第二章第七節(jié)微生物限度檢查

1、第七節(jié) 微生物限度檢查主講人:劉代群壹壹 微生物限度檢查對(duì)環(huán)境和設(shè)備的要求微生物限度檢查對(duì)環(huán)境和設(shè)備的要求貳貳 微生物限度檢查的基本步驟微生物限度檢查的基本步驟叁叁 細(xì)菌真菌及酵母菌的計(jì)數(shù)細(xì)菌真菌及酵母菌的計(jì)數(shù) 肆肆 控制菌檢查控制菌檢查伍伍 結(jié)果判斷結(jié)果判斷陸陸 微生物限度標(biāo)準(zhǔn)微生物限度標(biāo)準(zhǔn) 檢查藥典規(guī)定的非規(guī)定滅菌制劑及其原料,輔料受微生物污染程度的檢查.是體現(xiàn)藥品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo),是藥品生產(chǎn)企業(yè)管理和安全性評(píng)價(jià)的重要手段和依據(jù)之一. 檢查項(xiàng)目: 細(xì)菌數(shù) 真菌數(shù) 酵母菌數(shù) 控制菌數(shù)一一 微生物限度檢查對(duì)環(huán)境和設(shè)備的要求微生物限度檢查對(duì)環(huán)境和設(shè)備的要求1.環(huán)境潔凈度10000級(jí)以下的局部潔

2、凈度在100級(jí)的單向流空氣區(qū)域,無(wú)菌操作,防止再污染.2.供試品包裝完好,未開(kāi)啟,陰涼干燥處放置.3.表面活性劑,中和劑或滅菌劑應(yīng)證明有效性及對(duì)微生物生長(zhǎng)和存活無(wú)影響.4.細(xì)菌培養(yǎng)溫度3035;真菌培養(yǎng)溫度2328;控制菌培養(yǎng)溫度3537.5.檢驗(yàn)結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml、10c 為單位報(bào)告，特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告。二二 微生物限度檢查的基本步驟微生物限度檢查的基本步驟(1）抽驗(yàn)量和檢驗(yàn)量 檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml 或c）。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g 或10ml；化學(xué)膜劑為100c；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門(mén)菌的供試品，

3、其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g 或20ml（其中10g或者10ml 用于陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)）。 隨機(jī)抽樣，抽樣量至少為檢驗(yàn)用量（2 個(gè)以上最小包裝單位）的3倍，供試品，膜劑還不得少于4 片。（二）供試液的制備供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過(guò)45，時(shí)間不得超過(guò)30分鐘。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過(guò)1 小時(shí)。常用供試液的制備方法1。一般供試品的供試液制備取供試品10g或10ml，加pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1 10 的供試液。油劑可加入適量的無(wú)菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻。水溶

4、性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。2。特殊供試品的供試液制備（1）乳膏和軟膏：取供試品5g（或5ml），加至含溶化的（溫度不超過(guò)45）5g 司盤(pán)80、3g 單硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 無(wú)菌混合物的燒杯中，用無(wú)菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45的pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1 20 的供試液。（2）油膏及栓劑取供試品10g，加至含20ml 無(wú)菌十四烷酸異丙酯和無(wú)菌玻璃珠的適宜容器中，必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖510 分鐘，萃取，靜

5、置使油水明顯分層，取其水層作為1 10 的供試液。 (3)膜劑供試品 取供試品100c，剪碎，加100ml 的pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（必要時(shí)可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1 10 的供試液。 (4)腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品10g，加pH6.8 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）至100ml，置45水浴中，振搖，使溶解，作為1 10 的供試液。(5)氣霧劑、噴霧劑供試品 取規(guī)定量供試品，置冰凍室冷凍約1 小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開(kāi)啟部位，用無(wú)菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器

6、吸出全部藥液，加至適量的pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無(wú)菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml 的供試品，再稀釋成1 10 的供試液。(6)貼膏劑供試品 取規(guī)定量供試品，去掉貼膏劑的保護(hù)層，放置在無(wú)菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無(wú)菌多孔材料（如無(wú)菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30 分鐘，制成供試液。貼膏劑也可以其他適宜的方法制備成供試液。3 具抑菌活性的供試品 當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí)，采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性后，再依法檢

7、查。常用的方法如下：培養(yǎng)基稀釋法： 取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級(jí)的供試液2ml，每1ml 供試液可等量分注多個(gè)平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml 供試液所注的平皿中生長(zhǎng)的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，計(jì)算每1ml 供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。 離心沉淀法 取一定量的供試液， 500 轉(zhuǎn)/分離心3 分鐘，取全部上清液混合，用于細(xì)菌檢查。薄膜過(guò)濾法 見(jiàn)細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下的“薄膜過(guò)濾法”。中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑

8、菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。三 細(xì)菌 真菌 酵母菌的計(jì)數(shù) 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。（一）計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證 當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌，真菌，及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌，真菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌，真菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及相關(guān)要求進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一驗(yàn)證。1 驗(yàn)證試驗(yàn)用菌種

9、菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5 代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0 代）。應(yīng)采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 0032 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培

10、養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824 小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448 小時(shí)。 培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)為50100cfu 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)57 天，加入35ml 含0.05%（v/v）聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數(shù)50100cfu 的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28可在24 小時(shí)

11、內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。 適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50100cfu，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)48 小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置2328培養(yǎng)72 小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌50100cfu，注入無(wú)菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置2328培養(yǎng)72 小時(shí)，計(jì)數(shù)。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基

12、進(jìn)行上述試驗(yàn)。3 驗(yàn)證方法 （1）試驗(yàn)組 平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液1ml 和50100cfu 試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu 試驗(yàn)菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。（2）菌液組 測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。（3）供試品對(duì)照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。（4）稀釋劑對(duì)照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度

13、。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml 供試液含50100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。（5)結(jié)果判斷 在3 次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70%，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性

14、，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。（二 ）檢查法 按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌,真菌及酵母菌菌數(shù)的測(cè)定.取驗(yàn)證的方法制備的均勻供試液,用PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1：10，1：100，1：1000等稀釋級(jí)。1 平皿計(jì)數(shù)法 （1） 在上述進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，以該稀釋級(jí)吸管，吸取該稀釋級(jí)供試液各1ml至每個(gè)直徑90mm的滅菌平皿中，或從高稀釋級(jí)至低稀釋級(jí)吸液時(shí)可用1支吸管吸供試液各1ml至每個(gè)滅菌平皿中。每一稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少注23個(gè)平皿（一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開(kāi)，右手執(zhí)吸管），注皿時(shí)，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無(wú)殘留液體，防止反流到吸管尖端部。 （2 ）陰性對(duì)照 待

15、各級(jí)稀釋液注皿完畢后，用1支1ml吸管吸取試驗(yàn)用稀釋劑（pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液）各1ml，分別注入4個(gè)平皿中。其中2個(gè)作細(xì)菌數(shù)陰性對(duì)照；另2個(gè)作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對(duì)照，如另用YPD瓊脂測(cè)定酵母菌數(shù)時(shí)，則再增加2個(gè)平皿作酵母菌數(shù)陰性對(duì)照。 （3 ）傾注培養(yǎng)基 ： 將預(yù)先配制好的細(xì)菌計(jì)數(shù)用的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)用的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（霉菌）和YPD瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）熔化，冷至約45時(shí)，傾注上述各個(gè)平皿約15ml，以順時(shí)針或反時(shí)針?lè)较蚩焖傩D(zhuǎn)平皿，使供試液或稀釋液與培養(yǎng)基混勻，蓋上陶瓦蓋，或半蓋蓋，除去冷凝水后，再移去陶瓦蓋后，蓋上平皿蓋

16、置操作平臺(tái)上待凝。在旋轉(zhuǎn)平皿時(shí)切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上。 （4 ）培養(yǎng) ：細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平板倒置于2328培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，必要時(shí)延長(zhǎng)至7天。逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。 （5） 菌落計(jì)數(shù) u 一般將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。勿漏計(jì)細(xì)小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長(zhǎng)的菌落。注意細(xì)菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之間，以及菌落與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡、油滴等的區(qū)別。必要時(shí)用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察，或挑取可疑物涂片鏡檢。 n 供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點(diǎn)計(jì)在細(xì)菌

17、、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法需按該制劑微生物品種而定，并須觀察菌落特征及染色形態(tài)。 供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后有時(shí)形成數(shù)量很多的有形物，且難與菌落相區(qū)別。為了有利于菌落計(jì)數(shù)，可在操作時(shí)將適宜稀釋級(jí)的供試液多增加注皿（12個(gè)平皿）。注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中。在計(jì)數(shù)菌落時(shí)作為對(duì)照?；蛴煤琓TC營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后該培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落為紅色，襯于白色背景上易于點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌落和區(qū)分其他有形物。有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長(zhǎng)的菌落不易辨認(rèn)和點(diǎn)計(jì)，為防止這種情況，也可用含TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿。TTC的用量應(yīng)以不抑

18、制微生物生長(zhǎng)為宜，通常使用的濃度為0.001。 u 若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重疊，肉眼可辨別時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)；若平板生長(zhǎng)有鏈狀或片狀、云霧狀菌落，菌落間無(wú)明顯界線，一條鏈、片作為一個(gè)菌落計(jì)，但若鏈、片上出現(xiàn)性狀與鏈、片狀菌落不同的可辨菌落時(shí)，仍應(yīng)分別計(jì)數(shù)，若生長(zhǎng)蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落，其外緣有若干性狀相似的單個(gè)菌落，一般不宜作為計(jì)數(shù)用。 u菌落生長(zhǎng)呈蔓延趨勢(shì)者，細(xì)菌需在24h，霉菌需在48h做初步點(diǎn)計(jì)（點(diǎn)計(jì)霉菌菌落時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)平板，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)，否則使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差）。 u在培養(yǎng)3天點(diǎn)計(jì)細(xì)菌，培養(yǎng)5天點(diǎn)計(jì)霉菌時(shí)，如菌

19、落極小，不易辨認(rèn)，細(xì)菌計(jì)數(shù)可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至5天；霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天，再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。u 對(duì)有異議的供試品以YPD培養(yǎng)基作酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，可培養(yǎng)至1周再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。 u含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)計(jì)霉菌數(shù)，YPD瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)計(jì)酵母菌數(shù)。兩者合并計(jì)數(shù)。 u在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)多的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。 （1 ）薄膜過(guò)濾法

20、主要起到富集微生物、分離去除樣品中對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生干擾的因素的作用，可以有效提高檢查結(jié)果的靈敏度和可靠性，是近年來(lái)微生物檢查領(lǐng)域中日益廣泛應(yīng)用的一種技術(shù)手段。 （2 ）薄膜過(guò)濾法采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45um。濾膜直徑一般為50mm，為便于計(jì)數(shù)，以及減輕供試液堵塞濾膜的情況，在便于操作的前提下，可以選用直徑更大的濾膜或薄膜過(guò)濾器。采用不同直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。 2 薄膜過(guò)濾法 （3 ）水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試

21、品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，以濾膜直徑為50mm的濾膜計(jì)，每張濾膜每次沖洗量不超過(guò)100ml，總沖洗量不得超過(guò)1000ml；其他直徑的濾膜及薄膜過(guò)濾器可按膜面積比例調(diào)整，總的原則是避免大體積、過(guò)高流速的沖洗造成濾膜上的微生物受損傷。 （4） 由于供試液中一些不能通過(guò)濾膜的顆粒存在，常常造成濾膜堵塞、壓力升高，嚴(yán)重情況時(shí)可能發(fā)生過(guò)濾裝置炸裂造成安全事故或?qū)嶒?yàn)室污染；也可能發(fā)生由于壓力過(guò)大濾膜開(kāi)裂或?yàn)V膜孔徑變大，造成濾膜對(duì)微生物的過(guò)濾截留失敗。所以，實(shí)際操作中應(yīng)考慮對(duì)薄膜過(guò)

22、濾中的壓力控制和設(shè)備的安全性，設(shè)置一定的安全壓力限度，例如濾膜兩側(cè)壓差不得過(guò)50psi。具體壓力限度應(yīng)根據(jù)具體薄膜過(guò)濾裝置及濾膜確定。 （5 ）采用適當(dāng)方法去除供試液中的顆粒（前提是不能影響微生物的回收率）、適當(dāng)增加薄膜面積或降低過(guò)濾液體流速可以有效降低濾膜兩側(cè)的壓力差。 （6 ）取相當(dāng)于每張濾膜含1g、1ml或10cm2供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過(guò)濾。若供試品每1g、1ml或10cm2所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液1ml，過(guò)濾。用pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜.沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡

23、萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板上時(shí)不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長(zhǎng)。 （7 ）貼膏劑宜采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)。 （8 ）陰性對(duì)照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液1ml照上述薄膜過(guò)濾法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。 （9 ）培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過(guò)100cfu。 （10） 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過(guò)濾1g、1ml或10cm2供試品），或1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù) 10.1.6 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 10.1.6.

24、1 宜選取細(xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)小于300cfu、霉菌菌落數(shù)平均數(shù)小于100cfu的平板計(jì)數(shù)作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。 10.1.6.2 當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)有2個(gè)或2個(gè)以上稀釋劑的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)值的值報(bào)告。 10.1.6.3 如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均茵落數(shù)小于1時(shí)，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)。 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則示例見(jiàn)下表2。 表2 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則示例 菌數(shù)報(bào)告 規(guī)則示例 各稀釋級(jí)（供試液1ml皿）平均菌落計(jì)數(shù)（cfu） 菌數(shù)報(bào)告數(shù) （cfug

25、，ml，10cm2） 原液 1:10（1） 1:102（2） 1:103（3） 1 64 8 2 640 2 420 64 8 6400 3 不可計(jì) 420 64 64000 4 0 0.5 0 100 5 0 0 100 6 0 0 0 10 7 0 0 0 1六 微生物限度標(biāo)準(zhǔn) 非無(wú)菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑和對(duì)患者健康潛在的危害以及中藥的特殊性而制訂的。藥品的生產(chǎn)、貯存、銷售過(guò)程中的檢驗(yàn)，中藥提取物及輔料的檢驗(yàn)，新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂，進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核，考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規(guī)定外，其微生物限度均以本標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。 1.制劑通則、品種項(xiàng)下要求無(wú)菌的制劑及標(biāo)示無(wú)菌的制劑 應(yīng)符合無(wú)

26、菌檢查法規(guī)定。 2.口服給藥制劑 2.1 不含藥材原粉的制劑 細(xì)菌數(shù) 每1g 不得過(guò)1000cfu。每1ml 不得過(guò)100cfu。霉菌和酵母菌數(shù) 每1g 或1ml 不得過(guò)100cfu。大腸埃希菌 每1g 或1ml 不得檢出。2.2 含藥材原粉的制劑細(xì)菌數(shù) 每1g 不得過(guò)10 000cfu（丸劑每1g 不得過(guò)30 000cfu）。每1ml不得過(guò)500cfu。霉菌和酵母菌數(shù) 每1g 或1ml 不得過(guò)100cfu。大腸埃希菌 每1g 或1ml 不得檢出。大腸菌群 每1g 應(yīng)小于100 個(gè)。每1ml 應(yīng)小于10 個(gè)。2.3 含豆豉、神曲等發(fā)酵原粉的制劑細(xì)菌數(shù) 每1g 不得過(guò)100000cfu。每1ml 不得過(guò)1000cfu。霉菌和酵母菌數(shù) 每1g 不得過(guò)500cfu。每1ml