cè)微尺每小格的相對(duì)值，然后才可用來測(cè)量微生物的大小。 三、器材枯草芽孢桿菌染色玻片標(biāo)本，目鏡測(cè)微尺，鏡臺(tái)測(cè)微尺，顯微鏡，擦鏡紙，香柏油等。四、操作步驟1.目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定（1）放置目鏡測(cè)微

19、尺 取出接目鏡，旋開接目鏡透鏡，將目鏡測(cè)微尺的刻度朝下放在 接目鏡筒內(nèi)的隔板上，然后旋上接目鏡，最后將此接目鏡插入鏡筒內(nèi)。（2）放置鏡臺(tái)測(cè)微尺 將鏡臺(tái)測(cè)微尺置于顯微鏡的載物臺(tái)上，使刻度面朝上。（3）校正目鏡測(cè)微尺 先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，當(dāng)看清鏡臺(tái)測(cè)微尺后，轉(zhuǎn)動(dòng)接目鏡，使目鏡測(cè)微尺的刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺的某一區(qū)間的兩對(duì)刻度線完全重合，然后計(jì)數(shù)出兩對(duì)重合線之間各自所占的格數(shù)。 根據(jù)計(jì)數(shù)得到的目鏡測(cè)維尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺重合線之間各自所占的格數(shù)，通過如下公式換算出目鏡測(cè)微尺每小格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度。目鏡測(cè)微尺每小格長(zhǎng)度。 目鏡測(cè)微尺每小格長(zhǎng)度=兩對(duì)重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)10兩對(duì)重合線間目鏡測(cè)微尺格數(shù) 同法校正在高倍鏡和油鏡下目鏡測(cè)微尺每小格所代表的長(zhǎng)度。2 菌體大小的測(cè)定 目鏡測(cè)微尺校正后，移去鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上枯草芽孢桿菌染色玻片標(biāo)本，校正 焦距使菌體清晰，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺（或轉(zhuǎn)動(dòng)染色標(biāo)本），測(cè)出枯草芽孢桿菌的長(zhǎng)和寬各占幾格，然后換算出單個(gè)菌體的大小值，最后，求出平均值。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、 結(jié)果（1） 將目鏡測(cè)微尺校正結(jié)果填入下表。接物鏡接物鏡倍數(shù)目鏡