等位基因特異性PCR原理和應(yīng)用2015116

1、等位等位基因基因特異性特異性PCR 的的原理原理與應(yīng)用與應(yīng)用2015.1.16內(nèi)容概要內(nèi)容概要基本原理基本原理實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法臨檢項(xiàng)目臨檢項(xiàng)目KRAS、EGFR突變檢突變檢測(cè)測(cè)科研應(yīng)用科研應(yīng)用BSG位點(diǎn)分型位點(diǎn)分型等位等位基因基因特異性特異性PCRPCR的基本原理的基本原理單核苷酸多態(tài)性（單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)方法）檢測(cè)方法限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （RFLP）單鏈構(gòu)象單鏈構(gòu)象多態(tài)性多態(tài)性 （SSCP）變性高效液相色譜變性高效液相色譜 （DHPLC）異源雙鏈分析異源雙鏈分析 （HA）基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜 （MALDI-TOF M

2、S）動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交 （DASH）基因芯片法基因芯片法TaqMan探針技術(shù)探針技術(shù)焦磷酸測(cè)序法焦磷酸測(cè)序法 ？操作繁瑣操作繁瑣耗時(shí)長(zhǎng)耗時(shí)長(zhǎng)產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染靈敏度低靈敏度低儀器昂貴儀器昂貴等位基因特異性等位基因特異性PCR等位基因特異性等位基因特異性 PCR （Allele Specific-PCR，AS-PCR）又稱擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)又稱擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)PCR （Amplification Refractory Mutation System-PCR，ARMS-PCR）PCR擴(kuò)增過(guò)程中，引物從3末端開(kāi)始延伸，要求3端堿基與模板完全配對(duì)等位基因特異性等位基因特異性PCR

3、基本基本原理原理You F. M. 2008, BMC BioinformaticsTwo Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward

4、 primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR). 四引物法四引物法ARMS-PCR單管反應(yīng)凝膠電泳凝膠電泳耗時(shí)長(zhǎng)耗時(shí)長(zhǎng)開(kāi)管操作開(kāi)管操作易污染易污染缺陷：缺陷：使用熒光定量使用熒光定量PCR檢測(cè)檢測(cè)real time PCR速度快速度快閉管操作閉管操作不易污染不易污染等位基因特異性等位基因特異性PCR技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)特點(diǎn)靈敏度高靈敏度高（0.1-1%0.1-1%）操作簡(jiǎn)便操作簡(jiǎn)便周期短周期短不產(chǎn)生不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染適用樣本類型多（如（如FFPE）精確突變類型精確突變

5、類型方法建立需時(shí)較長(zhǎng)方法建立需時(shí)較長(zhǎng)僅能檢測(cè)已知突變僅能檢測(cè)已知突變適用于臨床檢驗(yàn)適用于臨床檢驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)測(cè)序法與測(cè)序法與等位基因特異性等位基因特異性PCR法比法比較較SangerSanger測(cè)序法測(cè)序法焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序ARMS敏感度敏感度10-20%5-10%1%FFPEFFPE標(biāo)本成功率標(biāo)本成功率 低低較高較高高高商用試劑盒商用試劑盒無(wú)無(wú)有有有有流程與速度流程與速度1-21-2天天2-3天天1天天數(shù)據(jù)分析要求數(shù)據(jù)分析要求高高高高低低試劑成本試劑成本低低低低略高略高儀器成本儀器成本高高高高低低等位等位基因基因特異性特異性PCR的的實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法操作流程及數(shù)據(jù)解讀操作流程及數(shù)據(jù)解讀實(shí)驗(yàn)操作

6、實(shí)驗(yàn)操作收到樣本之后：收到樣本之后：試劑盒試劑盒（以友芝友（以友芝友EGFR試劑盒為例）試劑盒為例）編號(hào)編號(hào)位點(diǎn)位點(diǎn)內(nèi)容內(nèi)容規(guī)格規(guī)格1G719XPCR緩沖液、緩沖液、G719X引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23l2S768IPCR緩沖液、緩沖液、S768I引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23l3T790MPCR緩沖液、緩沖液、T790M引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23l4L858RPCR緩沖液、緩沖液、L858R引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23l5L861QPCR緩沖液、緩沖液、L861Q引物探針

7、、內(nèi)標(biāo)、參比染料引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23l6INSPCR緩沖液、緩沖液、Ins引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23l7DELPCR緩沖液、緩沖液、Del引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23l8質(zhì)控（外控）質(zhì)控（外控） PCR緩沖液、質(zhì)控引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料緩沖液、質(zhì)控引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23l突變探針：突變探針：FAM熒光標(biāo)記；內(nèi)標(biāo)探針：熒光標(biāo)記；內(nèi)標(biāo)探針：VIC熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增擴(kuò)增ABI7500開(kāi)機(jī)，儀器自檢；開(kāi)機(jī)，儀器自檢；將準(zhǔn)備好的將準(zhǔn)備好的8連管放置在儀器樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序；連管放置在儀器樣品槽相

8、應(yīng)位置，并記錄放置順序；信號(hào)采集：信號(hào)采集：EGFR基因：基因：FAM通道；內(nèi)標(biāo)：通道；內(nèi)標(biāo)：VIC通道；通道；PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)條件： 37：10分鐘分鐘95：5分鐘分鐘95：15秒秒60：60秒秒核酸擴(kuò)增區(qū)核酸擴(kuò)增區(qū)4040循環(huán)循環(huán)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照（空白對(duì)照）陰性對(duì)照（空白對(duì)照）應(yīng)應(yīng)無(wú)無(wú)FAMFAM熒光信號(hào)產(chǎn)生，或熒光信號(hào)產(chǎn)生，或CtCt值值3838 陽(yáng)性對(duì)照（弱陽(yáng)性對(duì)照）陽(yáng)性對(duì)照（弱陽(yáng)性對(duì)照） FAMFAM通道通道CtCt值值3232，VICVIC通道通道CtCt值值3838，但可能會(huì)由于不同儀器的不同閾值設(shè)但可能會(huì)由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動(dòng)。置而

9、發(fā)生波動(dòng)。無(wú)無(wú)DNA污染污染驗(yàn)證驗(yàn)證PCR有效性有效性樣品的外控和內(nèi)控樣品的外控和內(nèi)控待測(cè)樣品的外控（待測(cè)樣品的外控（8 8號(hào)管號(hào)管FAMFAM信號(hào)曲線）應(yīng)有信號(hào)曲線）應(yīng)有FAMFAM信號(hào)信號(hào) 以友芝友試劑盒為例：以友芝友試劑盒為例：FAMFAM通道通道23Ct23Ct值值3030；待測(cè)樣品的內(nèi)控（待測(cè)樣品的內(nèi)控（1-71-7號(hào)管的號(hào)管的HEX/VIC/JOEHEX/VIC/JOE信號(hào)曲線）應(yīng)有擴(kuò)增曲線信號(hào)曲線）應(yīng)有擴(kuò)增曲線 以友芝友試劑盒為例：樣品檢測(cè)中以友芝友試劑盒為例：樣品檢測(cè)中VICVIC通道通道CtCt值值3838。Ct23：DNA加加入過(guò)量入過(guò)量30Ct38或無(wú)或無(wú)Ct值值Ct38

10、9Ct3838或無(wú)或無(wú)Ct值值Ct388Ct3838或無(wú)或無(wú)Ct值值Ct388Ct3838或無(wú)或無(wú)Ct值值Ct387Ct3838或無(wú)或無(wú)Ct值值Ct387Ct3838或無(wú)或無(wú)Ct值值Ct387Ct3838或無(wú)或無(wú)Ct值值Ct387Ct387 Ct = 突變檢測(cè)突變檢測(cè)Ct 內(nèi)控檢測(cè)內(nèi)控檢測(cè)Ct以友芝友以友芝友EGFREGFR試劑盒為例試劑盒為例臨檢項(xiàng)目臨檢項(xiàng)目KRASKRAS背景背景KRAS是一種原癌基因，長(zhǎng)約是一種原癌基因，長(zhǎng)約35kb，位于，位于12號(hào)染色體，是號(hào)染色體，是RAS基因家基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和和RAF、M

11、EK、ERK信號(hào)通路的調(diào)控；信號(hào)通路的調(diào)控；EGFR在通路中位于在通路中位于KRAS上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致酶活性，導(dǎo)致KRAS的活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo)；的活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo)；KRAS是許多惡性腫瘤的常見(jiàn)突變基因：胰腺癌（是許多惡性腫瘤的常見(jiàn)突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結(jié)直）、結(jié)直腸癌（腸癌（40%）、肺癌（）、肺癌（20%）、卵巢癌（）、卵巢癌（15%）。）。KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體（抗體（西妥昔

12、單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對(duì)西妥昔單抗無(wú)應(yīng)答，其總體生存期明顯低于突變型患者對(duì)西妥昔單抗無(wú)應(yīng)答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者野生型患者Karapetis CS, 2008, N Eng J Med結(jié)直腸癌患者檢測(cè)結(jié)直腸癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南突變相關(guān)指南歐洲藥品評(píng)估局（歐洲藥品評(píng)估局（EMEA，2008）指出：）指出：KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美

13、國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO，2009）推薦：）推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)KRAS突變，突變，如有如有KRAS12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行位突變，則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療單克隆抗體治療；美國(guó)美國(guó)FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測(cè)必須檢測(cè)KRAS基因的基因型；基因的基因型；2012年年7月月6日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè)日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè)（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；），以判斷西妥昔單抗是否有效；美國(guó)

14、國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2014）指南說(shuō)：）指南說(shuō)：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測(cè)（突變檢測(cè)（KRAS和和NRAS），至少應(yīng)檢測(cè)），至少應(yīng)檢測(cè)KRAS第二外顯子的突變情況第二外顯子的突變情況。KRAS或或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國(guó)衛(wèi)生部于中國(guó)衛(wèi)生部于2010年年10月月14日發(fā)表了結(jié)直腸癌診療規(guī)范（日發(fā)表了結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版）版） 。明確指出。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗西妥昔單抗、帕

15、尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組、帕尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組織的織的K-ras基因狀態(tài)。在晚期基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測(cè)腫瘤 K-ras 基因基因狀態(tài)，狀態(tài)，EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。KRAS突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼，如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗。發(fā)生抵抗。KRASKRA

16、S突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無(wú)癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無(wú)癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）患者（圖中紅線所示）Anderson SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Clin Oncol 非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南突變相關(guān)指南美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2009）指出，）指出，KRAS突變與非小細(xì)胞突變與非小細(xì)胞肺癌患者肺癌患者TKI抵抗有關(guān)，抵抗有關(guān)，KRAS基因測(cè)序有助于確定哪些病人適合

17、基因測(cè)序有助于確定哪些病人適合TKI治療。當(dāng)治療。當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。靶向治療。KRAS主要突變位點(diǎn)主要突變位點(diǎn)在結(jié)直腸癌中，在結(jié)直腸癌中，KRAS突變主要發(fā)生于突變主要發(fā)生于codon12 (80%)、codon13 (15-20%)、codon61和和146 (C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753S

18、192240-2257del1812370E746-A750I192235-2252AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750A192237-2251 del1512678E746-S752A192237-2254 del1812367E746-S752V192237-2250 T(complex)12384E746-S752D192238-2255 del186220L747-A750P192238-2248 GC(complex)12422L747-T751Q192238-2252 GCA(complex)1241

19、9L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750P192239-2248TTAAGAGAAG C12382L747-P753Q192239-2258CA(complex)12387L747-T751S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751P192239-2251 C(complex)12383T790M202369C T6240S768I202303

20、GT6241V769-D770insASV202307-2308 ins GCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320 ins CAC12377D770-N771insG202310-2311 ins GGT12378L858R212573TG6224L861Q212582TA6213EGFR突變與突變與EGFR-TKI藥物療效關(guān)系藥物療效關(guān)系所在外顯子所在外顯子突變類型突變類型與與EGFR-TKI療效關(guān)系療效關(guān)系18G719A(S/C)3種點(diǎn)突變種點(diǎn)突變藥敏突變藥敏突變1919種缺失突變種缺失突變藥敏突變藥敏突變20點(diǎn)突變點(diǎn)突變S768I藥敏突變藥敏突變20點(diǎn)突變點(diǎn)突變T790M耐藥突變耐藥突變*203種插入突變種插入突變耐藥突變耐藥突變*21點(diǎn)突變點(diǎn)突變L858R藥敏突變藥敏突變21點(diǎn)突變點(diǎn)突變