mRNA差別顯示技術

1、生工生工1班班楊金鑫楊金鑫主要內容主要內容 概述概述 定義及原理定義及原理 應用及優(yōu)缺點應用及優(yōu)缺點 展望展望 高等生物大約有高等生物大約有35 35 萬萬個不同的基因，在每一個正常的個不同的基因，在每一個正常的體細胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細胞體細胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細胞中僅有中僅有10%20%10%20%的少部分基因被的少部分基因被，這種選擇性表，這種選擇性表達是在發(fā)育過程中細胞分化的根本原因，是調控細胞生命達是在發(fā)育過程中細胞分化的根本原因，是調控細胞生命活動過程的核心機制。因此，比較不同組織之間，或相同活動過程的核心機制。因此，比較不同組織之間，或

2、相同組織在不同生理條件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的組織在不同生理條件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因基因表達差異表達差異，可分離并克隆出這些特異性表達的基因。近年，可分離并克隆出這些特異性表達的基因。近年來，該領域的研究取得了很大進展，來，該領域的研究取得了很大進展， 扣除雜交扣除雜交（subtractive hybridization, SHsubtractive hybridization, SH）、）、基因芯片技術基因芯片技術（DNA chip techniqueDNA chip technique）、）、基因表達的系統(tǒng)分析基因表達的系統(tǒng)分析(serial (serial analysi

3、s of gene expression, SAGE)analysis of gene expression, SAGE)、噬菌體全套抗體噬菌體全套抗體庫技術庫技術(phage display antibody repertoire library (phage display antibody repertoire library technique)technique)和和雙向電泳技術雙向電泳技術(two-dimensional gel (two-dimensional gel electrophoresis)electrophoresis)先后成功地建立。先后成功地建立。一一. 概述概述

4、 基因表達調控的一種方基因表達調控的一種方式。指在對信號或誘導物做式。指在對信號或誘導物做出應答時，選擇出應答時，選擇表達不同的表達不同的基因基因，或使，或使基因的表達水平基因的表達水平有所不同。有所不同。DD的發(fā)明及其基礎的發(fā)明及其基礎 由由LiangLiang于于19921992年創(chuàng)立年創(chuàng)立 是是分離差異表達基因分離差異表達基因強有力的工具強有力的工具 在隨后幾年里，在隨后幾年里， LiangLiang等在技術方面做等在技術方面做了大量改進，使技術更適用、更簡便了大量改進，使技術更適用、更簡便 基于基于RT-PCRRT-PCR理論，依賴于理論，依賴于3 3種種技術技術 1 1）RT-PCR

5、RT-PCR技術技術 2 2）以特定引物進行的）以特定引物進行的PCRPCR技術技術 3 3）DNADNA電泳技術電泳技術 二二.基本概念基本概念 mRNAmRNA差別顯示技術也稱為差別顯示技術也稱為差示反差示反轉錄轉錄PCRPCR（Differential Display of Differential Display of reverse Transcriptional PCRreverse Transcriptional PCR）簡）簡稱為稱為ddRT-PCRddRT-PCR。它是將。它是將mRNAmRNA反轉錄技反轉錄技術術與與PCRPCR技術技術二者相互結合發(fā)展起來二者相互結合發(fā)展起

6、來的一種的一種RNARNA指紋圖譜技術指紋圖譜技術。目前已廣。目前已廣泛應用于分離鑒定組織特異性表達的泛應用于分離鑒定組織特異性表達的基因?；?。 反轉錄反轉錄PCRPCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reverse Transcription-Polymerase Chain ReactionReaction，RT-PCRRT-PCR）又稱為）又稱為逆轉錄逆轉錄PCRPCR。其原理是：提取組織。其原理是：提取組織或細胞中的總或細胞中的總RNARNA，以其中的，以其中的mRNAmRNA作為模板作為模板，采用，采用Oligo(dT)Oligo(d

7、T)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNAcDNA。再以。再以cDNAcDNA為模板進為模板進行行PCRPCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCRRT-PCR使使RNARNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNARNA樣品分樣品分析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成目的基因、合成cDNAcDNA探針、構建探針、構建RNARNA高效轉錄系統(tǒng)。高效轉錄系統(tǒng)。 RT- PCRRT- PC

8、R（Reverse Transcription-Polymerase Chain ReactionReverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即）即逆轉錄逆轉錄PCRPCR，是將，是將RNARNA的逆轉錄（的逆轉錄（RTRT）和）和cDNAcDNA的聚合酶鏈式擴的聚合酶鏈式擴增反應（增反應（PCRPCR）相結合的技術。）相結合的技術。RT-PCRRT-PCR技術靈敏而且用途廣泛技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞，可用于檢測細胞/ /組織中基因表達水平，細胞中組織中基因表達水平，細胞中RNARNA病毒的病毒的含量和直接克隆特定基因的含量和直接

9、克隆特定基因的cDNAcDNA序列等。序列等。 反轉錄反轉錄PCRRNARNA指紋指紋 RNA RNA 首先在逆首先在逆轉錄酶的作用下使轉錄酶的作用下使RNA RNA 逆轉錄為逆轉錄為DNADNA，之后以其之后以其DNA DNA 為模板，為模板，通過以通過以技術技術建立建立進行分進行分析。析。 某些某些DNADNA序列的差異序列的差異可通過可通過限制性酶切片段限制性酶切片段長長度的改變反映出來，此即度的改變反映出來，此即限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性。其主要原因是由。其主要原因是由于于DNADNA序列個別堿基的突序列個別堿基的突變而引起某個限制性內切變而引起某個限制性內切酶識別位點的

10、獲得或丟失，酶識別位點的獲得或丟失，表現(xiàn)為不同長度的酶切片表現(xiàn)為不同長度的酶切片段段水稻品種水稻品種DNADNA指紋指紋基本原理基本原理 利用所有真核基因的利用所有真核基因的mRNA mRNA 的的33端都有一段端都有一段多聚多聚腺苷酸腺苷酸poly(A)poly(A)尾結構的特點，將不同來源的總尾結構的特點，將不同來源的總mRNAmRNA反反轉錄合成轉錄合成cDNAcDNA, ,此此cDNA cDNA 合成是采用合成是采用oligo(dT)12MN oligo(dT)12MN 為為引物，其中引物，其中M M為為A,C,GA,C,G中的任意一種，中的任意一種，N N為為A,C,G A,C,G

11、或或T T 中中的任意一種，共有的任意一種，共有12 12 種種，其中，其中可增大引物的可增大引物的TmTm值，值，對，對反轉錄進行分類。用這反轉錄進行分類。用這12 12 種引物分別對同一總種引物分別對同一總mRNA mRNA 樣品樣品，即進行，即進行12 12 次不同的反轉錄反應次不同的反轉錄反應，得到，得到1212種類型的種類型的cDNAcDNA，從而也將總，從而也將總mRNAmRNA分為分為12 12 個亞個亞群。在此基礎上對每一類群。在此基礎上對每一類cDNAcDNA進行隨機引物和相應的進行隨機引物和相應的反轉錄引物反轉錄引物，由于擴增的，由于擴增的cDNAcDNA片段被放射性同片段

12、被放射性同位素標記，因而利用位素標記，因而利用放射自顯影技術放射自顯影技術通過對不同組織通過對不同組織樣品的同一類樣品的同一類cDNA cDNA 的的PCR PCR 選擇性擴增產物進行選擇性擴增產物進行凝膠電凝膠電泳分析泳分析，從而，從而反映出不同樣品間基因的時間和空間上反映出不同樣品間基因的時間和空間上的組織特異性的表達。的組織特異性的表達。 基本原理是，幾乎所有的真核基因基本原理是，幾乎所有的真核基因mRNAmRNA分子的分子的3-3-末端，末端，都帶有一個多聚的腺苷酸結構，即通常所說的都帶有一個多聚的腺苷酸結構，即通常所說的poly(A)poly(A)尾巴尾巴。因此，在因此，在RNARN

13、A聚合酶的作用下，可按聚合酶的作用下，可按mRNAmRNA為模板，以為模板，以oligo(dT)oligo(dT)為引物合成出為引物合成出cDNAcDNA拷貝拷貝。根據(jù)。根據(jù)mRNAmRNA分子分子3-3-末端末端序列末端結構的分析可以看到，在這段序列末端結構的分析可以看到，在這段poly(A)poly(A)序列起點堿序列起點堿基之前的一個堿基，除了為基之前的一個堿基，除了為A A的情況之外，只能有的情況之外，只能有C C、G G、T T三三種可能。根據(jù)這種序列結構特征，種可能。根據(jù)這種序列結構特征，P. PengP. Peng等人設計合成三等人設計合成三種不同的種不同的下游引物下游引物，它由

14、，它由1111個或個或1212個連續(xù)的脫氧核苷酸加上個連續(xù)的脫氧核苷酸加上一個一個3-3-末端錨定脫氧核苷酸組成，用末端錨定脫氧核苷酸組成，用5-T11G5-T11G、5-T11C5-T11C、5-T11A5-T11A表示，這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都表示，這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總將能夠把總mRNAmRNA群體的群體的1/31/3分子反轉錄成分子反轉錄成mRNA-cDNAmRNA-cDNA雜交分子。雜交分子。于是，采用這三種引物，可以將整個于是，采用這三種引物，可以將整個mRNAmRNA群體在群體在cDNAcDNA水平上水平上分成三個亞群體。然后用一個分成三個

15、亞群體。然后用一個上游的隨機引物上游的隨機引物和與反轉錄時和與反轉錄時相同的相同的oligo(dT)oligo(dT)引物對這個亞群體進行擴引物對這個亞群體進行擴增，因為這個上游的引物將隨機結合在增，因為這個上游的引物將隨機結合在cDNAcDNA上上 , ,因此因此來自不來自不同的擴增產物的大小是不同同的擴增產物的大小是不同的，可以在測序膠上明的，可以在測序膠上明顯分辨開來，從而篩選出不同樣品間基因差異表達的顯分辨開來，從而篩選出不同樣品間基因差異表達的DNADNA片片段。段。5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 Poly(A) RNA5 T12MN 3錨定引物錨定引物逆轉錄逆轉錄5

16、MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5變性變性5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5退火退火5 T12MN 3錨定引物錨定引物寡核苷酸隨機引物寡核苷酸隨機引物3M N TTTTTTTTTTTT 5延長延長dNTP、Taq聚合酶聚合酶3M N TTTTTTTTTTTT 55MNAAAAAAAAAAA 3變性、退火、延伸變性、退火、延伸電泳電泳顯示顯示T12MN(M為為A、G、C，N為為A、T、G、C) 啟動啟動cDNA第一鏈合成第一鏈合成不同長度的不同長度的PCR產物產物回收差異條帶，再擴增，回收差異條帶，再擴增

17、，克隆測序，同源比對克隆測序，同源比對隨機結合到隨機結合到cDNA鏈上鏈上(1) 提取總提取總RNA，在這個步驟中注意不能有，在這個步驟中注意不能有DNA污染，一般用無污染，一般用無RNA酶酶的的DNA酶在酶在37下處理下處理30 min；(2)在逆轉錄酶作用下，以在逆轉錄酶作用下，以Oligo T11MN 為引物為引物(M為為G、A、C中的任一中的任一種，種，N為為A、C、G、T任一種任一種)，進行逆轉錄；，進行逆轉錄；(3)PCR反應，擴增反應，擴增cDNA的第一條鏈；的第一條鏈；(4)擴增后的擴增后的cDNA進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使差異表達的進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使差異表達的cDNA

18、片段片段在在6%測序膠上分開；測序膠上分開；(5)找出不同處理間差異顯示的條帶，從膠上切割下來，并回收，再進找出不同處理間差異顯示的條帶，從膠上切割下來，并回收，再進行第二次擴增；行第二次擴增；(6)克隆差異片段，差異片段可作為探針；克隆差異片段，差異片段可作為探針；(7)Northern 雜交，驗證目的片段，去掉假陽性片段；雜交，驗證目的片段，去掉假陽性片段；(8)對目的片段進行測序；對目的片段進行測序；(9)以克隆的目的片段為探針，從基因組文庫中篩選出相應的全長基因。以克隆的目的片段為探針，從基因組文庫中篩選出相應的全長基因。技術一般步驟技術一般步驟mRNAmRNA差異顯示技術簡略流程圖差

19、異顯示技術簡略流程圖 放射性自顯影法與普通照相的曝光、顯影、定影放射性自顯影法與普通照相的曝光、顯影、定影原理相似，此法是原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射線使利用放射性同位素所放出之射線使照相乳膠照相乳膠“感光感光”，再經(jīng)顯影和定影處理，將乳膠中再經(jīng)顯影和定影處理，將乳膠中因受輻照而致敏的鹵化銀顆粒還原成金屬銀，洗去未因受輻照而致敏的鹵化銀顆粒還原成金屬銀，洗去未“感光感光”的鹵化銀后則圖像自然顯示出來。圖像中任的鹵化銀后則圖像自然顯示出來。圖像中任何區(qū)域的黑度取決于留存的金屬銀的量，它反映了射何區(qū)域的黑度取決于留存的金屬銀的量，它反映了射線在這個區(qū)域所沉積的能量。線在這個區(qū)域所沉積

20、的能量。記錄、檢查和測量整體記錄、檢查和測量整體和組織、細胞和亞細胞水平中放射性示蹤物的分布、和組織、細胞和亞細胞水平中放射性示蹤物的分布、進行定性和半定量測定進行定性和半定量測定，稱為放射自顯影法。，稱為放射自顯影法。 DDDD的優(yōu)點的優(yōu)點 以以RT-PCRRT-PCR和和DNADNA凝膠電泳凝膠電泳為基礎為基礎 靈敏度高靈敏度高，僅需，僅需0.2g0.2g的總的總RNARNA 因為從兩種或更多的特定組織樣品來源的擴增產物因為從兩種或更多的特定組織樣品來源的擴增產物在同一塊膠上鑒定，因此能用于鑒定特定組織或細在同一塊膠上鑒定，因此能用于鑒定特定組織或細胞來源樣品之間轉錄水平的胞來源樣品之間轉

21、錄水平的mRNAmRNA的的定性和定量變化定性和定量變化 可以同時檢測到可以同時檢測到“上調上調”及及“下調下調”的基因的基因 時間短時間短，實驗過程中可步步驗證比較，實驗過程中可步步驗證比較 可進行可進行多基因家族的表達分析多基因家族的表達分析 DDDD的缺的缺點點 每每種技術的誕生都不可能是完美的，種技術的誕生都不可能是完美的，mRNAmRNA差異顯示技術差異顯示技術雖然從創(chuàng)立時起就很受歡迎，但是許多研究者發(fā)現(xiàn)該技術存雖然從創(chuàng)立時起就很受歡迎，但是許多研究者發(fā)現(xiàn)該技術存在一定缺陷，其中三點較為突出：在一定缺陷，其中三點較為突出：第一第一，操作步驟多，外源，操作步驟多，外源DNADNA污染嚴

22、重而導致污染嚴重而導致假陽性率高假陽性率高，即差異片斷用即差異片斷用NorthernNorthern雜交時無陽性信號，雜交時無陽性信號，重復穩(wěn)定性較差重復穩(wěn)定性較差。據(jù)研究，這種假陽性率可高達據(jù)研究，這種假陽性率可高達7070第二第二，獲得的，獲得的差異條帶短小差異條帶短小，多為，多為300bp300bp左右，并且多為左右，并且多為33端非編碼區(qū)序列（端非編碼區(qū)序列（UTRUTR），難以直接判斷其功能和意義。），難以直接判斷其功能和意義。第三第三，必須采用放射性同位素標記反應，使得，必須采用放射性同位素標記反應，使得實驗周期長、實驗周期長、成本高、易造成同位素污染成本高、易造成同位素污染，且不

23、好回收差異片斷。，且不好回收差異片斷。（）用無酶的酶處理總，防）用無酶的酶處理總，防止污染。止污染。（）使用酶時，批號應相同，不要經(jīng)常調（）使用酶時，批號應相同，不要經(jīng)常調換。換。（）循環(huán)次數(shù)減至次，提高退火溫度，（）循環(huán)次數(shù)減至次，提高退火溫度，減少非特異性條帶。減少非特異性條帶。（）把從測序膠上切下來的條帶純化后分成兩部（）把從測序膠上切下來的條帶純化后分成兩部分，一部分用于克隆，另一部分用作探針雜交以篩分，一部分用于克隆，另一部分用作探針雜交以篩選克隆。選克隆。（）改變引物長度，如有的在（）改變引物長度，如有的在端錨定引物和端錨定引物和端各加上個堿基，帶上雙酶切位點，端各加上個堿基，帶上

24、雙酶切位點，如此可顯著提高重復性如此可顯著提高重復性改進方法改進方法三三.mRNA.mRNA差異顯示技術的實際應用差異顯示技術的實際應用 mRNA mRNA差異顯示技術現(xiàn)在已經(jīng)成功運用于差異顯示技術現(xiàn)在已經(jīng)成功運用于動物的胚動物的胚胎發(fā)育胎發(fā)育、組織分化組織分化、生長因子激活與抑制生長因子激活與抑制、細胞周期細胞周期控制控制、癌變及疾病相關基因的鑒定和克隆癌變及疾病相關基因的鑒定和克隆，在植物無，在植物無性繁殖、形態(tài)發(fā)生、次生代謝、抗逆抗病等方面被用性繁殖、形態(tài)發(fā)生、次生代謝、抗逆抗病等方面被用來進行基因的鑒定、克隆以及功能研究，并取得很好來進行基因的鑒定、克隆以及功能研究，并取得很好的結果。

25、概括起來其主要用途可以歸納為以下三點：的結果。概括起來其主要用途可以歸納為以下三點： 第一第一，尋找差異表達的基因。，尋找差異表達的基因。 第二第二，研究個體、種群或品種間轉錄水平上的遺傳變，研究個體、種群或品種間轉錄水平上的遺傳變異。異。 第三第三，鑒定經(jīng)濟動物中控制重要數(shù)量經(jīng)濟性狀位點的，鑒定經(jīng)濟動物中控制重要數(shù)量經(jīng)濟性狀位點的基因?；??；虻蔫b定與克隆基因的鑒定與克隆 差異顯示技術目前已成為鑒定和克隆基因的重要方法。差異顯示技術目前已成為鑒定和克隆基因的重要方法。等利用一對近等基因系，研究了西紅柿基因組特異區(qū)。這對近等等利用一對近等基因系，研究了西紅柿基因組特異區(qū)。這對近等基因系中有一

26、個含有抗煙草花葉病毒（）抗性基因，一基因系中有一個含有抗煙草花葉病毒（）抗性基因，一個不含。這兩個近等基因系有一個差異片段，克隆后經(jīng)個不含。這兩個近等基因系有一個差異片段，克隆后經(jīng)雜交證實是陽性克隆，并且發(fā)現(xiàn)，這個片段與抗性有密切關系。雜交證實是陽性克隆，并且發(fā)現(xiàn)，這個片段與抗性有密切關系。利用修飾的差異顯示法克隆了小麥基因族的個公認的基因，利用修飾的差異顯示法克隆了小麥基因族的個公認的基因，他認為差異顯示法在很短時間內就可以克隆基因。和他認為差異顯示法在很短時間內就可以克隆基因。和克隆了水稻的赤霉素調控基因，利用赤霉素處理水稻，一個誘導，一個克隆了水稻的赤霉素調控基因，利用赤霉素處理水稻，一

27、個誘導，一個不誘導，發(fā)現(xiàn)二者在差異顯示時，表達量相差倍，因而很容不誘導，發(fā)現(xiàn)二者在差異顯示時，表達量相差倍，因而很容易克隆了一個赤霉素調控基因。和利用差異顯示易克隆了一個赤霉素調控基因。和利用差異顯示法，分析了擬南芥對臭氧的反應。擬南芥用臭氧處理后，在根和成熟花中，法，分析了擬南芥對臭氧的反應。擬南芥用臭氧處理后，在根和成熟花中，臭氧誘導的轉錄物含量極高，是葉的倍。臭氧誘導的轉錄物含量極高，是葉的倍。序列分析證明，編碼一個蛋白多肽，其序列序列分析證明，編碼一個蛋白多肽，其序列與已知的蛋白序列基本一致，充分表明差異顯示方法是克隆基因的有效方與已知的蛋白序列基本一致，充分表明差異顯示方法是克隆基因

28、的有效方法。趙大中等比較春化過和不春化的小麥，發(fā)現(xiàn)春化的小麥有一個法。趙大中等比較春化過和不春化的小麥，發(fā)現(xiàn)春化的小麥有一個與春化相關的克隆，經(jīng)雜交和同源性分析，證與春化相關的克隆，經(jīng)雜交和同源性分析，證明是春化特異克隆片段，該克隆片段的基因對春化需求型植物明是春化特異克隆片段，該克隆片段的基因對春化需求型植物的成花誘導起重要作用。的成花誘導起重要作用。研究激素對植物發(fā)育的影響研究激素對植物發(fā)育的影響 在植物的發(fā)育過程中，激素自始至終起著作用，調控在植物的發(fā)育過程中，激素自始至終起著作用，調控著植物的器官形成、生長發(fā)育。研究其作用具有重要意義著植物的器官形成、生長發(fā)育。研究其作用具有重要意義。

29、Peters等發(fā)現(xiàn)，用玉米素處理紅葉藜的細胞時，等發(fā)現(xiàn)，用玉米素處理紅葉藜的細胞時，mRNA表達量迅速增加，從而使細胞分裂加快。表達量迅速增加，從而使細胞分裂加快。Chen等發(fā)現(xiàn)，用等發(fā)現(xiàn)，用赤霉素處理水稻幼苗，然后采用赤霉素處理水稻幼苗，然后采用mRNA差異顯示技術，處差異顯示技術，處理過的幼苗中理過的幼苗中mRNA有特異的差異帶有特異的差異帶(UBCgene)?？寺〈似??？寺〈似危l(fā)現(xiàn)此片段影響基因調控過程中的某些蛋白。瞬時表段，發(fā)現(xiàn)此片段影響基因調控過程中的某些蛋白。瞬時表達分析表明，該序列位于啟動子轉錄起始位點上游達分析表明，該序列位于啟動子轉錄起始位點上游231159堿基位置；另外

30、，還發(fā)現(xiàn)堿基位置；另外，還發(fā)現(xiàn)UBC gene可促進可促進-淀粉酶基淀粉酶基因表達，從而調節(jié)水稻幼苗發(fā)育。因表達，從而調節(jié)水稻幼苗發(fā)育。研究抗病機制研究抗病機制 植物病害每年都使農作物受到大量損失，因此提高農植物病害每年都使農作物受到大量損失，因此提高農作物的抗病能力不僅有利于減少損失，而且有利于減少農作物的抗病能力不僅有利于減少損失，而且有利于減少農藥使用和環(huán)境污染。目前研究植物抗病機理主要方法是探藥使用和環(huán)境污染。目前研究植物抗病機理主要方法是探討植物微生物的相互作用機制。討植物微生物的相互作用機制。BenitoBenito等等1818通過研通過研究西紅柿真菌病害，利用差異顯示法對抗病機理進行了探究西紅柿真菌病害，利用差異顯示法對