第十章 酶的催化機(jī)理

1、第十章第十章 酶的催化機(jī)制酶的催化機(jī)制提綱提綱一、酶催化機(jī)理研究的主要方法二、過渡態(tài)穩(wěn)定學(xué)說三、過渡態(tài)穩(wěn)定的化學(xué)機(jī)制鄰近定向效應(yīng)廣義的酸堿催化靜電催化金屬催化共價(jià)催化底物形變四、幾種常見酶的結(jié)構(gòu)與功能蛋白酶1. 溶菌酶酶催化機(jī)理研究的主要方法酶催化機(jī)理研究的主要方法找出保守性的氨基酸殘基三維結(jié)構(gòu)的研究定點(diǎn)突變動(dòng)力學(xué)分析化學(xué)修飾計(jì)算機(jī)模擬過渡態(tài)穩(wěn)定學(xué)說過渡態(tài)穩(wěn)定學(xué)說J 根據(jù)過渡態(tài)理論，在任何一個(gè)化學(xué)反應(yīng)體系中，反應(yīng)物需要到達(dá)一個(gè)特定的高能狀態(tài)以后才能發(fā)生反應(yīng)。這種不穩(wěn)定的高能狀態(tài)被稱為過渡態(tài)。達(dá)到過渡態(tài)要求反應(yīng)物必須含有足夠的能量以克服活化能。J 1946年P(guān)auling 提出，酶與過渡態(tài)的親和

2、力要比對(duì)基態(tài)（底物）的親和力高得多，酶的催化源于其對(duì)過渡態(tài)的穩(wěn)定作用?；瘜W(xué)反應(yīng)的過渡態(tài)及化學(xué)反應(yīng)的過渡態(tài)及其前后的自由能變化其前后的自由能變化HA-HB + HCHA-HB-HC（過渡態(tài)）HB-HC + HA“鐵絲酶鐵絲酶”催化反應(yīng)的過渡態(tài)穩(wěn)定機(jī)制催化反應(yīng)的過渡態(tài)穩(wěn)定機(jī)制支持過渡態(tài)穩(wěn)定學(xué)說的證據(jù)支持過渡態(tài)穩(wěn)定學(xué)說的證據(jù) 根據(jù)過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的過渡態(tài)類似物可作為酶的強(qiáng)抑制劑，抑制效果遠(yuǎn)高于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。 利用過渡態(tài)類似物作為抗原或半抗原，去免疫動(dòng)物，由此產(chǎn)生的抗體可能有類似酶的催化作用。脯氨酸消旋酶的過渡態(tài)及其過渡態(tài)類似物抑制劑脯氨酸消旋酶的過渡態(tài)及其過渡態(tài)類似物抑制劑免疫動(dòng)物免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體產(chǎn)

3、生抗體水解水解抗抗體體酶酶可卡因可卡因催化可卡因水解的抗體酶的制備催化可卡因水解的抗體酶的制備過渡態(tài)穩(wěn)定的化學(xué)機(jī)制過渡態(tài)穩(wěn)定的化學(xué)機(jī)制與酶催化相關(guān)聯(lián)的過渡態(tài)穩(wěn)定是酶活性中心結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性以及活性中心與結(jié)合底物之間的相互作用的必然結(jié)果。酶充分使用一系列的化學(xué)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)過渡態(tài)的穩(wěn)定并由此加速反應(yīng)。它們包括：鄰近定向效應(yīng)廣義的酸堿催化靜電催化金屬催化共價(jià)催化底物形變鄰近定向效應(yīng)鄰近定向效應(yīng) 鄰近定向效應(yīng)是指兩種或兩種以上的底物（特別是雙底物）同時(shí)結(jié)合在酶活性中心上，相互靠近（鄰近）（鄰近） ，并采取正確的空間取向（定向）（定向） ，這樣大大提高了底物的有效濃度，使分子間反應(yīng)近似分子內(nèi)反應(yīng)從而加快了反應(yīng)

4、速度。 底物與活性中心的結(jié)合不僅使底物與酶催化基團(tuán)或其它底物接觸，而且強(qiáng)行“凍結(jié)”了底物的某些化學(xué)建的平動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，促使它們采取正確的方向，有利于鍵的形成。 廣義的酸堿催化廣義的酸堿催化 廣義的酸堿催化是指水分子以外的分子作為質(zhì)子供體或受體參與催化，這種機(jī)制參與絕大多數(shù)酶的催化。蛋白質(zhì)分子上的某些側(cè)鏈基團(tuán)（如Asp、Glu和His）可以提供質(zhì)子并將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到反應(yīng)的過渡態(tài)中間物而達(dá)到穩(wěn)定過渡態(tài)的效果。如果一個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)的pKa值接近7，那么該側(cè)鏈基團(tuán)就可能是最有效的廣義的酸堿催化劑。His殘基的咪唑基就是這樣的基團(tuán)，因此它作為很多酶的催化殘基。廣義的堿催化廣義的堿催化廣義的酸催化廣義的酸催化廣義的酸

5、、堿催化廣義的酸、堿催化pH 和緩沖溶液濃度對(duì)特定酸堿催化和廣義酸堿催化的影響和緩沖溶液濃度對(duì)特定酸堿催化和廣義酸堿催化的影響溶菌酶溶菌酶Glu35的廣義酸催化的廣義酸催化核糖核酸酶核糖核酸酶A A的廣義酸堿催化的廣義酸堿催化靜電催化靜電催化 活性中心電荷的分布可用來穩(wěn)定酶促反應(yīng)的過渡態(tài)，酶使用自身帶電基團(tuán)去中和一個(gè)反應(yīng)過渡態(tài)形成時(shí)產(chǎn)生的相反電荷而進(jìn)行的催化稱為靜電催化。 有時(shí)，酶通過與底物的靜電作用將底物引入到活性中心。溶菌酶溶菌酶Asp52的靜電催化的靜電催化Glu35和Asp52分別所起的廣義酸催化和靜電催化，解釋了溶菌酶的活性與pH之間的關(guān)系以及它的最適pHpH對(duì)溶菌酶活性的影響對(duì)溶菌

6、酶活性的影響金屬催化金屬催化近三分之一酶的活性需要金屬離子的存在，這些酶分為兩類，一類為金屬酶，另一類為金屬激活酶。前者含有緊密結(jié)合的金屬離子，多數(shù)為過渡金屬，如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+，后者與溶液中的金屬離子松散地結(jié)合，通常是堿金屬或堿土金屬，例如Na+、K+、Mg2+或Ca2+。金屬離子以5種方式參與催化：作為L(zhǎng)ewis酸起作用與底物結(jié)合，促進(jìn)底物在反應(yīng)中正確定向作為親電催化劑，穩(wěn)定過渡態(tài)中間物上的電荷通過價(jià)態(tài)的可逆變化，作為電子受體或電子供體參與氧化還原反應(yīng)酶結(jié)構(gòu)的一部分碳酸酐酶的金屬催化機(jī)制碳酸酐酶的金屬催化機(jī)制共價(jià)催化共價(jià)催化 共價(jià)催化是指酶在催化過

7、程中必須與底物上的某些基團(tuán)暫時(shí)形成不穩(wěn)定的共價(jià)中間物的一種催化方式。許多氨基酸殘基的側(cè)鏈可作為共價(jià)催化劑，例如Lys、His、Cys、Asp、Glu、Ser或Thr，此外，一些輔酶或輔基也可以作為共價(jià)催化劑，例如硫胺素焦磷酸（TPP）和磷酸吡哆醛。幾種酶的共價(jià)催化幾種酶的共價(jià)催化親核共價(jià)修飾反應(yīng)親核共價(jià)修飾反應(yīng)乙酰乙酸脫羧酶的親核催化乙酰乙酸脫羧酶的親核催化磷酸吡哆醛的親電催化磷酸吡哆醛的親電催化底物形變底物形變 底物形變是指當(dāng)酶與底物相遇時(shí)，酶分子誘導(dǎo)底物分子內(nèi)敏感鍵更加敏感，產(chǎn)生“電子張力”發(fā)生形變，比較接近它的過渡態(tài)。 溶菌酶也利用這種方式進(jìn)行催化：與溶菌酶活性中心結(jié)合的6碳糖在溶菌酶的

8、誘導(dǎo)下，從椅式構(gòu)象變成半椅式構(gòu)象而發(fā)生形變，周圍的糖苷鍵更容易發(fā)生斷裂。溶菌酶催化中的底物形變?nèi)芫复呋械牡孜镄巫僋HHHO CCHOOHCCH3COO-OHHNHHHCCOOHOCCH3COO-OHOCCH3COO-OHHNHHHCC+H蛋白酶的催化機(jī)制蛋白酶的催化機(jī)制 肽鍵水解在熱力學(xué)上是十分有利的，但若無蛋白酶的催化，1個(gè)肽鍵在中性pH和25條件下約需300600年的時(shí)間才能完成水解。 根據(jù)活性中心催化基團(tuán)的性質(zhì)，蛋白酶可分為四類：（1）絲氨酸蛋白酶此類蛋白酶的催化基團(tuán)包括1個(gè)不可缺少的Ser殘基，DIFP是它們的不可逆抑制劑；（2）金屬蛋白酶這類蛋白酶在活性中心結(jié)合有金屬離子，其活性

9、絕對(duì)需要金屬離子，故金屬離子螯合劑可導(dǎo)致活性的喪失；（3）天冬氨酸蛋白酶其催化基團(tuán)包括2個(gè)Asp，在偏堿性的pH下無活性；（4）巰基蛋白酶其催化基團(tuán)包括1個(gè)Cys的巰基，碘代乙酸為它們的不可逆抑制劑。 所有蛋白酶在催化中都經(jīng)歷四面體的過渡態(tài)，該過渡態(tài)形成的原因是反應(yīng)涉及一個(gè)親核基團(tuán)進(jìn)攻肽鍵的羰基碳。若是絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，進(jìn)攻的親核基團(tuán)分別是Ser殘基的羥基和Cys殘基的巰基，否則就是水分子。 絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶這類蛋白酶以一個(gè)特定的Ser殘基作為必需的催化基團(tuán)，屬于該家族成員的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、激肽釋放酶原、凝血酶、纖溶酶等。絲氨酸蛋白酶的催化機(jī)制

10、屬于共價(jià)催化和廣義酸堿催化的混合體，還有氧陰離子穴對(duì)過渡態(tài)的穩(wěn)定，由3個(gè)不變的Ser、His和Asp殘基構(gòu)成的催化三元體起主導(dǎo)作用，這3個(gè)氨基酸任何一種突變或修飾均可導(dǎo)致酶活性的喪失。構(gòu)成催化三元體的3個(gè)氨基酸在催化中的具體功能是：Ser195充當(dāng)進(jìn)攻底物的親核基團(tuán)His57作為廣義的酸堿催化劑Asp102 的功能僅僅是定向His57，影響His的 pKa，改變其酸堿性質(zhì)。胰蛋白酶具有很深的底物結(jié)合口袋，口袋的底部又是Asp，特別適合長(zhǎng)Lys和Arg的結(jié)合；糜蛋白酶的底物結(jié)合口袋沒有胰蛋白酶深，但比它寬，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，故特別適合芳香族氨基酸的結(jié)合；彈性蛋白酶的底物結(jié)合口袋非常淺，最適合結(jié)合側(cè)鏈較小的氨基酸。絲氨酸蛋白酶的催化三元體絲氨酸蛋白酶的催化三元體絲氨酸蛋白酶的作用機(jī)制絲氨酸蛋白酶的作用機(jī)制多肽底物絲氨酸蛋白酶的作用機(jī)制絲氨酸蛋白酶