第六章基因操作中大分子的分離和分析

1、第六章第六章 基因操作中大基因操作中大分子的分離和分析分子的分離和分析第一節(jié)第一節(jié) DNADNA的分離、檢測(cè)和純化的分離、檢測(cè)和純化分離純化核酸總的原則：分離純化核酸總的原則：應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性（完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性（完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求）是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求）排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染 。無其他核酸分子的污染（如抽提無其他核酸分子的污染（如抽提DNADNA分子時(shí)應(yīng)去除分子時(shí)應(yīng)去除RNARNA分子）。分子）。分離核酸應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：分離核酸應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：減少化學(xué)因素對(duì)核

2、酸的降解：酸、堿減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解：酸、堿減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械力減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械力防止核酸的生物降解：進(jìn)行核酸分離時(shí)最好新防止核酸的生物降解：進(jìn)行核酸分離時(shí)最好新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或應(yīng)將材料貯存于液氮中或-70-70冰箱中。冰箱中。1.1 DNA提取的步驟提取的步驟一、細(xì)胞破碎一、細(xì)胞破碎二、除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)二、除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)三、除去其他雜質(zhì)核酸三、除去其他雜質(zhì)核酸四、獲得四、獲得DNA樣品樣品一、細(xì)胞破碎一、細(xì)胞破碎 目前細(xì)胞破碎主要有目前細(xì)胞破碎主要

3、有物理破碎物理破碎（主要是機(jī)（主要是機(jī)械破碎）和械破碎）和非物理破碎非物理破碎（主要化學(xué)破碎和生物（主要化學(xué)破碎和生物酶解）酶解） （一）、物理破碎（一）、物理破碎 目前目前常用物理破碎的方法常用物理破碎的方法主要有：主要有：均質(zhì)珠子研磨均質(zhì)珠子研磨振蕩振蕩、液氮研磨液氮研磨、乳缽研磨乳缽研磨、凍融凍融、煮沸煮沸、超聲波超聲波(ultrasonication(ultrasonication) )和和微波加熱微波加熱(microwave heating)(microwave heating)等。等。1 1、微波加熱微波加熱對(duì)于革蘭氏陽性細(xì)菌非常有效，但是加熱對(duì)于革蘭氏陽性細(xì)菌非常有效，但是加熱必

4、須適中，否則必須適中，否則DNADNA可能被破壞?？赡鼙黄茐?。 2 2、熱激處理熱激處理包含包含冷凍冷凍和和融解融解兩步，兩步，冷凍冷凍主要是用液氮、主要是用液氮、冰箱冰箱( (7070、20)20)或冰，而或冰，而融解融解主要是主要是3737、5050、65 65 或或100100水浴，其中凍融循環(huán)次數(shù)和孵育水浴，其中凍融循環(huán)次數(shù)和孵育時(shí)間可以根據(jù)不同要求變化。時(shí)間可以根據(jù)不同要求變化。 如，如，Lee(1996)Lee(1996)等通過用吖啶橙染色直接統(tǒng)計(jì)經(jīng)三次等通過用吖啶橙染色直接統(tǒng)計(jì)經(jīng)三次熱激熱激 ( (70/65)70/65)聯(lián)合溶菌酶和聯(lián)合溶菌酶和SDSSDS處理后的細(xì)胞裂處理后的

5、細(xì)胞裂解率為解率為90%90%。 熱激處理比其他物理處理的剪切力要小很多，而且提熱激處理比其他物理處理的剪切力要小很多，而且提取效率、得到片段完整性較好。取效率、得到片段完整性較好。3 3、珠子打擊法珠子打擊法(bead beating) (bead beating) 加入不同直徑的玻璃珠，有利于不同細(xì)胞加入不同直徑的玻璃珠，有利于不同細(xì)胞DNADNA的提?。旱奶崛。?直徑為直徑為710 710 1180 m1180 m 玻璃珠可打碎土壤塊和植玻璃珠可打碎土壤塊和植物細(xì)胞；物細(xì)胞； 425 425600 m600 m 玻璃珠可打碎真菌、植物和其他真玻璃珠可打碎真菌、植物和其他真核細(xì)胞；核細(xì)胞；

6、 106 m 106 m 玻璃珠可打碎細(xì)菌細(xì)胞。玻璃珠可打碎細(xì)菌細(xì)胞。在使用玻璃珠研磨法時(shí)，應(yīng)在珠子大小和數(shù)量上具有在使用玻璃珠研磨法時(shí)，應(yīng)在珠子大小和數(shù)量上具有合適的配比，這樣才能有效地破碎和抽提微生物的營合適的配比，這樣才能有效地破碎和抽提微生物的營養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)生孢子或分生孢子的養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)生孢子或分生孢子的DNADNA。珠子打擊法優(yōu)點(diǎn)：珠子打擊法優(yōu)點(diǎn)：有有更好的裂解效率和產(chǎn)量更好的裂解效率和產(chǎn)量，而且其，而且其DNADNA產(chǎn)量隨著打擊時(shí)間和打擊速度的增加而增加，因產(chǎn)量隨著打擊時(shí)間和打擊速度的增加而增加，因此，可以用較小的抽提緩沖液體積處理較小的樣品得此，可以用較小的抽提緩沖液體積處理較小的樣

7、品得到滿意的獲得率。到滿意的獲得率。珠子打擊法缺點(diǎn)：珠子打擊法缺點(diǎn)：隨著打擊處理而增加產(chǎn)量的同時(shí)，隨著打擊處理而增加產(chǎn)量的同時(shí)，剪切力增大并導(dǎo)致小片段增加剪切力增大并導(dǎo)致小片段增加，從而影響，從而影響PCRPCR的敏感的敏感性，甚至可能增加嵌合體形成率而影響隨后的分子生性，甚至可能增加嵌合體形成率而影響隨后的分子生物學(xué)處理及結(jié)果，特別是引起多樣性分析的偏差。物學(xué)處理及結(jié)果，特別是引起多樣性分析的偏差。（二）非物理破碎法（二）非物理破碎法 非物理破碎法相對(duì)比較溫和，利于保持非物理破碎法相對(duì)比較溫和，利于保持DNADNA的完整性。其主要是包括的完整性。其主要是包括化學(xué)破碎化學(xué)破碎和和生物生物酶解酶

8、解。1、化學(xué)破碎、化學(xué)破碎 目前化學(xué)破碎法常用的化學(xué)試劑主要是陰目前化學(xué)破碎法常用的化學(xué)試劑主要是陰離子型去污劑離子型去污劑SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）、（十二烷基硫酸鈉）、SarkosylSarkosyl（N-N-十二烷基肌氨酸鈉）和陽離子型十二烷基肌氨酸鈉）和陽離子型去污劑去污劑CTABCTAB（十六烷基三乙基溴化銨）等。（十六烷基三乙基溴化銨）等。 2、生物酶解、生物酶解在生物酶解中最普遍使用的是在生物酶解中最普遍使用的是溶菌酶溶菌酶，其主要是通過水解，其主要是通過水解細(xì)胞壁而達(dá)到裂解細(xì)胞的目的，特別是對(duì)革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁而達(dá)到裂解細(xì)胞的目的，特別是對(duì)革蘭氏陽性菌的破碎，同時(shí)溶菌酶還

9、可以水解糖苷鍵和腐殖酸的化合鍵從破碎，同時(shí)溶菌酶還可以水解糖苷鍵和腐殖酸的化合鍵從而改善而改善DNADNA純度。純度。由于生物酶解比較溫和，故其常常還需要跟化學(xué)、物理等由于生物酶解比較溫和，故其常常還需要跟化學(xué)、物理等裂解方法聯(lián)合使用。裂解方法聯(lián)合使用。目前除了使用溶菌酶外，也有添加旨在提高革蘭氏陽性菌目前除了使用溶菌酶外，也有添加旨在提高革蘭氏陽性菌裂解的裂解的消色肽酶消色肽酶(achromopeptidase(achromopeptidase) )、消化蛋白的蛋白酶消化蛋白的蛋白酶K(proteinaseK(proteinase K) K)( (主要通過酶解膜蛋白來提高裂解細(xì)胞以主要通過酶

10、解膜蛋白來提高裂解細(xì)胞以及消化蛋白而有利于隨后的核酸分離純化及消化蛋白而有利于隨后的核酸分離純化) )以及在富含有以及在富含有機(jī)酸的樣品中有利于核酸釋放的機(jī)酸的樣品中有利于核酸釋放的鏈霉蛋白酶鏈霉蛋白酶(pronase(pronase) )等。等。n一般來說，單獨(dú)使用一種處理方法效果都不會(huì)一般來說，單獨(dú)使用一種處理方法效果都不會(huì)很好，而適當(dāng)?shù)慕M合可產(chǎn)生很好的效果。很好，而適當(dāng)?shù)慕M合可產(chǎn)生很好的效果。二、除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)二、除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)苯酚苯酚對(duì)蛋白質(zhì)有極強(qiáng)的變性作用，而對(duì)對(duì)蛋白質(zhì)有極強(qiáng)的變性作用，而對(duì)DNA無影響；無影響；氯仿氯仿也可使蛋白質(zhì)變性，對(duì)也可使蛋白質(zhì)變性

11、，對(duì)DNA無影響；無影響；蛋白酶蛋白酶可降解蛋白質(zhì)，故在實(shí)驗(yàn)中也常使用?？山到獾鞍踪|(zhì)，故在實(shí)驗(yàn)中也常使用。注：苯酚的殘留會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的分子操作，故用苯酚去除蛋白質(zhì)后注：苯酚的殘留會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的分子操作，故用苯酚去除蛋白質(zhì)后還需用氯仿還需用氯仿/異戊醇（異戊醇（24:1）抽提兩次，以去除殘留的蛋白質(zhì)和苯）抽提兩次，以去除殘留的蛋白質(zhì)和苯酚。酚。三、除去其他雜質(zhì)核酸三、除去其他雜質(zhì)核酸 在在DNADNA提取中會(huì)有少量的提取中會(huì)有少量的RNARNA雜質(zhì)殘留，但雜質(zhì)殘留，但RNARNA極易降解，一般情況下對(duì)后續(xù)的極易降解，一般情況下對(duì)后續(xù)的DNADNA操作無操作無大影響。如要求大影響。如要求DNA

12、DNA純度較高時(shí)可加入純度較高時(shí)可加入RNARNA酶酶（RNaseRNase）以降解）以降解RNARNA。四、獲得四、獲得DNA樣品樣品含含DNA的水相可用以下幾種沉淀劑沉淀：的水相可用以下幾種沉淀劑沉淀：a. 無水乙醇無水乙醇（最常用）：易于從（最常用）：易于從DNA沉淀中除去。但所需的沉淀中除去。但所需的體積大（體積大（2倍），由于使用的管多為倍），由于使用的管多為 一次性，比較浪費(fèi)。一次性，比較浪費(fèi)。b. 異丙醇異丙醇：能與自由水緊密結(jié)合。結(jié)合了溶解：能與自由水緊密結(jié)合。結(jié)合了溶解DNA的水分子，的水分子，使使 DNA沉淀?？沙爻恋?，離心，加入體積為沉淀?？沙爻恋?，離心，加入體積為0

13、.61倍體倍體積，但不易除去，需用積，但不易除去，需用70%酒精洗滌幾次，否則對(duì)后續(xù)分酒精洗滌幾次，否則對(duì)后續(xù)分子操作有影響。子操作有影響。異戊醇：幾乎不能與自由水結(jié)合，但可分異戊醇：幾乎不能與自由水結(jié)合，但可分離有機(jī)醇與溶液層，還可去氣泡，也可做去蛋白的輔助劑。離有機(jī)醇與溶液層，還可去氣泡，也可做去蛋白的輔助劑。c. PEG（聚乙二醇，分子量（聚乙二醇，分子量60008000）選擇性沉淀）選擇性沉淀：低濃：低濃度度PEG（如（如1%）選擇沉淀大分子）選擇沉淀大分子DNA，在構(gòu)建基因組文，在構(gòu)建基因組文庫則用低濃度庫則用低濃度PEG沉淀幾十沉淀幾十kb；高濃度；高濃度PEG（20%），），選擇

14、沉淀小分子，幾百選擇沉淀小分子，幾百bp。如：。如：PBR322 4.3kb 用用PEG 12%沉淀。沉淀。PEG選擇沉淀的分辨率達(dá)選擇沉淀的分辨率達(dá)100bp。沉淀時(shí)的注意事項(xiàng)：沉淀時(shí)的注意事項(xiàng)：（1 1）當(dāng)當(dāng)DNADNA分子量分子量1kb1kb或濃度較低或濃度較低,1g/ml,1kbDNA1kb，加入沉淀劑后再加入糖原，幾分鐘可，加入沉淀劑后再加入糖原，幾分鐘可完全；完全；（3 3）DNA200bpDNA1 mmol/L or EDTA10 mmol1 mmol/L or EDTA10 mmol/L/L，則，則用乙醇沉淀得不到用乙醇沉淀得不到 DNADNA，應(yīng)選其它方法沉淀，應(yīng)選其它方法沉

15、淀DNADNA。DNA樣品的貯存：樣品的貯存：44短期貯存短期貯存; ;-20-20長期貯存，冰上緩解凍（取時(shí)）；長期貯存，冰上緩解凍（取時(shí)）；也可將也可將DNADNA樣品以乙醇沉淀的形式保存在樣品以乙醇沉淀的形式保存在-20-20。Figure3.4 Preparation of a cell extract.Figure3.5 Removal of protein contaminants by phenol extraction. Figure3.6 Collecting DNA by ethanol precipitation .%兩種經(jīng)典的化學(xué)試劑提取法：兩種經(jīng)典的化學(xué)試劑提取法：

16、1 1、CTABCTAB法法 2 2、SDSSDS法法 CTAB CTAB法法（1 1）原理：）原理：nCTAB,CTAB,十六烷基三甲基溴化銨十六烷基三甲基溴化銨是一種去污劑，可是一種去污劑，可溶解細(xì)溶解細(xì)胞膜胞膜，它能，它能與核酸形成復(fù)合物與核酸形成復(fù)合物，在，在高鹽溶液高鹽溶液中（中（0.7 0.7 mol/L NaClmol/L NaCl）是）是可溶可溶的，當(dāng)?shù)?，?dāng)降低溶液鹽濃度降低溶液鹽濃度到一定到一定程度（程度（0.3 mol/L NaCl0.3 mol/L NaCl）時(shí)，）時(shí)，從溶液中沉淀從溶液中沉淀，通過，通過離心就可將離心就可將CTABCTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類與

17、核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開，然后將物質(zhì)分開，然后將CTABCTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTABCTAB能溶解于能溶解于乙醇。乙醇。（2）具體操作：）具體操作：在所需量的在所需量的CTABCTAB抽提液中加入抽提液中加入巰基乙醇，使終濃度達(dá)巰基乙醇，使終濃度達(dá)2 2（v/vv/v）。將此溶液預(yù)熱至）。將此溶液預(yù)熱至6565。對(duì)于每克新鮮的葉組。對(duì)于每克新鮮的葉組織大約需要織大約需要4ml4ml的的ME/CTABME/CTAB抽提液。抽提液。用液氮（用液氮（196196）或干冰（）或干冰（7878

18、）冷卻粉碎器）冷卻粉碎器/ /勻漿器，勻漿器，將將0.5 g0.5 g植物組織粉碎成細(xì)粉，然后將組織轉(zhuǎn)移到植物組織粉碎成細(xì)粉，然后將組織轉(zhuǎn)移到2.0 ml2.0 ml離心管。離心管。加入加入800 800 l l預(yù)熱的預(yù)熱的Me/CTABMe/CTAB，混合使之充分濕潤，于，混合使之充分濕潤，于6565溫育溫育20min20min，不時(shí)顛倒混勻。，不時(shí)顛倒混勻。待冷至室溫后，加入待冷至室溫后，加入800 800 l l氯仿氯仿/ /異戊醇（異戊醇（2424：1 1），顛倒），顛倒混勻至溶液呈乳濁狀（但不要振蕩）。混勻至溶液呈乳濁狀（但不要振蕩）。2525，10000 rpm10000 rpm離

19、心離心10 min10 min。上清（約上清（約700 700 l l）轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中，加入）轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中，加入5 5 l RNaseAl RNaseA貯液，貯液，3737溫育溫育30 min30 min。加入加入700 700 l l氯仿氯仿/ /異戊醇，顛倒混勻，異戊醇，顛倒混勻，2525，10000 10000 rpmrpm離心離心10 min10 min。上清（約上清（約600 600 l l）轉(zhuǎn)移至另一干凈的）轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5 ml1.5 ml離心管中，離心管中，加入加入600 600 l l異丙醇，顛倒混勻，室溫或異丙醇，顛倒混勻，室溫或-20-20放置

20、放置20 min20 min。 25 25，12000 rpm12000 rpm，離心，離心10 min10 min，收集沉淀。，收集沉淀。去上清，加去上清，加1ml70%1ml70%乙醇洗滌沉淀兩次（乙醇洗滌沉淀兩次（2525，12000 12000 rpmrpm，離心，離心10 min10 min）晾干晾干DNADNA，溶于，溶于50 50 l ddHl ddH2 2O O，44保存?zhèn)溆谩１４鎮(zhèn)溆?。? 3）優(yōu)缺點(diǎn)：）優(yōu)缺點(diǎn)： 能很好地去除糖類物質(zhì)；能很好地去除糖類物質(zhì)； 在提取的前期能同時(shí)得到高含量的在提取的前期能同時(shí)得到高含量的DNA及及RNA； 步驟多，復(fù)雜，提取的步驟多，復(fù)雜，提取

21、的DNA分子量比分子量比SDS法法小。小。（4 4）說明：）說明：巰基乙醇的作用巰基乙醇的作用：a. 是一種蛋白質(zhì)的輔助變性劑；是一種蛋白質(zhì)的輔助變性劑；b. 主要作還原劑，加入溶液中可防止整個(gè)溶液的氧主要作還原劑，加入溶液中可防止整個(gè)溶液的氧化，大大提高化，大大提高DNA得率。由于氣體（多酚類物質(zhì)）得率。由于氣體（多酚類物質(zhì)）刺鼻，通風(fēng)柜操作。刺鼻，通風(fēng)柜操作。 SDSSDS法法（1）原理）原理:n利用利用高濃度的高濃度的SDSSDS，在，在較高溫度較高溫度（55556565）條件下）條件下裂裂解細(xì)胞，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸解細(xì)胞，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸，然后采用，然后采用提高鹽提高鹽濃度及

22、降低溫度的做法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀濃度及降低溫度的做法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀（最（最常用的是加入常用的是加入5M5M的的KAcKAc于冰上保溫，在低溫條件下于冰上保溫，在低溫條件下KAcKAc與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物），離心除去沉淀后，與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物），離心除去沉淀后，上清液中的上清液中的DNADNA用酚用酚/ /氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的淀水相中的DNADNA。 （2）過程：過程：將將0.3 g0.3 g植物材料于液氮速凍，然后在研缽中將其磨碎，植物材料于液氮速凍，然后在研缽中將其磨碎，將粉末轉(zhuǎn)至將粉末轉(zhuǎn)至2 ml2 ml離心管中。離心

23、管中。加入加入1.2 ml1.2 ml預(yù)熱至預(yù)熱至6565的提取緩沖液（其中加入的提取緩沖液（其中加入3 l3 l 巰基乙醇，增加巰基乙醇，增加DNADNA的穩(wěn)定性），置的穩(wěn)定性），置6565水浴中放水浴中放置置3030分鐘，不時(shí)顛倒混勻。分鐘，不時(shí)顛倒混勻。加入加入0.45 ml 5M0.45 ml 5M的醋酸鉀，混勻，冰浴的醋酸鉀，混勻，冰浴2020分鐘，在分鐘，在10000 rpm10000 rpm離心離心20 min20 min。需要的話，用紗布過濾除去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入另一離需要的話，用紗布過濾除去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（加入等體積氯仿：異戊醇（2

24、424：1 1），輕輕顛倒混勻，），輕輕顛倒混勻，12000 rpm12000 rpm離心離心15 min15 min。 轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加5l RNaseA5l RNaseA貯液，貯液，3737溫育溫育30 min30 min。 加入等體積氯仿：異戊醇（加入等體積氯仿：異戊醇（2424：1 1），輕輕顛倒混勻，），輕輕顛倒混勻，12000 rpm12000 rpm離心離心15 min15 min。 轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加入轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加入0.7V0.7V異丙醇，異丙醇，輕輕顛倒混勻，輕輕顛倒混勻，-20-20放置放置3030分

25、鐘沉淀核酸。分鐘沉淀核酸。 25 25，12000 rpm12000 rpm，離心，離心10 min10 min，收集沉淀。，收集沉淀。 棄上清，棄上清，7070乙醇洗兩次。涼干乙醇洗兩次。涼干DNADNA，溶于，溶于50 50 l l ddH2OddH2O，44保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆?。? 3）與）與CTABCTAB法比較：法比較：SDSSDS法較溫和，對(duì)法較溫和，對(duì)DNADNA的切割不大，可獲得大分子量的的切割不大，可獲得大分子量的DNADNA。故該法可建立基因組文庫，多酚類物質(zhì)的材料。故該法可建立基因組文庫，多酚類物質(zhì)的材料適用。適用。該法極易造成該法極易造成SDS-DNASDS-DNA共沉

26、淀。共沉淀。對(duì)對(duì)SDSSDS質(zhì)量要求較高。質(zhì)量要求較高。稱取稱取SDSSDS時(shí)，動(dòng)作要緩慢，因時(shí)，動(dòng)作要緩慢，因SDSSDS易于形成微顆粒。溶易于形成微顆粒。溶解時(shí)，水應(yīng)沿壁使水輕緩流下，解時(shí)，水應(yīng)沿壁使水輕緩流下，5656助溶。助溶。 例1：水稻基因組DNA提取n取取3-5 g新鮮水稻葉片，用液氮速凍，在研缽中快速研成粉末狀，轉(zhuǎn)新鮮水稻葉片，用液氮速凍，在研缽中快速研成粉末狀，轉(zhuǎn)入入50 ml離心管中；離心管中；n立即加入立即加入20 ml預(yù)熱至預(yù)熱至65 的提取緩沖液，的提取緩沖液，65 水浴水浴30 min；n加入加入7.5 ml 5M醋酸鉀醋酸鉀，輕輕混勻，冰上放置，輕輕混勻，冰上放置

27、20 min，4000 rpm離心離心20 min。將上清轉(zhuǎn)入另一干凈的。將上清轉(zhuǎn)入另一干凈的50 ml離心管中；離心管中；n加入加入15 ml氯仿：異戊醇（氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，），輕輕顛倒混勻，4000 rpm離心離心20 min。將上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)干凈的。將上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)干凈的50 ml離心管中；離心管中；n加入加入15 ml冰預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，冰預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 放置放置30 min；n4000 rpm離心離心20 min，棄上清，用，棄上清，用20 ml 70 %的乙醇洗一遍，倒置的乙醇洗一遍，倒置離心管于干凈的濾紙，室溫晾干沉淀；離心管于

28、干凈的濾紙，室溫晾干沉淀；n將沉淀重懸于將沉淀重懸于0.6 ml TE緩沖液，加緩沖液，加10 l 10 mg/ml RNA酶，酶，37 保保溫溫10 min；n轉(zhuǎn)入干凈的轉(zhuǎn)入干凈的2 ml離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），），12000 rpm離心離心10 min；n將上清轉(zhuǎn)入一干凈的將上清轉(zhuǎn)入一干凈的2 ml離心管中，加入離心管中，加入1/10體積冰預(yù)冷的體積冰預(yù)冷的3 M醋酸醋酸鈉（鈉（pH 5.2），），2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇，倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇，12000 rpm離心離心30 min。棄上清，用棄上清，用70 %的

29、乙醇洗一遍，晾干后，容于的乙醇洗一遍，晾干后，容于500 l TE，保存于，保存于-20 備用。備用。例2：細(xì)菌DNA大量提取n吸取吸取1 ml 過夜培養(yǎng)的細(xì)菌于過夜培養(yǎng)的細(xì)菌于50 ml不加抗生素的不加抗生素的PSA中，中，28，200 rpm 過夜培養(yǎng)；過夜培養(yǎng)；n6000 rpm離心離心5分鐘，收集菌體；分鐘，收集菌體；n用用50 ml 冰冷的冰冷的1TE沖洗菌體兩次；沖洗菌體兩次；n將菌體重新打散，懸于將菌體重新打散，懸于20 ml 1TE中；中；n加入（加入（37預(yù)消化預(yù)消化1小時(shí)）的小時(shí)）的蛋白酶、蛋白酶、SDS使其終濃度分別為使其終濃度分別為625 g/ml(w/v)及及1.25

30、（w/v）, 冰浴冰浴45分鐘至有白色分鐘至有白色SDS析出；析出；n室溫放置室溫放置30分鐘，不時(shí)輕輕搖動(dòng)；分鐘，不時(shí)輕輕搖動(dòng)；n3%NaCl 飽和的苯酚、苯酚飽和的苯酚、苯酚/氯仿（氯仿（1:1,v/v）及氯仿各抽提一）及氯仿各抽提一次，收集上清于新的離心管；次，收集上清于新的離心管；n加入加入1/10 體積的體積的3M NaAc(pH4.8),再加等體積冰冷的異丙醇，再加等體積冰冷的異丙醇，混勻后置室溫混勻后置室溫30min ，待出現(xiàn)無色透明的白色絮狀，待出現(xiàn)無色透明的白色絮狀DNA，用，用Tip頭吸出，室溫干燥后溶于頭吸出，室溫干燥后溶于1xTE中；中；nDNA保存于保存于-20oC，

31、可長期保存。，可長期保存。 例例4 4：人類：人類DNADNA提取提取n親手提取自己的親手提取自己的DNAn 作為作為“紀(jì)念紀(jì)念DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)五十周年系列展覽雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)五十周年系列展覽”的的一部分，現(xiàn)場萃取一部分，現(xiàn)場萃取DNA制成掛件模型實(shí)驗(yàn)，昨天在北京王府制成掛件模型實(shí)驗(yàn)，昨天在北京王府井新東安廣場舉行。井新東安廣場舉行。 十幾名學(xué)生在英國老師斯蒂娜的指導(dǎo)下親手萃取了自己十幾名學(xué)生在英國老師斯蒂娜的指導(dǎo)下親手萃取了自己的絮狀的絮狀DNA，並制作成可愛的掛件，掛在脖子上。據(jù)悉，這，並制作成可愛的掛件，掛在脖子上。據(jù)悉，這次開放式實(shí)驗(yàn)活動(dòng)將持續(xù)到次開放式實(shí)驗(yàn)活動(dòng)將持續(xù)到3日。日。圖為

32、北京外國語大學(xué)學(xué)生小周看見自己的圖為北京外國語大學(xué)學(xué)生小周看見自己的DNA奇跡般地奇跡般地出現(xiàn)在試液中，驚奇不已。出現(xiàn)在試液中，驚奇不已。本報(bào)記者吳平本報(bào)記者吳平 張紅晉攝影報(bào)道張紅晉攝影報(bào)道 京華時(shí)報(bào)京華時(shí)報(bào)(2003年年10月月2日第日第2版版) 1.2 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取的提取1 1、堿裂解法、堿裂解法堿裂解法堿裂解法由由BirnboimBirnboim和和DolyDoly設(shè)計(jì)并于設(shè)計(jì)并于19791979年發(fā)表，基于染年發(fā)表，基于染色體色體DNADNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNADNA變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在在pHpH高達(dá)高達(dá)12.512.5的堿性條件下

33、，染色體的堿性條件下，染色體DNADNA的氫鍵斷裂，雙的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNADNA的大部分氫鍵也斷裂，但的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。當(dāng)以當(dāng)以pH4.6pH4.6的的KAcKAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pHpH至中性時(shí)，變性至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒的質(zhì)粒DNADNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體體DNADNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體通過離心，染色體DNADNA與不穩(wěn)定

34、的大分子與不穩(wěn)定的大分子RNARNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)- -SDSSDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去?；驹恚夯驹恚篎igure3.11 Plasmid purification by the alkaline denaturation method.三種溶液：三種溶液：溶液溶液I：50 mM葡萄糖葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA：pH 8.0；溶液溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液溶液III：3 M 醋酸鉀醋酸鉀 / 2 M 醋酸醋酸 提取步驟：提取步驟：堿抽提法所用試劑的生化作用堿抽提法所用試劑的生化作用

35、 n提取過程提取過程中所用的材料有：中所用的材料有：LBLB培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基、葡萄糖/Tris/Tris/EDTA/EDTA溶液溶液(5Ommol/L(5Ommol/L葡萄糖；葡萄糖；25mmol/L 25mmol/L TrisTris HClHCl；pH8.0pH8.0，lOmmollOmmol/L EDTA)/L EDTA)、TETE緩沖液、緩沖液、3mol/L3mol/L乙酸鉀溶液、乙酸鉀溶液、NaOHNaOH-SDS-SDS溶液、溶菌酶液、溶液、溶菌酶液、異丙醇、異丙醇、100%100%乙醇和乙醇和70%70%乙醇等。乙醇等。 溶菌酶溶菌酶: :溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體細(xì)溶菌酶

36、是糖苷水解酶，水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1-1，4 4糖糖苷鍵，因而具有溶菌作用。苷鍵，因而具有溶菌作用。 葡萄糖葡萄糖: :葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透壓，葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透壓，防止防止DNADNA受機(jī)械剪切力作用而降解。受機(jī)械剪切力作用而降解。 EDTA:EDTA:EDTAEDTA螯合螯合MgMg2+2+和和CaCa2+2+等金屬離子，抑等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNADNA的降解作用的降解作用, ,同時(shí)同時(shí)有利于溶菌酶的作用。有利于溶菌酶的作用。 NaOHNaOH-SDS-SDS液液: :NaOHNaOH濃度為濃

37、度為0.2 mol/L0.2 mol/L，加抽，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的提液時(shí)，該系統(tǒng)的pHpH就高達(dá)就高達(dá)12.612.6，因而促，因而促使染色體使染色體DNADNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNADNA的變性。的變性。nSDSSDS是離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞是離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而破壞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為白質(zhì)結(jié)合成為R-O-S0R-O-S03 3- -R R+ +一蛋白質(zhì)的復(fù)合一蛋白質(zhì)的復(fù)合物物, ,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來。使蛋白質(zhì)變性沉淀下來。KAcKAc:

38、: pH4.8pH4.8的的KAcKAc溶液是為了把溶液是為了把pHl2.6pHl2.6的抽的抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒DNADNA能夠復(fù)能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。性，并能穩(wěn)定存在。n高鹽：高鹽：3mol/L KAc3mol/L KAc有利于變性的大分子染有利于變性的大分子染色體色體DNADNA、RNARNA以及以及SDS-SDS-蛋白復(fù)合物的凝聚蛋白復(fù)合物的凝聚而沉淀。染色體而沉淀。染色體DNADNA因?yàn)橹泻土撕怂嵘系碾娨驗(yàn)橹泻土撕怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與荷，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNARNA、SDS-SDS-蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽形式

39、復(fù)蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。合物，使沉淀更完全。 無水乙醇無水乙醇: :沉淀沉淀DNADNA，它的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比例和水相混，它的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)溶，且乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNADNA很安全。很安全。DNADNA溶液是溶液是DNADNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去醇會(huì)奪去DNADNA周圍的水分子，使周圍的水分子，使DNADNA失水而易于聚合。失水而易于聚合。 酚酚- -氯仿氯仿: :酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)胺优c氯仿是非極性分子，水是極性分子，

40、當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子白水溶液與酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNADNA分分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。異戊醇異戊醇: :異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生。同

41、時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層泡沫的產(chǎn)生。同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。 2、通過試劑盒分離純化質(zhì)粒、通過試劑盒分離純化質(zhì)粒DNA 分離純化過程是通過一個(gè)簡單的結(jié)合洗滌洗脫程序來完成的。 優(yōu)點(diǎn)：該方法操作簡單，回收效率高，洗脫出來后的DNA可立即使用，無需濃縮、沉淀或脫鹽。 1.3 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳分離純化的分離純化的DNADNA是否真的存在、是否有降解現(xiàn)是否真的存在、是否有降解現(xiàn)象，以及象，以及DNADNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后其產(chǎn)物的經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后其產(chǎn)物的大小如何等都是

42、在基因操作中時(shí)刻面對(duì)的問題。大小如何等都是在基因操作中時(shí)刻面對(duì)的問題。目前最成熟的檢測(cè)目前最成熟的檢測(cè)DNADNA的技術(shù)就是瓊脂糖凝膠的技術(shù)就是瓊脂糖凝膠電泳。電泳。一、瓊脂糖的特點(diǎn)及凝膠電泳的原理一、瓊脂糖的特點(diǎn)及凝膠電泳的原理 瓊脂糖瓊脂糖是從海藻中提取出的一種線性多糖是從海藻中提取出的一種線性多糖聚合物。在高溫水溶液中會(huì)溶解，在常溫下凝聚合物。在高溫水溶液中會(huì)溶解，在常溫下凝固并形成一定大小孔徑的惰性介質(zhì)。在電場的固并形成一定大小孔徑的惰性介質(zhì)。在電場的作用下，作用下，DNADNA可在孔洞中遷移。可在孔洞中遷移。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖為支持物，在適當(dāng)是以瓊脂糖為支持物，在

43、適當(dāng)條件下對(duì)帶電生物大分子進(jìn)行電泳的技術(shù)。主條件下對(duì)帶電生物大分子進(jìn)行電泳的技術(shù)。主要用于要用于DNADNA分子的分離、純化和鑒定。分子的分離、純化和鑒定。瓊脂糖凝膠電泳的原理：瓊脂糖凝膠電泳的原理：DNADNA分子在溶液中帶分子在溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)，由于負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)，由于DNADNA分子分子的分子質(zhì)量差別，電泳后不同大小的的分子質(zhì)量差別，電泳后不同大小的DNADNA分子分子呈現(xiàn)遷移位置的差異，把已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)呈現(xiàn)遷移位置的差異，把已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)DNADNA與待測(cè)與待測(cè)DNADNA同時(shí)電泳，比較兩者在凝膠板上同時(shí)電泳，比較兩者在凝膠板上所呈現(xiàn)的區(qū)帶，就可以

44、鑒定出待測(cè)所呈現(xiàn)的區(qū)帶，就可以鑒定出待測(cè)DNADNA的大小。的大小。二、瓊脂糖凝膠電泳基本操作步驟二、瓊脂糖凝膠電泳基本操作步驟 在瓊脂糖中加入電泳緩沖液在瓊脂糖中加入電泳緩沖液微波加熱溶解微波加熱溶解溫溫度降至度降至6060左右時(shí)，加入電泳染料左右時(shí)，加入電泳染料混勻后倒入凝混勻后倒入凝膠槽膠槽待凝膠完全凝結(jié)后，小心拔去梳子待凝膠完全凝結(jié)后，小心拔去梳子放入電放入電泳槽中，倒入電泳緩沖液，緩沖液高過凝膠面泳槽中，倒入電泳緩沖液，緩沖液高過凝膠面0.5cm 0.5cm 點(diǎn)樣點(diǎn)樣根據(jù)需要設(shè)置電泳電壓和時(shí)間，開始電泳根據(jù)需要設(shè)置電泳電壓和時(shí)間，開始電泳電泳結(jié)束后在凝膠成像儀上觀察、照相電泳結(jié)束后在

45、凝膠成像儀上觀察、照相進(jìn)一步進(jìn)一步分析。分析。瓊脂糖凝膠電泳的操作過程瓊脂糖凝膠電泳的操作過程染色體染色體DNADNA瓊脂糖電泳圖譜瓊脂糖電泳圖譜電泳結(jié)果分析：電泳結(jié)果分析： 0.8%0.8%的瓊脂糖凝膠，應(yīng)呈現(xiàn)一條清晰帶。的瓊脂糖凝膠，應(yīng)呈現(xiàn)一條清晰帶。若呈長帶狀彌散熒光則表明若呈長帶狀彌散熒光則表明DNADNA降解降解, ,原因可能有：原因可能有： 是否滅菌器皿及試劑；是否滅菌器皿及試劑； 材料收集是否立即冷凍，材料收集是否立即冷凍，研磨（后）提取是否融化；研磨（后）提取是否融化； 是否劇烈振動(dòng)，吸管是否劇烈振動(dòng)，吸管口過窄，產(chǎn)生氣泡。反復(fù)吸打及凍融等問題?？谶^窄，產(chǎn)生氣泡。反復(fù)吸打及凍融

46、等問題。若在溴酚藍(lán)處出現(xiàn)明亮的熒光，則有若在溴酚藍(lán)處出現(xiàn)明亮的熒光，則有RNARNA，可用，可用RNaseRNase消化。消化后用氯仿抽提，乙醇沉淀方法純化。消化。消化后用氯仿抽提，乙醇沉淀方法純化。若在樣品槽內(nèi)有熒光出現(xiàn)，可能樣品中若在樣品槽內(nèi)有熒光出現(xiàn)，可能樣品中DNADNA未完全溶未完全溶解或濃度過高，或樣品不純，可能是大量帶正電荷的解或濃度過高，或樣品不純，可能是大量帶正電荷的雜質(zhì)與雜質(zhì)與DNADNA樣品結(jié)合。樣品結(jié)合。 凝膠類型及濃度凝膠類型及濃度 分離分離DNA片段的大小范圍（片段的大小范圍（bp） 0.3%瓊脂糖50000 10000.7%瓊脂糖20000 10001.4%瓊脂糖

47、6000 3004.0%聚丙烯酰胺1000 10010.0%聚丙烯酰胺500 2520.0%聚丙烯酰胺 50 1 三、瓊脂糖凝膠電泳的影響因素三、瓊脂糖凝膠電泳的影響因素1 1、凝膠濃度、凝膠濃度 凝膠濃度的選擇取決于凝膠濃度的選擇取決于DNADNA分子的大小。具體的濃分子的大小。具體的濃度及分離度及分離DNADNA片段的大小范圍如下表。片段的大小范圍如下表。 2 2、DNADNA分子的大小和構(gòu)象分子的大小和構(gòu)象線狀雙鏈線狀雙鏈DNADNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠上電分子在一定濃度瓊脂糖凝膠上電泳距離與泳距離與DNADNA的分子質(zhì)量對(duì)數(shù)成反比。的分子質(zhì)量對(duì)數(shù)成反比。但當(dāng)?shù)?dāng)DNADNA分子處于

48、不同構(gòu)象時(shí)，它在電場中移分子處于不同構(gòu)象時(shí)，它在電場中移動(dòng)距離不僅和分子質(zhì)量有關(guān)，還和它本身構(gòu)象動(dòng)距離不僅和分子質(zhì)量有關(guān)，還和它本身構(gòu)象有關(guān)。有相同分子質(zhì)量的線狀有關(guān)。有相同分子質(zhì)量的線狀DNADNA開環(huán)狀開環(huán)狀DNADNA超螺旋超螺旋DNADNA。3 3、電泳緩沖液、電泳緩沖液目前目前常用的緩沖液常用的緩沖液有有TAETAE（40 mol/L Tris40 mol/L Tris- -乙乙酸、酸、1 mmol1 mmol/L EDTA/L EDTA）和）和TBETBE（90 mmol90 mmol/L /L 硼酸、硼酸、1 mmol1 mmol/L EDTA/L EDTA）。）。TAETAE緩

49、沖液的緩沖能力較低，適用于低電壓長緩沖液的緩沖能力較低，適用于低電壓長時(shí)間電泳；時(shí)間電泳；TBETBE有較強(qiáng)的緩沖能力，是比較通有較強(qiáng)的緩沖能力，是比較通用的緩沖液。用的緩沖液。4 4、指示劑、指示劑 電泳過程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示電泳過程中，常使用一種有顏色的標(biāo)記物以指示樣品的遷移過程。目前常用的核酸電泳指示劑是溴酚樣品的遷移過程。目前常用的核酸電泳指示劑是溴酚藍(lán)，呈藍(lán)紫色。藍(lán)，呈藍(lán)紫色。5 5、染色、染色溴化乙錠溴化乙錠（ethidium bromide, EB）可很好地?fù)饺氲诫p鏈）可很好地?fù)饺氲诫p鏈DNA中，中，在紫外光的激發(fā)下會(huì)呈現(xiàn)橙紅色的熒光，便于鑒定，可用于對(duì)在紫外光的

50、激發(fā)下會(huì)呈現(xiàn)橙紅色的熒光，便于鑒定，可用于對(duì)DNA進(jìn)行染色和觀察。進(jìn)行染色和觀察。 SYBR Green I : 新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價(jià)格較新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價(jià)格較EB貴。貴。 強(qiáng)烈誘變劑強(qiáng)烈誘變劑1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）可很好的分辨）可很好的分辨100bp-1kb100bp-1kb大小的核酸分子。對(duì)單鏈大小的核酸分子。對(duì)單鏈DNADNA來說，其分辨來說，其分辨率可達(dá)率可達(dá)1bp1bp，這種分辨能力在，這種分辨能力在DNADNA序列測(cè)定中發(fā)揮了重序列測(cè)定中發(fā)揮了重要作用。要作用。

51、特點(diǎn)特點(diǎn)：分辨率高；載樣量大；回收：分辨率高；載樣量大；回收DNADNA純度高；純度高；適于寡聚核苷酸及適于寡聚核苷酸及DNADNA序列分析，序列分析，DNA500bpDNA4000kb。DNA分子的遷分子的遷移方向隨所用電場方向的周期性變化而不斷改變?？梢品较螂S所用電場方向的周期性變化而不斷改變?？沙晒Ψ蛛x到分子量高達(dá)成功分離到分子量高達(dá)107bp的的DNA大分子。大分子。 脈沖場凝膠電泳實(shí)際上是一種交替變化電場方向的電脈沖場凝膠電泳實(shí)際上是一種交替變化電場方向的電泳，以一定的角度并以一定的時(shí)間變換電場方向，使泳，以一定的角度并以一定的時(shí)間變換電場方向，使DNADNA分子在微觀上按分子在微觀

52、上按“Z”Z”字形向前泳動(dòng)，從而到達(dá)分字形向前泳動(dòng)，從而到達(dá)分離大分子離大分子DNADNA的目的。的目的。與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，這項(xiàng)技術(shù)與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，這項(xiàng)技術(shù)采用采用定時(shí)改變電場方向的交變電源定時(shí)改變電場方向的交變電源，每次電流方向改變后，每次電流方向改變后持續(xù)持續(xù)1 1秒到秒到5 5分鐘左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循分鐘左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場。環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場。脈沖場凝膠電泳的工作方式脈沖場凝膠電泳的工作方式：橫向交變電泳（：橫向交變電泳（TAFETAFE）、）、場翻轉(zhuǎn)凝膠電泳（場翻轉(zhuǎn)凝膠電泳（FIGEFIG

53、E）、旋轉(zhuǎn)凝膠電泳和箝位勻場）、旋轉(zhuǎn)凝膠電泳和箝位勻場電泳（電泳（CHEFCHEF）。其中使用最廣泛的是）。其中使用最廣泛的是CHEFCHEF。+- - -2 2脈沖電泳槽電泳儀冷凝器真空泵BIio-RadBIio-Rad公司公司CHEF-DRCHEF-DR脈沖電泳儀脈沖電泳儀影響脈沖場凝膠電泳的因素影響脈沖場凝膠電泳的因素：脈沖時(shí)間、分子：脈沖時(shí)間、分子大小、電場強(qiáng)度、溫度和電場間角度。大小、電場強(qiáng)度、溫度和電場間角度。若分子重新定向時(shí)間和脈沖時(shí)間的比值在若分子重新定向時(shí)間和脈沖時(shí)間的比值在0.1-0.1-1 1之間，對(duì)較長的之間，對(duì)較長的DNADNA片段的分離具有最佳的分片段的分離具有最佳

54、的分辨率。辨率。1.6 DNA片段的純化片段的純化1、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法 瓊脂糖總體上可分為兩類：普通瓊脂糖和瓊脂糖總體上可分為兩類：普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)（低熔點(diǎn)（LMP ）瓊脂糖。）瓊脂糖。 LMPLMP瓊脂糖的熔點(diǎn)為瓊脂糖的熔點(diǎn)為62-6562-65，其一旦溶，其一旦溶解，便可在解，便可在3737持續(xù)保持液體狀態(tài)達(dá)數(shù)小時(shí)，持續(xù)保持液體狀態(tài)達(dá)數(shù)小時(shí)，而在而在2525下也可持續(xù)保持液體狀態(tài)約下也可持續(xù)保持液體狀態(tài)約10 min10 min。純化步驟純化步驟：用：用LMPLMP瓊脂糖凝膠分離特定的瓊脂糖凝膠分離特定的DNADNA片段片段切切割帶有目的割帶有目的DNADN

55、A的瓊脂糖凝膠塊的瓊脂糖凝膠塊加入適量緩沖液加入適量緩沖液加熱到加熱到6060使凝膠溶化，使凝膠溶化，DNADNA進(jìn)入水溶液中進(jìn)入水溶液中通過苯通過苯酚酚/ /氯仿抽提和乙醇沉淀氯仿抽提和乙醇沉淀獲得純化的獲得純化的DNADNA片段。片段。（這（這是經(jīng)典的是經(jīng)典的DNADNA片段回收方法，現(xiàn)在一般比較少用。）片段回收方法，現(xiàn)在一般比較少用。）其在回收大片段其在回收大片段DNADNA時(shí)仍是一個(gè)比較好的辦法，在回時(shí)仍是一個(gè)比較好的辦法，在回收大片段收大片段DNADNA時(shí)在加熱融化后常用瓊脂糖酶水解瓊脂時(shí)在加熱融化后常用瓊脂糖酶水解瓊脂糖，從而減少殘留的雜質(zhì)，提高回收效率。糖，從而減少殘留的雜質(zhì)，提

56、高回收效率。2、透析袋電洗脫法、透析袋電洗脫法 純化步驟純化步驟：將含有目的：將含有目的DNADNA片段的瓊脂糖凝膠塊切割下來片段的瓊脂糖凝膠塊切割下來放在透析袋中放在透析袋中置于電泳緩沖液中電泳置于電泳緩沖液中電泳DNADNA分子在電場作分子在電場作用下從凝膠塊中游離出來，貼在透析袋內(nèi)壁上用下從凝膠塊中游離出來，貼在透析袋內(nèi)壁上取出凝膠塊取出凝膠塊更換新鮮緩沖液，反向電泳，使更換新鮮緩沖液，反向電泳，使DNADNA游離于緩沖液中游離于緩沖液中取取出含出含DNADNA的緩沖液的緩沖液通過苯酚通過苯酚/ /氯仿抽提和乙醇沉淀氯仿抽提和乙醇沉淀獲得純獲得純化的化的DNADNA分子。分子。 透析袋電

57、洗脫法現(xiàn)在多用來純化相對(duì)分子量較大的透析袋電洗脫法現(xiàn)在多用來純化相對(duì)分子量較大的DNADNA片片段。段。 3、Glass Milk （bead）結(jié)合法）結(jié)合法該方法涉及兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)：該方法涉及兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)： 瓊脂糖凝膠在瓊脂糖凝膠在3 3倍體積的倍體積的3 3 mol/L NaImol/L NaI 溶液作用下與溶液作用下與5555會(huì)溶化，從而使會(huì)溶化，從而使DNADNA釋放到水釋放到水溶液中；溶液中； 在這樣的高鹽濃度下有一種硅粒（在這樣的高鹽濃度下有一種硅粒（glass beadglass bead，硅的細(xì)微顆粒，其水溶液呈牛奶狀，故也成為玻璃奶，硅的細(xì)微顆粒，其水溶液呈牛奶狀，故也成為玻璃

58、奶，glass milkglass milk）可特異性吸附）可特異性吸附DNADNA。當(dāng)硅粒吸附當(dāng)硅粒吸附DNADNA后，通過離心的方法很容易對(duì)硅粒進(jìn)行洗滌，后，通過離心的方法很容易對(duì)硅粒進(jìn)行洗滌，然后用水或低鹽緩沖液可從硅粒中將吸附的然后用水或低鹽緩沖液可從硅粒中將吸附的DNADNA洗脫出來。洗脫出來。該方法操作簡便，回收效率高，易于推廣。但回收的該方法操作簡便，回收效率高，易于推廣。但回收的DNADNA片片段一般不超過段一般不超過10kb10kb，否則回收效率低。，否則回收效率低。 4、純化試劑盒純化、純化試劑盒純化DNA 目前已有純化各類目前已有純化各類DNA的商品試劑盒，大部分都是使的

59、商品試劑盒，大部分都是使用帶硅膠膜的純化柱吸附用帶硅膠膜的純化柱吸附DNA，再經(jīng)過洗滌、洗脫步，再經(jīng)過洗滌、洗脫步驟得到純化的驟得到純化的DNA。該方法操作簡便快速，且純化效果好。但其只對(duì)小于該方法操作簡便快速，且純化效果好。但其只對(duì)小于10kb的的DNA片段有好的純化效果，且價(jià)格相對(duì)于其片段有好的純化效果，且價(jià)格相對(duì)于其他方法較昂貴。（目前也有一些公司開發(fā)出可以純化他方法較昂貴。（目前也有一些公司開發(fā)出可以純化20kb DNA的純化試劑盒，有些還可純化回收到的純化試劑盒，有些還可純化回收到50kb左右的左右的DNA片段）片段）1.7 DNA或或RNA的紫外分光光度法測(cè)定純度的紫外分光光度法測(cè)

60、定純度 定量測(cè)定定量測(cè)定DNADNA或或RNARNA時(shí)需要讀取時(shí)需要讀取260nm260nm和和280nm280nm兩個(gè)波兩個(gè)波長下的讀數(shù)。根據(jù)長下的讀數(shù)。根據(jù)260nm260nm處的讀數(shù)可計(jì)算出樣品中處的讀數(shù)可計(jì)算出樣品中核酸的濃度，核酸的濃度，1 1個(gè)個(gè)ODOD值相當(dāng)于約值相當(dāng)于約50 50 g/ml g/ml 雙鏈雙鏈DNADNA、40 40 g/mlg/ml單鏈單鏈DNADNA和和RNARNA及及33 33 g/mlg/ml單鏈寡核苷酸。單鏈寡核苷酸。利用利用OD260OD260和和OD280OD280的比值可計(jì)算出核酸的純度，的比值可計(jì)算出核酸的純度，DNADNA的純制品的純制品OD